罗氏沼虾细胞色素P450家族CYP302a1基因克隆及其在蜕皮周期中的表达

蜕皮是甲壳动物重要的生理活动,与其蜕皮激素的合成密切相关,细胞色素P450(CYP)302a1是甲壳动物蜕皮激素合成通路中的关键酶之一。本研究克隆了罗氏沼虾CYP302a1基因(Mr-CYP302a1),cDNA全长1859 bp,开放阅读框(ORF)为1629 bp,编码543个氨基酸(aa),分子量大小为61.09 ku,等电点为8.42。氨基酸序列分析显示CYP302a1基因的保守结构域含有5个P450基因家族特征保守区域:heme-binding、helix-K、helixC、helix-I及PERF。系统进化分析结果显示Mr-CYP302a1首先与绿虾CYP302a1聚为一支,然后与凡纳滨对虾及三疣梭子蟹等十足目甲壳动物的CYP302a1聚为一支,与甲壳动物的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测表明Mr-CYP302a1在罗氏沼虾的多个组织中均有表达,其中在Y器官中的表达量最高,性腺中次之。同时研究发现,MrCYP302a1基因在罗氏沼虾的蜕皮后期(A期和B期)表达量很低,蜕皮间期(C期)表达量开始上升,在蜕皮前期D1亚期达到峰值。对Mr-CYP302a1进行蛋白表达及多克隆抗体制备,蛋白印迹法(Western blot,WB)检测表明Mr-CYP302a1蛋白在罗氏沼虾Y器官中的表达量最高,在蜕皮过程中的蜕皮前期D1亚期达到峰值。综上所述,该基因在罗氏沼虾的蜕皮过程中扮演着十分重要的角色。     

谷氨酰胺对斜带石斑鱼GF-1细胞中C-Myc蛋白的表达与神经坏死病毒复制的影响

为探讨C-Myc表达、谷氨酰胺代谢和神经坏死病毒复制三者之间的关系,本研究首先克隆了斜带石斑鱼鳍条细胞(GF-1)中的C-Myc基因(GF-1-C-Myc),结果显示GF-1-CMyc基因cDNA全长814 bp,开放阅读框(ORF)为285 bp,编码95个氨基酸(aa),有亮氨酸拉链结构域与螺旋-环-螺旋(HLH)结构域。实验表达和纯化了GF-1-C-Myc蛋白,并制备其多克隆抗体。采用实时定量PCR技术(qRT-PCR)与免疫印迹法(WB)检测了GF-1-C-Myc基因的表达和神经坏死病毒的复制。结果显示,缺乏谷氨酰胺会同时抑制GF-1-C-Myc基因的表达和神经坏死病毒(NNV)的复制,添加谷氨酰胺可同时促进GF-1-C-Myc的表达和NNV的复制;此外,NNV感染可上调GF-1-C-Myc基因的表达,并显著消耗GF-1细胞培养液中的谷氨酰胺。研究表明,GF-1-C-Myc基因可调控宿主谷氨酰胺代谢,从而有利于神经坏死病毒的复制。本结果为防控NNV的感染提供了参考。     

流溪河保护区鱼类群落结构及其时空变动

为了解流溪河光倒刺鲃国家级水产种质资源保护区鱼类群落结构,分析不同河段、不同季节鱼类群落多样性的变化,于2017年12月-2018年10月对保护区上、中、下游的鱼类开展了每个季度一次的调查。调查结果显示,共采集鱼类57种,隶属于5目14科50属,其中鲤形目43种、鲈形目6种、鲇形目5种,合鳃鱼目2种,鳉形目1种;计算57种鱼类的相对重要性指数,结果显示,尼罗罗非鱼、越南■及鲤鱼为2017-2018年度优势种;Shannon-Wiener多样性指数、Margalef丰富度指数和Pielou均匀度指数计算结果显示,下游鱼类群落的多样性及均匀度最高,夏季鱼类群落的多样性、丰富度及均匀度最高;各监测点之间的种类相似性系数显示,保护区上中游、上下游之间鱼类种类组成为中等不相似,中下游种类组成为中等相似,春夏、春冬、夏冬及夏秋季节鱼类种类组成为中等不相似,春秋、秋冬季节为中等相似;ABC分析结果显示,春、夏及冬季鱼类群落处于稳定状态,秋季处于中度干扰状态。     

亚硝酸盐对凡纳滨对虾血细胞毒性及p53基因表达的影响

随着水产动物集约化养殖的迅猛发展,水质污染问题日益加剧,环境中亚硝酸盐的含量不断上升,成为水产养殖中诱发爆发性疾病的重要环境因子。为探讨亚硝酸盐对凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）血细胞的毒性以及 p53 mRNA 的影响,通过预试验以及前期资料获取亚硝酸盐对凡纳滨对虾的毒性效应,选取0 mg／L 对照组和20 mg／L 浓度组,用流式细胞术检测血细胞活性氧（ROS）、一氧化氮（NO）含量和非特异性酯酶活性,运用荧光定量 PCR 技术检测 p53基因表达量变化。结果显示,在亚硝酸盐应激12 h 后,对虾血细胞的 NO 含量与对照组相比有显著升高（P ＜0．05）,在应激24、48、72 h 后有极显著的升高（P ＜0．01）;ROS 含量在应激12、48、72 h 时有极显著升高（P ＜0．01）,在应激24 h 时与对照组相比有显著的升高（P ＜0．05）。非特异性酯酶活性在应激24、48、72 h 显著下降（P ＜0．05）,p53的表达水平在应激48 h 和72 h 后显著升高（P ＜0．05）。研究表明,亚硝酸盐应激诱导对虾血细胞产生了过量的 NO 和 ROS,造成氧化胁迫作用,诱导凋亡相关基因的表达,最终导致细胞凋亡。     

镉胁迫对凡纳滨对虾血细胞基因表达的影响

为探讨镉(Cd)胁迫下凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)血细胞的分子响应,以不同浓度的Cd2+(0,0.5 mg/L和5 mg/L)进行胁迫,于不同胁迫时间取血淋巴,测定血细胞中Trx 2、Grx 2、Grx 3和MGST 3的基因表达量变化。结果显示,Trx 2、Grx 3和MGST 3表达量在胁迫的中后期显著上调,Grx 2表达量在5 mg/L Cd2+胁迫6 h开始即有显著的升高,并持续至48 h。结果表明在Cd胁迫作用下,对虾血细胞中上调这四个氧化还原与抗氧化相关基因的表达水平,以进行胁迫防御;Grx 2对Cd胁迫较为敏感,在整个胁迫过程发挥作用,Trx 2、Grx 3和MGST 3主要在胁迫的中后期发挥作用;基因的表达响应具有一定浓度效应。     

JC-1标记的流式细胞术测定虾类血细胞的线粒体膜电位

以新鲜虾血细胞为阴性对照,α-羰基氰化氯苯腙处理的虾血细胞为阳性对照,建立以JC-1为荧光标记的测定虾类血细胞线粒体膜电位的流式细胞术方法.将凡纳滨对虾离体血细胞经不同浓度Cd2+ (10-9～10-3 mol/L)处理6h后,应用该方法测定血细胞线粒体膜电位的变化.结果显示10-4 mol/L和10-3 mol/L Cd2+导致血细胞线粒体膜电位显著下降,表明该浓度的Cd2+会破坏虾血细胞线粒体的功能.本研究结果也显示,应用JC-1标记的流式细胞术测定方法适用于虾类血细胞线粒体膜电位的研究.     

双波长法测定常用淀粉原料中直链淀粉、支链淀粉及总淀粉含量

建立了双波长法测定常用淀粉原料中直链淀粉、支链淀粉和总淀粉含量的方法。按照双波长测定的等吸收点作图法确定2种淀粉的测定波长和参比波长,直链淀粉的测定波长分别为630、480 nm,支链淀粉的测定波长分别为550、735 nm。结果表明,直链淀粉浓度在0~36 μg/mL、支链淀粉浓度在40~100 μg/mL范围内线性关系良好,符合比耳定律,具有较高的精确度和准确度。常用淀粉原料的总淀粉含量在66.51%~83.65%,其中绿豆淀粉和豌豆淀粉的直链淀粉含量比明显高于其他淀粉原料;糯米粉中的支链淀粉含量最高,其直链淀粉含量过低,导致吸光值太小而检测不出。     

凤凰山天池断线麦穗鱼的摄食生态研究

为了解断线麦穗鱼(Pseudorasbora interrupta)在凤凰山天池的种群生物学特征,对其基础生物学特征进行了系统研究。2016年4月-2017年3月,于凤凰山天池共采集断线麦穗鱼281尾,利用胃(肠)含物分析法,分析其摄食强度、食物组成和摄食生态位。结果表明:断线麦穗鱼的摄食强度春季最低,夏、秋季较高,春秋季节差异明显。其饵料生物包括18个类群,以硅藻门占绝对优势(IRI=79.25%),其余依据IRI大小依次为绿藻门、水生昆虫、枝角类、甲藻门等。断线麦穗鱼的食物组成呈现季节变化,除全年均占绝对优势的硅藻外,次优势类群的四季差异明显。其中春季以水生昆虫和花粉较为常见;夏季以绿藻门和甲藻门较为常见;秋季以枝角类最多;冬季则为绿藻门占优。以特定饵料丰度和出现频率作图对摄食策略分析结果表明:断线麦穗鱼属于广食性鱼类,具有较为宽广的营养生态位。     

罗氏沼虾谷氨酰胺合成酶基因的克隆与表达

谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, GS)是一种广泛分布在动植物体内的酶,并参与细胞多种代谢调控。在甲壳动物中,GS在能量代谢和渗透压调节过程中起着重要作用。实验克隆了罗氏沼虾GS基因。GS基因cDNA全长1 965 bp,开放读码框(ORF)为1 086 bp,编码361个氨基酸(aa),分子量大小为40.75 ku,等电点为5.81。进化树分析发现,罗氏沼虾GS基因与凡纳滨对虾、斑节对虾和中国明对虾GS聚为一支,氨基酸相似性达到95%。氨基酸多序列比对分析结果显示,罗氏沼虾GS属于无脊椎动物分支的GSⅡ群,有5个保守区域。实验对罗氏沼虾GS蛋白进行表达并制备了多克隆抗体。采用荧光定量PCR技术(qRT-PCR)和免疫印迹(Western blot)对罗氏沼虾蜕壳前后的不同组织GS表达进行检测。qRT-PCR结果显示,GS基因在所检测的8个组织中均有表达;蜕壳前,其相对表达量顺序为:肝胰脏肌肉胃肠鳃心脏脑血淋巴。蜕壳后和蜕壳前GS基因在组织中的差异表达比较结果显示,除了在肝胰脏表达下调外,其他7个组织都表达升高,其相对表达量的差异顺序为:脑鳃胃肠肌肉心脏血淋巴。Westernblot结果显示,蜕壳后GS蛋白在鳃和肌肉组织表达量上调,与其mRNA表达一致。此外,罗氏沼虾蜕壳后肝胰脏GS酶的活性和谷氨酰胺的含量下调,而其在鳃、肌肉和血淋巴中上调,结果与其基因表达一致。研究表明,GS基因在不同组织中表达的差异可能和罗氏沼虾的能量代谢、渗透压调节有关。