栉孔扇贝异精雌核发育四倍体早期胚胎发育的细胞学荧光显微观察

用1500μW/cm2的紫外线照射长牡蛎(Crassostrea gigas)精子60 s以进行灭活处理,并使之与栉孔扇贝(Chlamys farreri)卵子受精,在卵子受精后排出第一极体前用6-DMAP(50 mg/L)处理受精卵,持续处理35 min,抑制第一极体和第二极体的排放,诱导异精雌核发育四倍体。采用二脒基苯基吲哚(DAPI)荧光染色显微观察法,对灭活的长牡蛎精子诱导的栉孔扇贝雌核发育四倍体早期胚胎发育过程进行细胞学观察。结果表明:经紫外线灭活过的长牡蛎精子进入栉孔扇贝卵子后发生轻微膨胀;在第一次卵裂中期,精核形成一致密的染色质小体(DCB),位于两组分开的母本染色体之间,不参与核分裂;第一次卵裂结束时DCB滞留于两卵裂球的分裂沟上或进入其中一分裂球中;第二次卵裂过程中,DCB的去向与第一次卵裂时基本一致。6-DMAP处理有效地抑制了第一极体和第二极体的排出,从而使雌核四倍化。对担轮幼虫染色体倍性分析结果表明,通过本方法可以获得6.25%的四倍体幼虫。本研究还对灭活的异源长牡蛎精子诱导栉孔扇贝雌核发育四倍体过程中产生的复杂倍性、核物质分离紊乱及多精附卵现象进行了观察和分析。     

凡纳滨对虾造血激素基因全长序列分析及其克隆与表达

虾造血激素(astakine,AST)是节肢动物中具有促进造血组织细胞分化和增殖的一种细胞因子。在对白斑综合征病毒(WSSV)感染分子机制的研究中发现,WSSV的一个可能受体蛋白与AST存在特异性结合。为进一步了解WSSV感染与对虾细胞分化之间的关系,本研究应用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)结合cDNA末端快速扩增(RACE)技术,成功克隆了凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei造血激素基因(lvast)全长cDNA(GenBank登录号:HM594944),并对该基因进行了生物信息学分析。lvast全长共1846bp,含有1个372bp的开放阅读框,编码124个氨基酸,估算分子量为13.3kD。其编码的氨基酸序列包含一个前动力蛋白(Prokineticin)结构域。基因序列和氨基酸序列同源性比较表明,凡纳滨对虾造血激素(LvAST)与斑节对虾和软尾太平蝲蛄AST同源性较高,与脊椎动物的同源性较低。通过构建包含lvast基因ORF重组表达载体pBAD/gIIIA-lvast,本研究成功表达出与预期相符合的目的蛋白,为进一步研究LvAST的结构与功能提供了理论依据和实验基础。     

两种壳色虾夷扇贝的RAPD分析

采用RAPD技术对两种壳色虾夷扇贝Patinopecten yessoensis的遗传多样性和遗传结构及其分化进行研究。用筛选出的22个随机引物对白色贝和褐色贝各40个个体进行RAPD扩增,进行群体内及群体间的遗传学分析。白色贝共检测出128个多态位点,多态位点的比例为79．5％,Shannon遗传多样性指数为0．424;褐色贝共检测出127个多态位点,多态位点的比例为78．9％,Shannon遗传多样性指数为0．423。白色贝和褐色贝之间的遗传相似性指数和遗传距离为0．961和0．039,二者之间的遗传分化指数Gst为0．052,遗传分化的程度较低。结果表明,白色贝和褐色贝之间的等位基因频率、多态位点的比例和遗传多样性等的差别不明显,遗传变异主要来自于群体内。S285—1在褐色贝大部分个体中都能获得扩增片段,但在白色贝所有个体中均未见这个位点的扩增片段,推断S285—1为白色贝的特异阴性片段。     

基于gyrB基因的SYBR Green I实时定量PCR检测病原灿烂弧菌

灿烂弧菌Vibrio splendidus是多数海水养殖动物的主要致病菌,对养殖业危害较大。本研究根据灿烂弧菌gyrB基因的保守序列设计特异性引物,建立了SYBR Green I实时定量PCR检测灿烂弧菌的方法。构建含gyrB基因的重组质粒作为标准品,进行SYBR Green I实时定量PCR,在Tm为62℃时,扩增产物的熔解曲线仅有一个单特异峰,扩增所得标准曲线为y=-3.338x+37.67,相关系数为0.999,扩增效率为0.99,最低能检测到20个拷贝。实验结果表明,该检测技术具有较高的特异性、敏感性和重复性,对灿烂弧菌病的快速诊断和流行病学调查有重要意义。     

应用RFLP和DGGE技术分析工厂化养殖凡纳滨对虾肠道微生物群落特征

本研究应用PCR-RFLP(Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism)和PCR-DGGE(Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)技术,对工厂化养殖的凡纳滨对虾肠道菌群进行多样性分析。RFLP结果显示,8月样品中不同的克隆子为5个,其中以不可培养细菌(Unculturable bacteria)为主要优势菌,其次为鲁杰氏菌属菌种Ruegeria spp.和Rhodobacterales spp.。依据微生物多样性的覆盖率分析结果表明,所构建16S rDNA克隆文库的覆盖率为97.5%。10月样品中克隆子为8个,其中以不可培养细菌、芽孢杆菌属Bacillus spp.和弧菌属Vibrio spp.为主要优势菌属,其次为Photobacterium spp.和Neptunomonas spp.;所构建16S rDNA克隆文库的覆盖率为90.8%。应用DGGE分析8月和10月对虾肠道样品,菌群以不可培养细菌和弧菌属为主,其次为Streptomyces spp.、Ruegeria spp.、Enterococcus spp.和Photobacterium damselae。     

呋喃西林及其代谢物氨基脲的伏安检测方法

以石墨烯基电极为工作电极,研究了呋喃西林(NF)和氨基脲(SEM)的伏安检测方法。循环伏安(CV)扫速0.10 V/s时,在醋酸-醋酸钠缓冲溶液(pH 6.0)中NF发生不可逆氧化还原,过程受吸附控制。缓冲溶液种类、pH值、富集时间等优化情况下,NF的还原峰电流(ipc)与其浓度在20.0-80.0 nmol/L范围内呈线性关系,检测限为12.0 nmol/L(S/N=3)。CV扫速为0.10 V/s时,在pH4.1的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中SEM也发生吸附控制的不可逆氧化还原。优化条件下,SEM的氧化峰电流(ipa)与其浓度在1.3-39.9μmol/L范围内呈线性关系,检测限为0.2μmol/L。优化条件下,NF和SEM可以顺序测定,检测限分别为71.0 nmol/L和0.3μmol/L,平均回收率分别为87%和90%。应用于测定淡水渔业水样中二者残留量,得到了较满意的结果。     

半滑舌鳎含sox9基因BAC克隆的筛选及BAC-FISH定位

以本实验室构建的半滑舌鳎BAC文库为基础,通过对其进行有序混合,构建了两步PCR筛选体系;对性别决定相关的sox9基因的序列设计特异性引物,筛选获得阳性单一BAC克隆。利用BAC-FISH技术将包含sox9基因的BAC克隆定位在半滑舌鳎染色体上。结果显示,sox9基因在雌、雄半滑舌鳎的一对常染色体的长臂上分别存在两个杂交信号位点,信号稳定且特异。研究证实了该文库筛选体系的有效性;首次实现了对性别相关的sox9基因在半滑舌鳎染色体上的定位,其结果为揭示sox9基因参与鱼类性别控制的机制提供了重要基础。     

中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)“黄海3号”新品种的培育

2006年收集中国对虾“黄海1号”保种群以及海州湾、莱州湾2个野生群体为基础群体构建核心育种群,采用群体选育技术以仔虾Ⅰ期耐氨氮胁迫成活率和收获时对虾体重为选育指标,经过连续5代选育,培育出中国对虾“黄海3号”新品种。新品种耐氨氮胁迫能力强,仔虾Ⅰ期成活率较商品苗种提高21.2%,养殖成活率提高15.2%;生长速度快,收获对虾平均体重较商品苗种提高11.8%。AFLP 技术分析获得5代选育群体的平均多态位点比例分别为42.28%、40.64%、40.32%、39.95%和38.05%。研究结果显示,随着选育世代的增加,选育群体的遗传多样性呈现下降趋势,但随着选育时间的延长,世代之间的分化逐渐降低,群体的遗传结构开始趋于稳定。     

牙鲆微卫星标记的开发及多态性分析

将牙鲆基因组DNA经限制性内切酶RsaⅠ和BstUI双酶切后采用FIASCO法构建酶切片段基因组文库。共挑取269个克隆,177个为阳性克隆,阳性克隆率为65.79%。经测序后获得191条微卫星序列,其中完美型占74.35%;非完美型占14.66%;混合型占10.99%。用引物设计软件Primer Premier 5.0设计引物153对,挑选其中的50对合成并在32个野生牙鲆个体中进行扩增,共31个位点具有多态性,统计结果后使用POPGENE软件进行分析,平均等位基因个数为3.939 4,平均有效等位基因数为3.052 2,平均观测杂合度为0.650 1,平均期望杂合度为0.586 6,各引物的Hardy-Weinberg平衡指数在0.012 587~0.984 917变动。这些筛选出的多态性微卫星标记可应用于进一步的牙鲆遗传多样性分析、家系分析及遗传图谱的构建等工作中。     

投喂频率对刺参(Apostichopus japonicus)生长、体成分组成和能量收支的影响

在实验室条件下,对刺参(Apostichopus japonicus)在不同投喂频率条件下的生长、体成分组成和能量收支进行研究。实验设置4个投喂频率处理,分别每天投喂1(F1组)、2(F2组)、3(F3组)、4(F4组)次,共进行40 d。结果表明,F3组和F4组的刺参生长最快,其末体重均显著大于F1组和F2组(P0.05)。投喂频率越高,刺参的摄食量越大,F4组摄食量越高,为3.67 g/(d·ind),F3组和F4组刺参的摄食量均显著高于F1组和F2组(P0.05),但F3组和F4组没有显著差异(P0.05)。饵料转化率随投喂频率的增加而增加。其中,F4组的饵料转化率最高,为9.70%,而消化率却随投喂频率的增加而降低。投喂频率对刺参主要体成分组成影响不大。从各处理的能量收支方程来看,F1组和F2组的粪能占摄食能的比例显著低于F3组和F4组(P0.05),但占摄食能的比例均超过了50%,其呼吸能占摄食能的比例显著高于F3组和F4组。本研究表明,室内养殖刺参每天投喂3次最佳,排泄能和呼吸能较高可能是导致F1组生长不佳的主要原因。