基于GFM和GAMM模型分析对虾白斑综合征(WSSV)对黄海和东海北部水域虾类生物量的影响

虾类是海洋生态系统功能群的重要组成部分,其生物量变化受到多重因素的影响。本研究在开展黄海和东海北部水域虾类白斑综合征病毒(white spot syndrome virus, WSSV)流行病学调查的基础上,利用梯度随机森林模型(gradient random forest model, GFM)和广义加性混合模型(generalized additive mixed models, GAMM),分析了2016—2018年间黄海和东海北部水域WSSV流行对虾类生物量的影响。分子检测结果显示,调查所获取的26种虾类中,11种被检测为WSSV阳性;2016、2017和2018年WSSV阳性采样站点的比率分别为48.40%、38.75%和21.74%,虾类样品中WSSV阳性检出比率分别为16.86%、9.60%和4.80%。GFM模型分析显示,解释变量“阳性样品数的对数(ln_posi)”对响应变量“虾类生物量的对数(ln_Abu)”的重要性最高。GAMM分析中,根据赤池信息准则(Akaike information criterion, AIC)最小原则筛选出的最优模型为：ln_Abu~WSSV阳性率(P_rate)+ln_posi+经度(Long),该模型中ln_posi和P_rate是影响虾类生物量的极显著相关因子,ln_Abu随着P_rate的升高而降低。研究表明,WSSV在黄海和东海北部水域虾类中流行,推测对该海域的虾类生物量存在影响。     

口服特异性卵黄抗体对凡纳滨对虾抗WSSV感染的免疫保护效果

为探讨特异性卵黄抗体对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)抗白斑综合征病毒(white spot syndrome virus, WSSV)的免疫保护机制及效果,本研究以添加不同剂量WSSV卵黄抗体制剂(0、0.2%和0.5%)的饲料投喂凡纳滨对虾幼虾,免疫28 d后使用WSSV进行人工感染,测定感染对虾的肝胰腺免疫酶活力和免疫基因表达水平,以及感染后14 d内对虾的存活率。结果显示,WSSV感染3 d后,与未添加卵黄抗体制剂的对照组相比,0.2%免疫组对虾肝胰腺的超氧化物歧化酶(SOD)和酚氧化酶(PO)活力显著升高,酸性磷酸酶(ACP)和碱性磷酸酶(AKP)活力显著降低,热休克蛋白70基因(Hsp70)表达水平显著升高,凝集素基因(lectin)和β-1,3-葡聚糖结合蛋白–脂蛋白基因(β-GBP-HDL)表达水平显著降低;0.5%免疫组对虾肝胰腺的SOD活力显著升高,ACP和AKP活力显著降低,Hsp70基因表达水平显著升高,β-GBP-HDL基因表达水平显著降低。人工感染实验结果显示,WSSV感染14 d后,0.2%和0.5%免疫组对虾的存活率分别为48.89%和87.78%,均显著高于对照组(存活率为0),且0.5%免疫组对虾存活率显著高于0.2%免疫组。特异性卵黄抗体制剂能在一定程度上改变发病的进程,延迟对虾的发病和死亡时间,提高同期存活率。研究表明,口服特异性卵黄抗体制剂可以调节对虾肝胰腺免疫酶活力和免疫基因表达水平,显著提高凡纳滨对虾抗WSSV感染的能力。本研究为卵黄抗体抗WSSV感染机制的研究提供了参考,也为在生产上使用卵黄抗体防控WSSV感染提供了科学依据。     

杀鱼假交替单胞菌2515的抗弧菌效果及在对虾养殖中的应用

为探讨一株杀鱼假交替单胞菌 2515 Pseudoalteromonas piscicida (简称菌株 2515)在对虾养殖中的抗弧菌效果, 以鳗弧菌(Vibrio anguillarum)为指示菌, 以鳗弧菌的敏感抗生素新霉素为参比, 采用牛津杯打孔法, 比较了菌株 2515 与抗生素抗菌等效关系。设置浓度分别为 10⁴ CFU/mL、10⁵ CFU/mL、10⁶ CFU/mL、10⁷ CFU/mL 的菌株 2515 与鳗弧菌共培养, 评价了该菌对鳗弧菌的拮抗效果。将含量 10³ CFU/g、10⁵ CFU/g、10⁷ CFU/g, 及 10³ CFU/mL、 10⁵ CFU/mL、10⁷ CFU/mL 的菌株 2515 分别添加到对虾饲料和养殖水体中, 养殖凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei), 分析了菌株 2515 对水体和对虾肠道细菌总数、弧菌数及对抗副溶血弧菌效果的影响。结果显示, 相同抗鳗弧菌效果条件下菌株 2515 数量与新霉素质量存在对应关系, 与鳗弧菌混合培养时, 浓度 10⁶ CFU/mL 及 10⁷ CFU/mL 的菌株 2515 对鳗弧菌表现出强的抑菌作用。饲料中添加菌株 2515 浓度 10⁵ CFU/g 及 10⁷ CFU/g 时能够显著降低对虾肠道中的弧菌数量(P < 0.05), 提高对虾养殖的存活率。采用副溶血弧菌(V. parahaemolyticus)攻毒, 显示在饲料中添加菌株 2515 浓度为 10⁵ CFU/g 一组对虾死亡率最低, 为(43.3±5.8)%, 对副溶血弧菌的相对保护率达(53.7±6.2)%。结果表明, 在饲料和养殖水体中添加适宜浓度的菌株 2515 均能够提高凡纳滨对虾抗副溶血弧菌的能力, 降低对虾肠道内的弧菌数量。本研究结果为对虾养殖弧菌病生物防控提供了一种技术支撑。     

养殖环境及贝源溶藻弧菌MLST分型及其毒力基因、耐药性分析

溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)是近年来贝类病害中最常见的细菌性病原之一,对贝类养殖产业的健康发展构成严重威胁。本研究旨在分析不同养殖环境水体和贝类组织中,溶藻弧菌的基因变异、毒力基因、耐药性及其分布规律。对12株溶藻弧菌分离株开展多位点序列分型(multilocus sequence typing, MLST)、毒力因子以及菌株耐药性分析,结果显示,12株溶藻弧菌的序列型(sequence typing, ST)分型互不相同,7株为PubMLST数据库已经收录的ST型,5株因管家基因的等位基因位点变化而形成新的ST型,贝类养殖环境中的溶藻弧菌具有较高的遗传多样性。12株溶藻弧菌都携带tlh、fur和collagenase三种毒力基因,但均未检测到tdh、trh、toxR和tcpA毒力基因。溶藻弧菌携带毒力因子的种类和数量受地区分布等因素的影响。不同来源的溶藻弧菌均具有多重耐药特征,对青霉素和氨苄西林产生抗性。本研究表明,贝类养殖环境中的溶藻弧菌具有种群复杂、遗传多样性高的特点;不同来源菌株在毒力基因携带和耐药性方面存在较大差异。本研究通过探究不同区域内不同来源的溶藻弧菌遗传变异及耐药性差异,对贝源溶藻弧菌的有效防控提供一定理论参考。     

抗弧菌杀鱼假交替单胞菌2515的潜在毒性及热处理脱毒后抗菌效果

为评估一株具有弧菌拮抗功能的杀鱼假交替单胞菌2515 Pseudoalteromonas piscicida 2515 (以下简称"菌株2515" ) 对海水养殖动物的毒性, 并确定一种有效的热处理脱毒方法, 在中国明对虾Fenneropenaeus chinensis育苗水体中分别添加浓度为105、 106、 107...     

基于原位LAMP技术的牡蛎疱疹病毒(OsHV-1)易感宿主调查

牡蛎疱疹病毒(Ostreid herpesvirus 1, OsHV-1)给世界双壳贝类养殖业造成了严重的经济损失。10余种双壳贝类陆续被认定为易感宿主,仍有其他几种贝类仅有PCR核酸阳性数据,因确诊证据不足导致其易感性未得到充分评估。原位环介导等温核酸扩增(LAMP)检测技术相对传统原位杂交技术具有灵敏度高、方便快捷、可作为病原微生物感染证据的优点。为了在OsHV-1流行病学调查过程中实现病毒感染的快速检测和确诊,根据已报道的OsHV-1特异性LAMP检测引物,设计内引物,优化反应条件,建立了OsHV-1的原位LAMP检测方法。基于该方法对2019年以来采集的长牡蛎(Crassostrea gigas)、福建牡蛎(Crassostrea angulata)、栉孔扇贝(Chlamys farreri)、虾夷扇贝(Mizuhopecten yessoensis)、毛蚶(Scapharca subcrenata)和菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)样本进行检测。结果显示,毛蚶样本的OsHV-1原位LAMP检测结果呈阳性;其他几种贝类部分样本的实时定量PCR (qPCR)检测呈阳性,但原位LAMP检测呈阴性。对毛蚶样本的原位LAMP检测结果分析发现,病毒杂交信号主要分布在外套膜和肝胰腺等器官的结缔组织,推测感染的细胞为成纤维细胞和血淋巴细胞;在闭壳肌和斧足肌肉组织的肌细胞细胞核中也发现较多杂交信号。鳃丝内和周边偶现阳性信号,推测来自渗出的血淋巴细胞。基于原位LAMP技术的OsHV-1检测结果显示,毛蚶是OsHV-1的一种易感宿主,毛蚶结缔组织、肌肉组织和血淋巴细胞对该病毒有强亲嗜性。     

致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌(VpAHPND)自然感染三疣梭子蟹

近年来包括急性肝胰腺坏死病(AHPND)在内的多种新发疫病的流行,使我国甲壳类养殖业遭受了严重的经济损失。为了筛查导致山东潍坊某养殖场中一虾蟹混养池塘内患病三疣梭子蟹感染的可能病原,本研究采用分子生物学检测方法,对三疣梭子蟹样品进行了白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、虾血细胞虹彩病毒(SHIV)、致急性肝胰腺坏死病副溶血孤菌(Vp_(AHPND))、虾肝肠胞虫(EHP)、偷死野田村病毒(CMNV)、黄头病毒(YHV)和肝胰腺细小病毒(HPV)等8种病原的检测,并对样品进行了组织病理和原位杂交分析。分子生物学检测结果显示,患病三疣梭子蟹样品呈Vp_(AHPND)阳性,而呈现WSSV、IHHNV、SHIV、EHP、CMNV、YHV和HPV阴性。对样品进行Vp_(AHPND)套式PCR第二轮扩增产物的序列测定、比对和进化树分析,结果显示,扩增产物序列与致病副溶血弧菌质粒上pirA~(vp)毒力基因片段具有99%的同源性,该序列与已报道的多个致病副溶血弧菌PirA聚在进化树的同一主分支上。组织病理学分析显示,患病三疣梭子蟹的肝胰腺小管上皮细胞坏死,心肌纤维呈溶解样病变,鳃丝上皮柱突细胞明显坏死,胸神经节的神经细胞损伤严重,并且这些组织中还可见大量的细胞核固缩现象;原位杂交结果显示,肝胰腺、心肌、鳃组织及胸神经节中的病变部位均存在Vp_(AHPND)探针的蓝紫色杂交信号。以上表明,虾蟹混养池塘中三疣梭子蟹在自然状态下感染了Vp_(AHPND),并导致肝胰腺、心肌、鳃和胸神经节发生了严重病理损伤。本研究首次在养殖三疣梭子蟹中检测到Vp_(AHPND)感染并揭示了感染所致的病理变化,相关结果为揭示Vp_(AHPND)自然宿主种类和养殖三疣梭子蟹病害防控提供了基础信息。     

患铁虾综合征罗氏沼虾眼柄转录组研究

为探索罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)铁虾综合征(IPS)的分子机制,采用高通量测序平台(Illumina Hiseq-2500)分别对患IPS罗氏沼虾(IPS虾)和正常罗氏沼虾开展转录组测序,进行生物信息学分析。结果显示,高通量测序共获得56.42 G高质量数据,拼接后得到221 901条单基因序列(unigene),长度范围为201~30 985 bp,平均长度为1572 bp,N50长度为2867 bp,N90长度为646 bp。将单基因序列分别在Nr、Nt、Swissprot、KEGG、KOG、GO、PFAM数据库进行序列比对及功能注释,103 570条得到注释,其中,GO数据库注释到的单基因序列最多。差异表达分析显示,2003个基因在IPS虾眼柄中差异表达,包括1209个上调基因和794个下调基因,516个基因被注释到242条KEGG通路中,翻译、信号转导和免疫系统富集的差异基因数目最多。催乳素、雌激素、胰岛素、促性腺激素释放激素、胰高血糖素、催产素、谷氨酸能突触、血清素能突触等与生殖调控相关激素的代谢过程在IPS虾与正常虾眼柄之间存在差异。此外,一些已被证明在免疫反应中起重要作用的基因在IPS虾眼柄中显著上调,如血管内皮生长因子受体1、丝氨酸蛋白酶抑制剂6、C型凝集素、芳基硫酸酯酶B、酚氧化酶原激活酶2a、组织蛋白酶B、组织蛋白酶L、甲壳类抗菌肽4等。同时,注释到溶酶体、吞噬体、抗原处理与呈递、细胞凋亡、内吞作用等多条与免疫相关的途径,支持近期研究得出的罗氏沼虾IPS与病原感染相关的结论。本研究为解析罗氏沼虾IPS的成因和分子机制提供了数据支撑。     

FTA卡保存对虾传染性皮下和造血组织坏死病毒DNA洗脱方法的优化

传染性皮下和造血组织坏死病毒(infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus, IHHNV)是危害虾类健康养殖的重要病原,为寻找一种快捷保存及分离IHHNV DNA的方法,为后续研究提供完整的核酸材料,选用FTA (flinders technology associates)卡为保存介质,以FTA纯化试剂、TE (Tris-EDTA)缓冲液及去离子水为基础洗脱液,设计7种FTA卡黏附DNA洗脱方法,通过荧光定量PCR检测方法检验不同核酸洗脱分离效果及最低的点膜核酸量。结果显示,于4 mm2的FTA卡上,点样体积为2.5 μL,用洗脱液作为模板时,最低点膜核酸浓度需要1.47×104 copies/μL以上,可获得最佳的检测灵敏度和100%检出率的洗膜方法为50 μL TE缓冲液于95 ℃下浸洗5 min;用膜片做模板,点膜核酸浓度需要1.82×103 copies/μL以上,室温(20~25 ℃)条件下,用FTA纯化试剂洗脱3次,再用TE缓冲液洗脱2次,洗脱时间均为5 min,可获得最佳的检测灵敏度和100%的准确度。以FTA卡保存对虾白斑综合征病毒(white spot syndrome virus, WSSV)、虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei, EHP)、虾十足目虹彩病毒1 (Decapod iridescent virus 1, DIV1)、偷死野田村病毒(covert mortality noda virus, CMNV)、致急性肝胰腺坏死副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus, VpAHPND)核酸,测试所建洗脱方法的效果,证实了该方法对其他虾类病原核酸的洗脱具有通用性。该研究给出了FTA卡保存和洗脱IHHNV DNA的适用性方案,为野外对虾样品采集、病毒核酸样品跨区域传递的保存和运输条件提供了科学数据。     

酵母水解物对吉富罗非鱼生长、免疫力、抗氧化性及抗无乳链球菌感染的影响

本研究旨在探究饲料中添加酵母水解物对吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus)生长性能、免疫力和抗病力的影响。在基础饲料中添加0 (对照组)、0.5%、1.0%、1.5%和2.0%的酵母水解物制成5种实验饲料,对5组初始体重为(25.80±0.45) g的吉富罗非鱼进行为期8周的养殖实验,每组 3个重复,每个重复30尾鱼。实验结束后,每个重复选择12尾鱼进行无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)攻毒实验,每尾鱼腹腔注射0.2 mL浓度为8.3×105 CFU/mL的菌液,连续观察14 d,统计累积死亡率。结果显示,随着酵母水解物添加量的增加,吉富罗非鱼终末体质量(FBW)和特定生长率(SGR)均呈先显著上升(P<0.05)后下降的趋势。回归分析表明,当SGR达到最大值时,对应的酵母水解物添加量为1.29%。罗非鱼血清一氧化氮合酶、酚氧化酶、酸性磷酸酶、过氧化氢酶和超氧化物歧化酶活性均随饲料中酵母水解物添加量的提高呈先上升后下降的趋势(P<0.05),添加量为1.5%时达最大值。饲料添加酵母水解物对吉富罗非鱼无乳链球菌的抵抗力有显著影响(P<0.05),除添加量为0.5%的实验组死亡率与对照组差异不显著外,其他实验组罗非鱼的死亡率均显著低于对照组(P<0.05)。本研究中,饲料添加酵母水解物可有效提高吉富罗非鱼的生长性能、免疫力和抗病力,且在添加量为1.5%时,效果最显著。