水稻粉质皱缩胚乳突变体fse4的表型分析与基因克隆

【目的】水稻种子主要以淀粉形式储藏能量。淀粉合成需要多种酶类和调控因子参与，机制较为复杂。本研究利用水稻胚乳发育缺陷突变体，克隆和鉴定新的调控淀粉合成相关基因，旨在为研究淀粉合成及其调控提供理论依据。【方法】从化学诱变剂甲基亚硝基脲（1-methyl-1-nitroso-urea, MNU）处理的宁粳3号(Ningjing 3, WT)突变体库中筛选到一个能稳定遗传的胚乳粉质皱缩突变体，命名为fse4 (floury and shrunken 4 )。与籼稻品种Dular杂交获得F1种子（F2），通过图位克隆的策略确定FSE4候选基因。利用杂合植株（FSE4fse4）分离出的粉质种子，观察形态学特征，分析其理化性质。使用扫描电镜和半薄切片技术观察胚乳结构。使用qRT-PCR和免疫印迹分析淀粉合成相关基因表达模式和淀粉合成相关酶类的蛋白积累量。利用全自动氨基酸分析仪测定成熟胚乳各氨基酸含量。【结果】突变体fse4籽粒宽度、厚度以及千粒重显著下降，同时胚乳中总淀粉、总蛋白、直链淀粉含量亦显著下降，而脂肪含量显著上升；淀粉黏度、崩解值和消减值显著低于野生型。突变体fse4中多为单粒型淀粉颗粒，且排列分散。FSE4定位于第5染色体长臂约252 kb的区间内，测序发现编码Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶基因 （Delta 1-pyrroline-5-carboxylate synthetase, P5CS）第1外显子上发生单碱基替换，导致一保守的氨基酸发生变异。突变体fse4中大部分淀粉合成相关基因表达量下调，多种淀粉合成相关蛋白积累量减少。突变体fse4米粉中多种氨基酸含量发生显著变化，游离氨基酸含量是其野生型的3.6倍。此外，外源喷施脯氨酸能部分恢复突变体fse4种子萌发缺陷表型。【结论】FSE4编码脯氨酸合成关键限速酶P5CS，该基因对胚乳中氨基酸的合成及代谢起重要的调控作用，并影响淀粉的合成与积累。     

苏丹草与高粱染色体核型比较研究

采用去壁低渗火焰干燥法对4个苏丹草和6个高粱品种的核型进行比较研究。结果表明,苏丹草和高粱体细胞染色体数均为20(2n=20);苏丹草品种均为1A核型,并具有1对随体染色体,其中1、2号品种的第2对染色体为近中间着丝点染色体,3、4号品种为中间着丝点染色体;高粱品种除5号为1A核型、中间着丝点染色体外,其余的5个品种为2A或2B核型,且都有1或2对近中间着丝点染色体,9号品种还出现1对近顶端着丝点染色体;高粱8、9号品种各观察到1对随体染色体。染色体数量分析表明,第1到第10对染色体长短臂的绝对长度、相对长度以及绝对全长在苏丹草和高粱2类间的差异均不显著(P>0.05)。因此,苏丹草和高粱的遗传差异不在染色体长度上。     

番茄品种分子指纹的SRAP分析

[目的]利用SRAP技术对3个番茄样品进行品种鉴定。[方法]以3个番茄样品(瓯秀806、瓯秀201和一个待确认品种)的新鲜叶片为试验材料,通过改良的CTAB法提取DNA,对其进行SRAP分析并构建供试样品间的聚类树状图。[结果]利用设计的54对引物扩增出多态性位点103个,分析表明3号番茄品种确认为瓯秀806。[结论]该试验结果表明应用SRAP分析技术可以对番茄品种进行有效的鉴定。     

用于区别不同棉花品种基因组特征的微卫星位点筛选

保守性强、重复性好、多态性高的微卫星位点可被有效用于构建作物DNA条形码。选取目前生产上主要推广种植、代表不同来源系统的12个棉花品种作为微卫星位点筛选材料,参考我室构建的四倍体栽培棉种种间高密度遗传图谱信息,从376对覆盖全基因组的SSR引物中,筛选出51对引物可扩增出带型清晰且多态性高的微卫星位点。这些引物在12个供试品种中共产生155个等位位点,每对引物揭示的等位基因位点在2~7之间,平均值为3.04。参照微卫星位点的染色体定位和多态信息,在每条染色体上选择一个多态性相对高的SSR位点,其相应的26对SSR引物被推荐为构建棉花品种DNA条形码的一套首选引物,并初步应用于12个品种的DNA条形码编制。其余25对引物作为候选引物。使用该套引物扩增出的微卫星位点可用于大量棉花品种DNA条形码构建,为棉花品种真实性和纯度的分子鉴定奠定基础。     

内含子1、2对水稻pib基因启动子活性影响的转基因分析

采用pib启动子3’端缺失-GUS构建转基因分析法,将位于pib结构基因起始密码子上游、pib启动区下游的2个内含子依次敲除来研究这2个内含子对pib启动活性和暗诱导活性的影响。转基因水稻植株的荧光定量分析显示:这2个内含子及相邻pib启动子下游3’端序列缺失都不能使pib启动子丧失其启动活性和暗诱导活性,但随着内含子被敲除,不仅pib启动子的启动活性明显下降,而且其暗诱导活性也明显下降。这表明这2个内含子具有增强启动子启动活性和暗诱导活性的功能,这也说明内含子不仅能参与结构基因转录后的再剪接,一些内含子也能参与启动子启动活性和启动子内含的暗诱导元件诱导活性的调节。     

薹菜种质资源的RAPD和ISSR分析

【目的】对29份薹菜(Brassica campestris L.ssp.chinensis Makino var.tai-tsai Hort) 种质资源进行遗传多样性和亲缘关系分析,为薹菜的种质资源保护和利用奠定基础。【方法】利用优化的RAPD和ISSR标记体系,对采自山东、江苏和北京的29份薹菜品种进行DNA多态性分析,并采用类平均法对29份薹菜品种的RAPD和ISSR扩增结果进行聚类分析。【结果】从273条RAPD引物中筛选的33个RAPD引物,共扩增出了336条清晰的谱带,其中293条显示多态性,平均每个引物扩增出10.2条多态性谱带,多态性比率为87.2%。利用RAPD标记构建了29份薹菜资源的聚类树状图,距离系数为0.63～0.79。从100条ISSR引物中筛选的45个ISSR引物,共扩增出了522条清晰的谱带,其中414条显示多态性,平均每个引物扩增出9.2条多态性谱带,多态性比率为79.3%;利用ISSR标记构建了29份薹菜资源的聚类树状图,距离系数为0.70～0.86。【结论】基于RAPD和ISSR标记构建的29份薹菜品种的聚类树状图虽有一定差异,但总体趋势一致,1、20、21号薹菜与其他品种的遗传距离相对较远。     

青稞LTP蛋白基因bltl4．2的克隆及其在低温下的表达

为了解LTP蛋白基因bltl4．2在青稞中的功能,以青稞品种“昆仑12号”为实验材料,克隆得到编码该基因的eDNA序列全长470bp,其中包括249bp的开放阅读框,编码82个氨基酸残基,相对分子质量7709．8,理论p16．52,不稳定系数27．36,是一个稳定的蛋白质。LTP蛋白有2个跨膜区,1-19位置的是从膜内到膜外,57-76位置的是从膜外到膜内,总平均亲水性0．522,是一个高度亲水的小分子蛋白质。序列比对显示编码该蛋白的基因与大麦bltl4．2基因具有较高的同源性（98．9％）。通过RealtimePCR检测得到blH4．2基因在4℃下处理48、24和12h的表达量分别是0h的14．6、13．6和8．3倍,SPSS分析显示bltl4．2基因在不同低温胁迫时间下表达差异显著,说明该基因对青稞的耐寒性起到一定的作用。     

外源ABA对低温胁迫下青花菜植株生长及若干生理特性的影响

对低温胁迫下不同品种青花菜生长情况及SOD和POD酶活性进行分析,并以‘翠绿’品种为试材,研究外源ABA对植株低温胁迫的缓解作用.结果表明:(1)低温胁迫抑制株高、茎粗的增长,SOD、POD活性及可溶性糖含量显著降低;不同品种对低温胁迫的响应不同,‘翠绿’、‘蔓陀绿’品种受低温胁迫的影响较大,‘优秀,、‘DICICCO' (AU)品种受低温胁迫的影响较小.(2) 100mg· L-1脱落酸(ABA)处理对提高‘翠绿’的株高、茎粗效果显著; 50、100、150 mg·L-1 ABA处理的植株SOD、POD活性均显著高于对照(0mg·L-1ABA),其中,100 mg·L-1 ABA对SOD、POD活性的提高效果最为显著.(3)外源ABA可显著提高‘翠绿’植株可溶性糖含量,在低温处理15 d并恢复处理15 d后,50、100、150 mg· L-1 ABA处理的可溶性糖含量均显著高于对照并保持在较高水平.     

不结球白菜小孢子胚胎发生过程及发育途径研究

采用FDA荧光染色法对小孢子游离培养的发育过程进行了观察。结果表明:不结球白菜花粉母细胞减数分裂释放出的小孢子发育到单核靠边期及稍后时期染色最深、活力最强。多数游离小孢子培养经历的发育过程与合子胚相似,并且胚胎发育迅速,6～9 d产生大量球型胚,13 d开始出现子叶型胚胎。小孢子胚胎发育途径既有对称分裂并产生胚胎的途径(B途径),也有第1次不对称有丝分裂的方式;第1次不对称分裂后,既有营养细胞单独发育成胚的现象(A途径),也有营养细胞和生殖细胞共同发育成胚的现象(E途径),但未发现生殖细胞单独发育成胚的现象。     

不结球白菜雌蕊蛋白质双向电泳技术体系的建立

以不结球白菜品种‘矮脚黄’的雌蕊为材料,从蛋白质提取、IEF程序、IPG胶条pH范围和染色方法等方面进行比较,利用Tris-HCl提取方法,使用pH 4～7 IPG胶条和改进的等电聚焦程序,改良银染方法,建立了适用于不结球白菜雌蕊蛋白质的双向电泳技术体系,并使用该体系对开花前2 d的花蕾雌蕊和开花2 d后的雌蕊蛋白质进行比较分析,获得187个差异蛋白点。