转基因甘蔗BtG-2的T-DNA侧翼序列分析及其转化事件特异性检测

转基因甘蔗BtG-2是利用农杆菌介导法把Cry1Ac-2A-gna融合抗虫基因导入‘新台糖22号’的转基因甘蔗株系,具有良好的抗虫特性和农艺性状。为了明确转基因甘蔗BtG-2的分子特征及其检测方法,推进其生物安全性评价工作,以BtG-2的T2代为研究材料,利用Southern杂交检测外源基因在转基因甘蔗基因组内的拷贝数;利用染色体步移技术分离外源基因在甘蔗基因组中插入位点的侧翼序列,并建立了该转化体高效灵敏的特异性PCR检测方法。结果表明：Southern杂交检测证明外源T-DNA以单拷贝方式插入BtG-2株系;经过3次的热不对称巢式PCR扩增,获得外源基因T-DNA左边侧翼序列984 bp和右边侧翼序列705 bp;以这2个序列和相应的T-DNA的左右端序列分别设计3对检测引物对,建立了BtG-2株系的转化事件特异性PCR检测方法,扩增效率最高的引物对LS011/LA451和RS160/RA588分别扩增到440 bp和428 bp的特异片段。其中T-DNA左侧设计的LS011/LA451检测引物对扩增的灵敏度高、特异性强,能够在甘蔗BtG-2基因组DNA相对含量为0.1%的模板中检测出转基因目的成分,相当于9个单倍体基因组拷贝数。本研究完成了转基因株系BtG-2的分子特征及其转化事件特异性检测,为该转基因甘蔗及其衍生产品的检测和身份识别提供技术依据。     

双T-DNA表达载体转化大豆的研究

利用含有筛选标记基因和目的基因△6-脂肪酸脱氢酶基因的双T-DNA共转化表达载体pLIN61,经农杆菌EHA101介导,采用子叶节转化法转化大豆,使用除草剂Glufosinate作为筛选剂,获得了一批携带有玻璃苣△6-脂肪酸脱氢酶基因的转基因大豆,转化效率为2.0%,共转化频率及实际转化率分别为56.25%、1.12%.PCR检测和Southern杂交结果证明,玻璃苣D6D已经整合到大豆的基因组上.RT-PCR检测结果显示,玻璃苣△6-脂肪酸脱氢酶基因在转基因大豆的转录水平上得到了表达.     

一种快速分析香蕉果实采后mRNA水平变化的新方法

采用SMARTPCRcDNA合成与计算机软件相结合的方法,快速分析香蕉果实采后mRNA水平的变化。在28℃条件下分别将处于同株同穗同梳相邻位置的香蕉果实放置24、48、72h。应用这种方法对其总mRNA水平进行了分析,结果表明,香蕉采后48h时,与采后0h相比,mRNA水平最高。该方法由于使用了计算机软件TheScionImage,可对cDNA电泳图进行数字化分析,具有用材少,敏感性高,快捷方便等特点,特别适用于对较多样品进行分析。     

香蕉ACC氧化酶基因(MAO3)的克隆及其表达特性分析

 根据同源扩增得到香蕉(Musa acuminata) ACC氧化酶基因(MAO3) 的核心部分, 再通过3'和5'RACE扩增上、下游序列以及Genome-Walker的方法得到启动子部分, 共获得3 718 bp长度的序列。将所得结果进行聚类分析, 发现香蕉中ACC氧化酶的氨基酸序列非常保守, 各序列间的同一性高达99% ,与单子叶植物和双子叶植物中ACC氧化酶的氨基酸序列的同源性在66.7%～71.8%之间。组织原位杂交试验表明MAO3基因的表达具有组织特异性, 初步认为是在韧皮部筛管组织中特异表达。运用实时荧光定量PCR技术, 实时监测到了MAO3基因和香蕉乙烯受体基因ERS2受机械伤诱导的定量变化。     

从甜瓜子叶中提取总DNA

用分子标记方法检测甜瓜杂交种子纯度,如果从真叶中提取DNA,检测周期至少需要15d。为了缩短检测周期,我们分别以甜瓜的成熟干种子、吸胀水后“露白”种子、3d龄刚转绿子叶、6d龄子叶、9d龄子叶和12d龄子叶为材料,进行了提取总DNA的研究。结果表明:除了干种子和吸胀水后“露白”种子外,其他的材料都可以提取到DNA,但是DNA的质量因子叶日龄不同而存在很大的差异。不同日龄的子叶中,以3d龄子叶提取的DNA质量好。子叶6d龄时,提取的DNA质量次于3d龄,少量DNA开始出现降解,以后随着子叶日龄的增加,DNA降解加重。另外,与以真叶为材料提取的DNA样品相比较,子叶DNA样品中的蛋白质等杂质含量高,应增加氯仿抽提纯化次数。     

芦笋四倍体诱导、倍性鉴定及生物学特性的研究

以南方主栽品种"井岗701"二倍体芦笋的露白种子和幼苗为试材,研究了秋水仙素浓度、处理时间及浸泡时的转速对芦笋四倍体诱导效果的影响,并对四倍体和二倍体芦笋的部分抗性和形态特征进行了比较。结果表明:以0.2%的秋水仙素浸泡露白种子6h效果最好,四倍体诱导率最高,为20%,但浸泡时的不同转速对四倍体诱导影响差异不显著;而用0.3%的秋水仙素连续滴苗4d,四倍体诱导率最高为18%;浸泡露白种子法比滴苗法诱导效果好;四倍体植株较二倍体更加粗壮,在抗热性和抗旱性方面也明显优于二倍体。     

超低温技术的研究进展及其在甘蔗脱毒中的应用前景

超低温处理是以植物组织培养以及超低温保存为基础的一种新型的脱毒技术。为研究其在甘蔗脱毒中的应用前景,笔者对超低温技术在常见作物中脱毒方法及效率进行了分析,对超低温的原理、方法以及脱毒效果做了总结,对甘蔗现有的脱毒技术进行了分析。阐述了超低温技术为甘蔗脱毒工作中所提供的新的思路。