牛布鲁氏菌病、结核、炭疽、口蹄疫、病毒性腹泻黏膜病、副流感、传染性鼻气管炎可视化基因芯片检测方法的建立

针对现有牛病病原检测方法指标单一,操作复杂的现状,拟建立一种可高效检测牛布鲁氏菌病、结核、炭疽、口蹄疫、病毒性腹泻黏膜病、副流感、传染性鼻气管炎的基因芯片技术。根据已公布的各病原核酸序列,设计引物和探针。利用多重PCR方法扩增目的片段,扩增产物与探针特异性杂交,芯片反应显色后肉眼观察进行检测结果判定。优化反应条件、建立检测方法,同时对检测方法的灵敏度、可重复性、特异性、保存期等进行评价。结果显示,该基因芯片检测方法单一病原灵敏度检测可达1.0×10~(-6) ng/μL,混合病原灵敏度检测可达1.4×10~(-5) ng/μL;各病原间无交叉反应,检测健康牛血清、组织,牛流行性热病毒也均无响应;针对同一阳性质控品,芯片重复率达100%。保存期试验表明,芯片在2～8℃至少可保存6个月。检测30份临床样本,结果与标准方法结果一致。实验建立的方法具有高通量、高灵敏度、高特异性等特点,可在3 h内完成同时对七种牛重要疫病的检测,在牛群疫病诊断、净化及流行病学调查等方面有良好的应用前景。     

猪伪狂犬病毒间接ELISA抗体检测方法的建立

为了满足我国现阶段猪伪狂犬病病毒(PRV)高频突变引发新疫情诊断的需求,本实验通过生物信息学分析比较,设计合成了针对PRV g B糖蛋白高度保守的抗原优势表位区肽段,命名为g B872。以此肽段为包被抗原,经条件优化建立了新型的PRV-g B间接ELISA抗体检测方法。该ELISA方法检测结果显示,其仅对PRV血清检测为阳性,而与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒(O型)、猪细小病毒、猪圆环病毒2型等主要猪源病毒阳性血清均无交叉反应,表明该方法具有较强的特异性;最低检测下限血清稀释度为1∶128,高于IDEXX PRV/ADV g B抗体检测试剂盒检测下限稀释度(1∶4),表明该方法敏感性高;批内、批间重复性试验结果显示,变异系数均低于10%,重复性良好。利用该方法与Bio Chek PRV-g B抗体检测试剂盒检测90份临床血清样品,对比结果分析显示,两者阳性符合率为100%,阴性符合率为97.67%,总体符合率为97.78%;同时,采用该方法与IDEXX-g I(gE)和IDEXX-g B试剂盒分别对野毒感染血清和疫苗免疫血清同时检测,该方法可以准确识别野毒阳性血清和疫苗免疫阳性血清,与IDEXX两种试剂盒的结果一致。本研究建立的间接ELISA检测方法对PRV疫苗免疫效果评价、流行病学调查及防控提供了可靠的方法。     

拟南芥钾吸收调控基因AtCIPK23、AtCBL9和AtAKT1农杆菌介导共转化甘蔗

本研究通过农杆菌介导方法将拟南芥调控钾离子吸收的三个重要基因At AKT1、At CBL9和At CIPK23共转化到甘蔗品种粤糖00-236中,以期提高甘蔗耐低钾能力。PCR分析结果表明共获得36份携带At CBL9、At CIPK23和At AKT1三个基因的转基因无性系;Southern blot分析结果表明外源At CBL9基因在甘蔗基因组中的拷贝数为2~5个;在钾离子浓度为200μmol/L的营养液中进行低钾胁迫试验,转基因品系的根系和地上部的平均钾含量分别比对照高37%和23%,叶片平均相对电导率比对照低6%,说明超表达At CIPK23、At CBL9和At AKT1显著提高了甘蔗耐低钾胁迫能力,降低了因低钾胁迫造成的质膜伤害,是创制耐低钾甘蔗种质的有效途径。     

猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白诱导血管内皮细胞融合

 猪链球菌2型（SS2）主要引起人和猪的脑膜炎，但其毒力因子溶菌酶释放蛋白(MRP)对构成血脑屏障的微血管内皮细胞有何致病作用迄今不明。为此分离仔兔脾微血管内皮细胞（SMEC），纯化后用SV40-T抗原转化后用作试验的细胞模型。将单层SMEC和电泳纯MRP溶液共孵育，染色后，光镜观察，发现MRP可诱导SMEC发生两种典型形态学变化：致密细胞单层中出现巨大空洞而呈网状；空洞内有细胞融合，形成多核巨细胞，随后巨细胞核极度浓缩释出，巨细胞消失。研究结果表明， MRP单独足以破坏大脑的血管内皮细胞屏障。     

用单克隆抗体展示猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白在茵体表面的形态和分布

用猪链球菌2型江苏分离株HA9801全苗免疫BMb／c小鼠，取其脾细胞和Sp2／0细胞融合，以电泳纯溶菌酶释放蛋白(MRP)为抗原，间接ELISA筛选MRP抗体阳性孔并用有限稀释法单克隆化，剔除与胞壁杂蛋白交叉反应阳性的克隆，获得3株特异针对MRP的单克隆抗津细胞株3A3、4D5和6B4。将HA9801和HEp-2细胞共孵育，使细菌粘附于细胞表面，用3株MRP单克隆抗体联合介导FITC标记HA9801菌体表面的MRP，激光共聚焦显微观察，代表MRP的荧光图像显示，MRP是一线形表面大分子，一端锚定在细胞壁，另一端向空中伸展，其分布状态有单在和丛集2种。     

甘蔗渣栽培平菇的配方优化

以甘蔗渣为栽培主料，添加不同类型氮源栽培平菇，研究不同配方对菌丝长势、生长速度以及子实体产量和生物转化率的影响。结果表明，硝酸铵为影响平菇生物转化率的主要因素，而硫酸铵和氨基酸对其影响不明显。配方1（A1B1C1），即硝酸铵1％、硫酸铵0．5％、不添加氨基酸时，平菇菌丝长势好，生长速度快，产量高，为甘蔗渣栽培平菇的最佳组合，生物转化率为57．6％。     

新霉素阻断ELISA试剂盒的研制与应用

本研究旨在建立新霉素(Neomycin,NEO)免疫学检测试剂盒.以制备的抗NEO单克隆抗体(NEO mAb)为基础,建立阻断ELISA分析方法,组装新霉素阻断ELISA试剂盒,并对试剂盒的性能进行鉴定.结果表明,NEO试剂盒(NEO-kit)标准曲线呈典型的S型,符合4参数logit曲线拟合,相关系数R2=0.990 3;检测范围为1.0～64.0μg·L-1,半数抑制浓度(IC50)为2.59 μg·L-1,灵敏度为0.75 μg·L-1,检测限为1.0 μg·L1.试剂盒除了和NEO阳性样品反应呈阳性外,与庆大霉素、链霉素、土霉素、沙丁胺醇、环丙沙星、二氟沙星、磺胺嘧啶及磺胺甲噁唑等其他药物均无交叉反应性.奶样、饲料样及肉样的平均添加回收率为89.50%、89.58%和87.92%;平均批内和批间变异系数均小于15%,而且批间变异系数小于批内变异系数;基质对NEO-Kit的检测结果影响比较小;NEO-Kit在4℃可保存6个月以上.试剂盒和HPLC-MS-MS对牛奶中新霉素回收率没有显著差异(P≥0.05).试剂盒和HPLC-MS-MS对饲料样检测结果也无显著差异(P≥0.05).本研究成功研制出敏感、特异、准确的NEO检测试剂盒.     

猪链球菌2型MRP与FBPS部分片段串联基因的原核表达

根据猪链球菌2型(SS2)溶菌酶释放蛋白(MRP)和纤维蛋白原结合蛋白(FBPS)的基因序列,选取可能含有抗原决定簇的两片段,各设计合成一对引物,使之含有共同的酶切位点。通过T4DNA连接酶串联两片段,构建原核表达载体pET32a-mrp-fbps,重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3),经不同时间、不同温度,不同浓度IPTG诱导表达,经SDS-PAGE电泳,表达约为80kD的融合蛋白。Westernblot结果表明重组蛋白可被SS2阳性血清所识别。证实串联表达的融合蛋白具有良好的免疫原性,是重要的保护性抗原,本试验为进一步研究猪链球菌亚单位疫苗奠定了基础。     

施肥水平对甘蔗/大豆间作体系中植株 生长及养分积累的影响

采用盆栽方法研究了不同施肥水平下间作对甘蔗和大豆生长的影响以及间作优势。结果显示：间作大豆的各项植株指标与单作大豆差异不显著,不施肥可以刺激单作和间作大豆根系的生长,增加大豆根瘤数和根瘤重,而间作甘蔗各项指标大多数显著低于单作甘蔗,在不施肥的情况下下降幅度加大,但总根长两者间差异不显著;间作甘蔗的氮、磷、钾积累量均小于单作的甘蔗,以钾的降低幅度最大,而间作大豆仅在不施肥的情况下磷、钾的积累量显著低于单作大豆,氮素在四种处理间差异不显著;两种施肥水平下间作的土地当量比（LER）均大于1,说明间作有明显的优势,并且间作的氮、磷、钾总养分累积量高于单作,由此可见甘蔗与大豆间作优势不是表现在个体上,而是表现在提高土地利用率上。     

藏药甘青虎耳草总黄酮对小鼠抗炎作用的研究

目的:观察甘青虎耳草总黄酮的抗炎作用并对其机制进行初步研究。方法:采用二甲苯致小鼠耳肿胀、冰醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增高、棉球致小鼠肉芽肿模型,观察甘青虎耳草总黄酮对小鼠的抗炎作用。结果:甘青虎耳草总黄酮能显著抑制二甲苯所致小鼠耳肿胀,甘青虎耳草总黄酮低剂量组、中剂量组和高剂量组对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的抑制率分别为21.76%,65.29%和75.295%;明显抑制冰醋酸引起的小鼠腹腔毛细血管通透性增强,并且能有效抑制小鼠肉芽肿的作用。结论:甘青虎耳草总黄酮具有明显的抗炎作用。