H9和H6亚型禽流感病毒三重RT-PCR检测方法的建立

为H9与H6亚型禽流感病毒(AIV)的监测及其防控提供技术支撑,依据Genbank中H9和H6亚型AIV的HA基因及所有亚型AIV M基因的保守序列,分别设计3对特异性引物,优化退火温度和引物浓度及其配比等条件,建立并优化可同时鉴别检测H9和H6亚型AIV的三重RT-PCR检测方法,并对所建方法进行特异性、敏感性及临床样品检测验证。结果表明:三重RT-PCR反应的最佳体系为2×PCR Mix 12.5μL,H9与H6亚型AIV cDNA共2μL为模板,特异性引物M-F和M-R(20pmol/μL)加入量为0.6μL,特异性引物H9-F和H9-R(20pmol/μL)及H6-F和H6-R(20pmol/μL)的加入量分别为0.7μL和1μL,用RNA-free水补足至终体积为25μL,退火温度53℃。该方法可在一个反应管内同时鉴别检测H9与H6亚型AIV,特异性强,敏感性高,可推广应用。     

H10亚型和N8亚型禽流感病毒三重RT-PCR检测方法的建立

根据基因库中H10亚型禽流感病毒(AIV)HA基因、N8亚型AIV NA基因和所有亚型AIV M基因序列,分别设计筛选出3对特异性引物,优化引物之间的浓度,建立了H10亚型和N8亚型AIV三重RT-PCR检测方法。该法对含有H10和N8亚型AIV的模板可特异性扩增出267 bp(H10亚型AIV)、464 bp(N8亚型AIV)和693 bp(AIV)目的条带,对H10亚型AIV扩增出267、693 bp目的条带,对N8亚型AIV扩增出464、693 bp目的条带,对其他亚型AIV仅扩增出693 bp目的条带,对常见禽病病原体均未扩增出任何条带。该法对H10亚型和N8亚型AIV检测下限为10~3拷贝/μL。120份临床样品检测结果与病毒分离鉴定一致。研究建立的H10亚型和N8亚型AIV三重RT-PCR检测方法特异性强、灵敏度高,为同时快速鉴别检测H10亚型和N8亚型AIV提供一种简便、快速和有效的方法。     

H9和H10亚型禽流感病毒三重RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中H9和H10亚型禽流感病毒(AIV)的HA基因及所有亚型AIV M基因的保守序列,分别设计3对特异性引物,并优化退火温度和引物浓度及其配比等条件,建立了可同时鉴别检测H9和H10亚型AIV的三重RT-PCR检测方法。特异性实验结果表明,该方法可以特异性地扩增出H9、H10亚型AIV及M基因对应大小的目的条带,而对其余亚型AIV仅M基因出现特异性条带,其它禽病病原体均未扩增出任何特异性条带。敏感性实验结果表明,该方法对H9、H10亚型HA基因及M基因质粒的扩增下限均为5×10~4拷贝/μL。此外,该方法对临床样品的检测结果与病毒分离及测序结果完全一致。     

禽源NME/NM23核苷二磷酸激酶2(NME2)基因的克隆及表达鉴定

参照GenBank中禽源核苷二磷酸激酶2(NME2)基因序列,设计了NME2基因的特异性引物。采用RT-PCR扩增NME2基因,经双酶切后克隆到真核表达载体pEF1α-Myc,得到重组质粒pEF1α-Myc-NME2。将构建好的重组质粒pEF1α-Myc-NME2转染DF1细胞后,采用间接免疫荧光和Western blot技术对目的蛋白进行验证。结果表明,Myc-NME2融合蛋白在DF1细胞内得到了正确表达。本研究为后续研究禽源NME2基因的功能奠定了基础。     

二重荧光RT-LAMP鉴别检测禽呼肠孤病毒和鸡滑液囊支原体

本研究旨在建立一套通过添加荧光探针FD,反应后可使用成像仪直接观测结果的鉴别检测禽呼肠孤病毒(ARV)和鸡滑液囊支原体(MS)的二重荧光RT-LAMP检测方法。根据ARV和MS的保守基因片段,设计了2套LAMP引物,并各添加1条FD荧光探针,2条FD探针分别标记CY5和6-FAM荧光基团。结果：ARV阳性对照在成像仪下发出红色荧光,MS阳性对照发出绿色荧光,双重模板经过图像融合后为黄色荧光;特异性结果显示,该二重荧光RT-LAMP检测方法仅能扩增ARV和MS两种病原,对其他常见病原如鸡毒支原体(MG)、禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)等无扩增反应;敏感性结果显示,该二重荧光RT-LAMP检测方法对ARV和MS的最低检测量分别为1.7×10² copies和1.9×10² copies;使用该方法检测40份临床样品,检出率与本实验室前期建立的二重荧光RT-PCR检测结果相同。综上,该二重荧光RT-LAMP检测方法可特异、敏感地鉴别检测ARV和MS,通过添加FD荧光探针和成像仪观测结果,为不同条件的实验室提供了新的检测手段。     

微滴式数字PCR定量检测滑液囊支原体方法的建立及应用

为绝对定量滑液囊支原体（Mycoplasma synoviae,MS）,试验根据已发表的MS VlhA基因序列,针对其保守区域分别设计了1对特异引物和1条探针,建立了ddPCR定量检测MS的方法,并检测该方法的特异性、敏感性和重复性。结果显示：建立的方法最佳引物浓度为20μmol/μL,最佳探针浓度为10μmol/μL,最佳退火温度为54℃;该方法仅检测出MS毒株,不能检测出其他禽源病原,MS重组质粒标准品最低检测限为3.5拷贝/μL,3个连续稀释的MS重组质粒DNA检测的变异系数均小于5%;45份病鸡喉拭子、肺脏及关节囊样品检测结果显示,该方法的MS阳性检出率（11.1%）高于荧光定量PCR(8.9%)。结果表明,建立的ddPCR方法定量检测MS特异性强、敏感性高、重复性好,为绝对定量MS提供了适合的技术手段。     

禽呼肠孤病毒感染DF1细胞后干扰素刺激基因在转录水平表达量的动态变化

为了解干扰素（interferon,IFN）和干扰素刺激基因在禽呼肠孤病毒（ARV）感染DF1细胞后的表达情况,试验将ARV病毒感染DF1细胞,观察细胞病变,收集感染后0、6、12、24、36、48、72、96 h的细胞样品,抽提反转录成cDNA,通过实时荧光定量PCR技术检测干扰素IFN-α和IFN-β及9种禽源常见干扰素刺激基因在感染后不同时间点在转录水平表达量的动态变化规律。结果显示,在ARV感染DF1细胞后,DF1细胞出现典型的细胞病变,感染后12 h病毒开始快速增殖,在36~96 h维持在较高的水平;IFN-α和IFN-β在转录水平的表达量在感染后均表现为显著下调（P<0.05;P<0.01）;IFI6、OAS、IFIT5、ISG12在转录水平表达量变化规律相似,均呈现显著上调表达（P<0.05;P<0.01）,在感染后96 h达到峰值;其中IFIT5的上调幅度最大,感染后96 h的表达量是0 h的19.62倍（P<0.01）;而Mx、IFITM3、PKR、Viperin、ZAP的表达量变化规律相似,均表现为显著下调表达（P<0.05;P<0.01）,其中Mx、IFITM3、Viperin的下调幅度较大,PKR和ZAP下调幅度很小。说明在ARV感染DF1细胞后,干扰素及多种干扰素刺激基因在转录水平呈现规律性变化,与病毒在DF1细胞中复制存在一定的联系。结果表明,ARV感染后可以诱导多种干扰素刺激基因的表达,这些干扰素刺激基因在抵御ARV病毒的入侵,抑制ARV的复制、释放及病毒的清除中发挥着重要作用。本研究为今后深入研究ARV的致病机理和宿主的抗病毒免疫应答提供了参考。     

福寿螺绿色防控技术与应用方法

本文通过对福寿螺习性和防控技术进行全面分析,根据福寿螺季节性活动特点,提出了可操作的绿色防控技术及其应用方法。     

鸡细小病毒与禽呼肠病毒二重PCR检测方法的建立

建立可同时检测鸡细小病毒(Chicken parvovirus,ChPV)与禽呼肠病毒(Avian reovirus,ARV)的二重PCR方法,为防控ChPV与ARV提供技术支撑。根据鸡细小病毒NS1基因和禽呼肠病毒σC基因的保守序列,设计合成两对引物用于检测ChPV和ARV,通过优化二重PCR的反应体系,特异性、敏感性试验评价建立的ChPV与ARV二重PCR。优化后的二重PCR反应体系为:2×PCR Mix 12.5μL,其中ChPV与ARV的上、下游引物各1.0μL,混合模板2.0μL,ddH2O补足25μL;最佳的反应程序为:95℃5min;95℃1min,56.1℃1min,72℃1min,35个循环;最后72℃延伸10min。结果显示,建立的二重PCR能够同时扩增出204bp ChPV和405bp ARV片段;该方法对ChPV与ARV的检测敏感性分别达到58fg和53fg,但对鸡新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒、马立克病病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鸡传染性支气管炎病毒等病原体均无特异性扩增,对ChPV与ARV混合感染的临床阳性病料的检测结果与各病毒单项PCR检测结果符合率为94%以上。建立的二重PCR可用于ChPV与ARV感染的快速鉴别诊断。