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基于海口市动物基因工程重点实验室获得的牛乳状瘤病毒13型(BPV-13)基因组序列信息(GenBank登录号:KM258443.2),以基因组为模板,扩增E5基因片段,将其连入pEGFP-N1质粒,构建重组质粒pEGFP-E5-N1,测序正确后瞬时转染HEK293细胞,应用荧光显微镜、流式细胞仪、Western blotting 鉴定融合蛋白的表达。结果显示,E5片段大小为135 bp;重组质粒pEGFP-E5-N1构建正确;荧光显微镜下观察转染重组质粒pEGFP-E5-N1的HEK293细胞,可见明亮的绿色荧光;流式细胞术分析结果显示,转染重组质粒pEGFP-E5-N1 48 h后,约55.59% 的细胞表达绿色荧光蛋白;Western blotting结果表明,表达的融合蛋白大小约为32 ku。本试验结果为下一步研究E5基因的作用机理奠定了基础。 相似文献
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水牛髓样分化因子88融合蛋白真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达 总被引:1,自引:1,他引:0
将水牛髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)cDNA全长定向克隆至pEGFP-C1真核表达载体,通过酶切和测序鉴定正确后,经脂质体介导将重组质粒转染至HEK293细胞,应用荧光显微镜、流氏细胞术和Western blotting检测MyD88蛋白的表达。结果表明,酶切及测序结果证实重组质粒含有MyD88全长CDS序列,融合蛋白读码正确;荧光显微镜、流式细胞术和Western blotting检测证实,水牛EGFP-MyD88融合蛋白真核表达载体能够在HEK293细胞表达。本研究成功构建了pEGFP-C1-MyD88真核表达载体,并使其在HEK293细胞中获得表达,为进一步研究该基因的生物学功能奠定基础。 相似文献
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为了克隆五指山小型猪程序性死亡因子10(PDCD10)cDNA基因并进行生物信息学分析,试验以构建的五指山小型猪外周血白细胞cDNA文库为材料,采用菌落PCR的方法,克隆得到PDCD10全长cDNA序列,运用生物信息学软件分析其核苷酸序列并预测其编码蛋白的理化性质及二级结构等。结果表明:经比对分析发现,五指山小型猪PDCD10基因的核苷酸序列及其氨基酸序列与人、小鼠、牛、鸡、非洲爪蟾、斑马鱼、黑腹果蝇等具有较高的相似性。生物信息学分析结果表明,该cDNA序列全长1 250 bp,在序列3’末端有终止信号AATAAA。含636 bp(184~819 nt)的开放阅读框,编码212个氨基酸。该蛋白理论等电点(PI)及分子质量分别为7.80和24 701.57 u。 相似文献
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选择新霉素磷酸转移酶II(Neo^R)做为标记基因,将重组逆转录病毒载体经包装细胞馐后得到的重组病毒浓缩后,应用该重组逆转录病毒载体系统体外感染靶细胞NIH3T3以测定其滴度,其滴度可达到10^6,具有理想的感染靶细胞的能力。 相似文献
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【目的】明确海南黄牛胰岛素样生长因子2受体基因(IGF2R)遗传多态性及其在海南黄牛群体中的遗传分布情况,为进一步揭示IGF2R基因对海南黄牛生长性状的调控机理提供理论依据,也为分子标记辅助选择提供新的候选位点。【方法】构建海南黄牛DNA混池,通过PCR扩增和测序技术对海南黄牛IGF2R基因编码区(CDS)进行基因多态性分析,并以Chromas序列比对筛选出错义突变SNP位点;应用PCR-RFLP对202头海南黄牛个体进行基因型鉴定,同时对筛选到的SNP位点进行连锁不平衡及单倍型分析,评估海南黄牛群体中各单倍型的分布情况;通过生物信息学方法分析各单倍型和SNP位点对海南黄牛IGF2R基因CDS区mRNA二级结构、蛋白理化性质及蛋白二级结构的影响。【结果】在海南黄牛IGF2R基因CDS区共检测到4个错义突变SNPs位点,分别为SNP1(g.63977A>G)、SNP2(g.63999T>C)、SNP3(g.69772G>A)和SNP4(g.94987A>C),其中SNP1、SNP2和SNP3位点间呈强连锁不平衡状态。4个SNPs位点在海南黄牛群体中均表现为中度多态性,且处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)。海南黄牛群体中存在4种单倍型(F>0.01),分别是H1(ATG)、H2(GCA)、H3(ACA)和H4(GCG);各单倍型及SNP4突变型对海南黄牛IGF2R基因CDS区mRNA二级结构及其最小自由能均有影响。海南黄牛IGF2R蛋白为亲水蛋白,存在跨膜结构和信号肽,其二级结构主要由无规则卷曲和延伸链构成,α-螺旋和β-转角的占比较小。【结论】在海南黄牛IGF2R基因CDS区共检测到4个错义突变SNPs位点,在海南黄牛群体中均表现为中度多态性,且处于Hardy-Weinberg平衡状态。海南黄牛IGF2R基因SNP位点突变对其mRNA二级结构及稳定性均会造成影响,致使IGF2R蛋白二级结构肽链构象发生改变,进而对海南黄牛生长性状的调控造成影响。 相似文献