过表达谷子SiANT1对水稻耐盐性的影响

【目的】高盐胁迫是影响作物产量的主要因素之一,谷子(Setaria italica L.)具有耐逆性强的特点,从谷子中筛选耐盐基因对于利用基因工程的手段培育耐盐作物新品种具有重要意义。【方法】分析谷子AP2/ERF类转录因子类基因SiANT1在豫谷一号幼苗期在高盐、低氮、PEG模拟干旱处理条件下的表达模式;进而利用农杆菌转化法将SiANT1转入模式作物水稻品种Kitaake;分别用0.9%盐水和自来水浸泡过表达SiANT1水稻和野生型Kitaake的种子,观察其萌芽期的表型并统计发芽率;用含0.9%Na Cl的Hogland营养液室内处理水稻幼苗10 d,65℃烘48 h之后称量干重;同时将其种植在大田,在水稻孕穗前用0.9%盐水灌溉一次,统计成熟后过表达SiANT1水稻各株系和野生型的单株籽粒重、株高、单株分蘖数,对其耐盐性进行评价;利用定量Real time-PCR方法,验证分析转基因水稻株系中SiANT1及其可能的下游基因的相对表达情况。【结果】谷子SiANT1蛋白(XP004985124.1,SiANT1)属于AP2亚族,与高粱(XP021318293.1,Sb ANT1)和玉米(XP008658933.1,Zm AP2)亲缘关系较近;豫谷一号中SiANT1的表达受高盐胁迫(100 mmol·L-1 Na Cl)诱导;将SiANT1和LP0471118-Bar-ubi-EDLL载体连接,利用农杆菌转化法将SiANT1转入到水稻基因组中,筛选得阳性T0植株,繁殖两代得T3代种子;自来水浸泡下,过表达SiANT1水稻种子萌发率和野生型相差不大,萌芽率为90%以上;0.9%盐水浸泡下,过表达SiANT1水稻种子萌发明显受到抑制,与野生型相比,过表达SiANT1水稻种子露白推迟,但最终(处理120 h)萌芽率达到80%以上;室内水稻苗期用0.9%Na Cl处理后,过表达SiANT1水稻的单株干重较受体Kitaake增重14.11%—37.42%,在1%水平上呈显著差异;大田水稻成熟后过表达SiANT1株系单株籽粒重较受体Kitaake增产56.12%—76.58%,在5%水平上呈显著差异,单株分蘖数增多、株高增加,但与野生型无显著差异;半定量RT-PCR分析表明,过表达SiANT1的3个水稻株系都在RNA水平上表达SiANT1;定量Real time-PCR结果表明,过表达SiANT1的3个水稻株系间SiANT1的相对表达量有所差异,但较受体而言,都极显著增加,并且其内源耐盐相关基因Os SOS1和Os ZFP182的相对表达量分别较受体提高1.1—1.7倍和1.6—2.3倍。【结论】Os SOS1和Os ZFP182是耐盐相关基因已被证实,SiANT1具有一定的耐盐性,过表达SiANT1水稻可能是通过增加下游基因Os SOS1和Os ZFP182的表达从而提高耐盐性。     

六倍体小黑麦萌发期抗旱性分析

利用20%PEG-6000(-0.975 MPa)为渗透介质室内模拟干旱,分析六倍体小黑麦萌发期发芽率、发芽势、胚芽鞘长、根长、根数的变化,采用模糊隶属函数与抗旱系数相结合的方法对品种萌发期的抗旱性进行综合分析,并利用灰色关联分析法分析各个形态指标与抗旱性的关系,结果表明:干旱胁迫下,小黑麦各品种的发芽率、发芽势、胚芽鞘长、根长都比对照不同程度地降低或缩短,不同品种之间的差异达显著或极显著水平,但根数却增减不一,表明根数对水分胁迫的反应方向不一致;品种"Tornado"(S9)萌发期综合抗旱性强,为小麦抗旱育种提供了种质资源;发芽率与六倍体小黑麦萌发期抗旱性的关联度最大,可作为形态指标加以利用。     

不同水分条件下小麦持绿相关性状与产量的关系

雨养和灌溉2种水分条件下,观测小麦旱选10号/鲁麦14 DH群体花后不同时期旗叶的功能绿叶面积(GLAD)和主茎绿叶数(GLNMS),并利用非线性回归分析计算小麦旗叶最大衰老速率(MRS)、衰老起始时间(Ts)、达到最大衰老速率的时间(TMRS)、衰老终止时间(To)、最大衰老速率时GLAD的百分比(PGMS)、花后0 d到旗叶保持3/4绿叶面积的天数(75%G)、花后0 d到旗叶保持1/4绿叶面积的天数(25%G)和75%G与25%G之间的天数(50%G);成熟后测定单株产量(YPP)和千粒质量(TKW),然后进行性状间的相关分析。结果表明,2种水分条件下,DAA22(花后22 d),DAA25(花后25 d),DAA28(花后28 d)和DAA31(花后31 d)的旗叶GLAD均与DAA20(花后20 d),DAA22和DAA30(花后30 d)的GLNMS呈显著或极显著正相关,与MRS呈极显著负相关,与Ts,To,PGMS,TMRS,75%G,50%G和25%G呈显著或极显著正相关。GLNMS在开花后的不同时期与Ts,To,TMRS,75%G和25%G呈显著或极显著正相关,与50%G和PGMS的相关性不显著;DAA20,DAA25和DAA30的GLNMS与MRS呈显著或极显著负相关。干旱胁迫条件下,DAA16(花后16 d),DAA19(花后19 d),DAA22,DAA25,DAA28的GLAD以及灌溉条件下DAA16,DAA19,DAA22的GLAD均与千粒质量呈显著或极显著正相关,表明灌浆中期的GLAD对千粒质量影响较大。2种水分条件下,单株产量和千粒质量与50%G和Ts呈显著或极显著正相关,与MRS呈显著或极显著负相关,表明Ts与MRS是影响小麦产量的2个最主要的特征性状。育种实践中应该选育衰老起始晚、功能绿叶面积大、衰老缓慢即最大衰老速率较小的品种。     

棉花[(亚×比)×(陆×褐)]种间杂种的研究

对 [(亚洲棉×比克氏棉 )× (陆地棉×黄褐棉 ) ]种间杂种的形态性状和细胞学进行了研究。结果表明 ,四元杂种F1的叶片性状主要受父本的影响 ,苞叶与萼片属中间类型 ,花部变异最大 ,既受父本的影响 ,也受母本的影响。四元杂种F1在减数分裂时 ,染色体配对极不正常 ,大多以单价体的形式存在 ,且分裂不同步 ,最终导致形成的四分孢子不正常或形成多分孢子 ,这是四元杂种F1不育的主要原因。     

棉花四元杂种F1不育性的研究

对四元杂种 [(亚洲棉×比克氏棉 )× (陆地棉×夏威夷棉 ) ]F1的形态性状、花粉母细胞减数分裂情况进行研究 ,结果表明 ,F1变异最大的是花 ,遗传了比克氏棉的红花基部有紫红大斑的性状。花粉母细胞在减数分裂时 ,大多染色体不能联会配对 ,而以单价体的形式存在 ,并且染色体在后期 向两极分开的时候 ,形成了染色体“桥”。末期 形成的 4分孢子数占 1 9.58%,其中 4个基本一样大的仅占 6.2 9%,因而形成的花粉粒大多没有生活力 ,这是四元杂种不育的主要原因     

蚂蚱麦和小白麦衍生系的遗传多样性分析

陕西关中蚂蚱麦和山西平遥小白麦是我国北方小麦品种的原始骨干亲本,解析蚂蚱麦和小白麦及其衍生系的遗传多样性对于小麦品种改良具有重要的参考意义。本研究利用小麦660KSNP芯片对蚂蚱麦、小白麦及其衍生品种(系)进行全基因组扫描,分析其遗传多样性。结果表明,小麦3个基因组的多态性SNP标记数为BAD,第4同源群的多态性标记数最少, 149份供试材料基因多样性(H)范围为0.095～0.500,平均值为0.336;核苷酸多样性指数(π)范围为0.272～0.435,平均值为0.340;而遗传相似系数(GS)变幅为0.335～0.997,平均值达0.619,表明蚂蚱麦和小白麦衍生系的遗传多样性较低。聚类分析表明蚂蚱麦和小白麦紧密地聚在亚群I,其衍生品种(系)分为5个亚群,其中2000年以前以蚂蚱麦或小白麦的单一衍生系为主,分在亚群I、II、III, 2000年以后多数品种同时拥有蚂蚱麦和小白麦血缘,分在亚群IV、V,遗传多样性较高,且与大面积推广品种聚为一类。因此,应加强优异基因资源导入,拓宽小麦品种的遗传基础,最终提高育种水平。     

采用优化的数字PCR方法分析转基因小麦外源基因拷贝数

【目的】 探索基于数字PCR的小麦基因拷贝数分析技术,提高目标基因拷贝数的分析通量,促进小麦基因组研究及基因工程研究。【方法】 采用中国农业科学院作物科学研究所小麦抗逆分子育种课题组创制的高抗小麦黄花叶病转nib8小麦为试验材料,使用小麦D基因组中的单拷贝纯合内源基因PINb-D1b（籽粒硬度基因）为内参基因,根据转化的抗病基因nib8序列设计4对特异性引物及相应探针,通过试验确定探针和引物的最优浓度,优化体系的退火温度,寻找最合适的模板浓度。然后用数字PCR检测转nib8小麦中外源基因的拷贝数;同时用Real-time PCR和Southern blot 2种不同方法分析的拷贝数结果,验证上述采用数字PCR方法分析拷贝数的准确性;以PINb-D1b内参基因检测Wx012（蜡质基因）和SSII（淀粉合成基因）2个内参基因的拷贝数,以Wx012和SSII为内参基因检测转nib8小麦中外源基因的拷贝数,验证以PINb-D1b内参基因的检测结果准确性;在nib8的不同区段设计特异性引物来检测转nib8株系拷贝数分析结果是否有差异。最终,建立基于数字PCR技术的高通量检测小麦目标基因拷贝数的分析方法。【结果】 通过试验最终确定了基于数字PCR方法的小麦目标基因拷贝数的检测体系。试验确定引物和探针的最佳终浓度分别为500和250 nmol·L^-1,确定体系反应最佳退火温度为59℃,最佳DNA模板量为40 ng。以PINb-D1b作为内参基因检测转nib8小麦中nib8的拷贝数,拷贝数检测结果显示第12、16、17、23、29、30株系中nib8拷贝数分别为7个、1个、1个、1个、1个、7个;同时通过比较发现此结果与Real-time PCR以及Southern blot结果一致;在转基因株系中,以PINb-D1b为内参基因,对Wx012和SSII 2个基因进行拷贝数进行分析,同时发现采用这3种内参基因分析转nib8小麦中nib8基因拷贝数的结果一致,说明这3个内参基因都适合用于数字PCR方法;在nib8上游、中游和下游不同区段的设计引物分析拷贝数检测结果一致。【结论】 优化了基于数字PCR方法的小麦目标基因拷贝数分析方法和反应体系,确立了基于数字PCR方法的小麦目标基因拷贝数的检测体系,数字PCR分析结果稳定、可靠,检测通量明显提高,具有一定的应用前景。     

小麦抽穗期和开花期性状的全基因组关联分析

为揭示控制小麦抽穗期和开花期性状的遗传位点,利用均匀分布在21条染色体上的106对SSR标记,对205份小麦品种构成的自然群体进行关联分析。结果表明,在106对SSR标记中共检测到879个等位变异,主要等位变异频率的变化范围为0.175~0.986,平均为0.548;多态性信息指数的变化范围为0.028~0.900,平均为0.557。采用混合线性模型共检测到7个与抽穗期和开花期显著关联（P<0.01）的位点,其中1个存在极显著关联（P<0.001）。另外,Xgwm182（5D）在灌溉条件下与抽穗期显著关联,Xbarc42（3D）在雨养条件下分别与抽穗期和开花期显著关联,这两个位点与前人的研究结果一致。Xgwm102（2D）在灌溉条件下与开花期显著关联,而Xgwm124（1B）在雨养条件下与抽穗期显著关联。Xgwm130（7A）在雨养和灌溉条件下均与抽穗期相关联。研究结果为小麦抽穗期和开花期性状的分子标记辅助选择育种提供了信息。     

小麦响应干旱胁迫环状RNA的鉴定

目的 干旱是限制全球小麦生产的主要非生物胁迫之一,探索小麦应对干旱的分子调控机制对小麦分子育种具有重要意义。环状RNA（circRNA）已被证实在植物抵御外界环境胁迫的过程中扮演着重要角色。鉴定小麦响应干旱胁迫的circRNA,有助于构建小麦干旱胁迫响应的调控网络,为解析小麦的抗旱性机制奠定基础。方法 以2个抗旱性差异显著的小麦品种（周麦13和冀麦38）为试验材料,对其在干旱及对照条件下的根部样本进行circRNA测序。鉴定小麦circRNA并对其进行特征分析,筛选与干旱胁迫响应相关的差异表达circRNA,并对其靶向microRNA（miRNA）进行预测。进一步根据miRNA及其靶基因在干旱胁迫下的表达模式,构建小麦响应干旱胁迫的潜在circRNA-miRNA-mRNA调控模块。结果 共鉴定获得1 409个小麦circRNA,其中,多数（68.91%）为外显子circRNA,且仅有133个circRNA在2个品种中被同时鉴定获得。在干旱胁迫下共鉴定获得239个差异表达circRNA,其中138个circRNA在抗旱型品种周麦13（ZM13）中特异性差异表达,19个circRNA在2个品种中同时差异表达。共预测到34个靶向miRNA以及1 408个miRNA靶基因。根据这些差异表达circRNA、靶向miRNA以及miRNA靶基因在干旱胁迫后的表达模式,共筛选出5个分别以tae-miR9664-3p、tae-miR1122b-3p、tae-miR9662a-3p、tae-miR6197-5p和tae-miR1120c-5p为中心的小麦响应干旱胁迫的潜在circRNA-miRNA-mRNA调控模块。结论 小麦circRNA具有明显的品种特异性,且在不同抗旱型小麦品种之间具有不同的表达模式。共鉴定到239个响应干旱胁迫的小麦circRNA以及5个潜在的circRNA-miRNA-mRNA调控模块。     

渗透胁迫对六倍体小黑麦幼苗叶片相对含水量的影响

利用不同浓度的PEG-6000(0、10%、20%、30%、40%)胁迫处理,不同品种的六倍体小黑麦幼苗叶片相对含水量都有所下降。在低浓度胁迫下,下降缓慢,随着浓度的提高,下降程度逐渐增强;不同品种对PEG-6000胁迫响应不同,随着胁迫浓度的提高,品种S6、S7、S9幼苗叶片相对含水量下降幅度较小,而S1、S5、S8、S10下降幅度较大;另一方面,在30%PEG-6000溶液胁迫处理下,随着时间的延长,不同品种的六倍体小黑麦幼苗叶片相对含水量逐渐下降,品种S4、S5、S6、S7、S9下降幅度较小,而品种S8、S3下降幅度较大。综合分析发现小黑麦品种S6、S7、S9在不同浓度的PEG-6000胁迫下和同一浓度不同的胁迫时间叶片相对含水量都高,即保水能力强,因而抗旱性较强;而S8相反。