鸡毒支原体弱毒F株与强毒株二重荧光定量PCR鉴别检测方法的建立

研究根据基因库中鸡毒支原体(MG)S6毒株和F株的基因保守序列,设计了2对特异性引物和2条用不同荧光基团标记的TaqMan探针,对反应条件和试剂浓度进行优化,建立能鉴别鸡毒支原体(MG)强、弱毒株的二重荧光定量PCR检测方法,与其它禽类呼吸道病原体无交叉反应,对MG模板的灵敏度检测限为10拷贝/μL,对MG强弱毒模板以不同的浓度进行组合,仍可有效地检测到毒株,批内和批间重复变异系数小,特异性强、灵敏度高、稳定性好。研究建立的二重荧光定量PCR方法可用于MG强、弱毒株的鉴别检测,为该病的防控与净化提供良好工具。     

鸭新城疫病毒和鸭圆环病毒二重PCR检测方法的建立

本研究根据GenBank中鸭新城疫病毒(NDV)的F基因和鸭圆环病毒(DuCV)的V1/rep基因的保守序列,各设计一对特异性引物,并对二重PCR的扩增条件进行优化,建立了鸭NDV和DuCV的二重PCR检测方法。对混合样品进行扩增,得到2条大小为493bp(鸭NDV)和218bp(DuCV)的特异性条带,与预扩增片段相符。而对番鸭细小病毒、鸭瘟病毒、鸭肝炎病毒、鸭源小鹅瘟病毒、鸭H9亚型流感病毒、鸭疫里氏杆菌、大肠杆菌、禽多杀性巴氏杆菌等病原检测,结果为阴性。该方法的敏感性试验表明,鸭NDV的核酸最小量为40fg,DuCV为20fg。     

鸡毒支原体强弱毒株荧光定量PCR鉴别检测方法的建立

为建立一种能鉴别鸡毒支原体(MG)强、弱毒株的快速检测方法,本研究根据GenBank中MG强毒株和弱毒株的基因组序列,选取特异性保守区序列设计了2对引物和2奈探针,分别用于强弱毒株和弱毒株的检测,优化反应条件,建立了能区分MG强、弱毒株的荧光定量PCR检测方法.该法特异性强,对鸡常见呼吸道病原体的反应均为阴性;灵敏度高,可检测到100拷贝/μL的模板;稳定性好,批内和批间试验Ct值的变异系数小.本研究建立的MG强、弱毒鉴别检测方法简便、快捷,为该病的防控与净化提供新方法、新思路.     

三种对虾病毒多重实时荧光PCR检测方法的建立

根据基因库中白斑综合征病毒（WSSV）、传染性皮下及造血器官坏死病毒（IHHNV）和桃拉综合征病毒（TSV）的基因序列,设计了WSSV 、IHHNV和TSV的三对特异性引物和三条用不同荧光基团标记的TaqMan探针。对反应条件和试剂浓度进行优化,建立了能够同时检测WSSV 、IHHNV和TSV的三重实时荧光PCR方法。该方法特异性好,对WSSV 、IHHNV和TSV的检测敏感性分别达到20000、20和20000个模板拷贝数;此外抗干扰能力强,对WSSV 、IHHNV和TSV不同模板浓度进行组合,仍可有效地同时检测这三个病毒。对保存的45份经常规PCR检测仅为WSSV 、IHHNV和TSV阳性的样品进行二重实时荧光PCR检测,结果都为阳性,其中2份为WSSV和IHHNV混合感染。本研究建立的三重实时荧光PCR方法用于WSSV、IHHNV和TSV的检测具有特异、敏感、快速、定量等优点。     

牛支原体和牛病毒性腹泻病毒二重二温式PCR检测方法的建立

为建立一种牛支原体(Mycoplasma bovis,MB)和牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)的快速鉴别诊断方法,针对MB的uvr C基因和BVDV的5'端非编码区(5'-UTR)保守基因序列,分别设计两对特异引物,并将三温式PCR扩增程序简化为二个温度梯度,建立了鉴别MB和BVDV的二重二温式PCR方法。该方法能同时扩增MB和BVDV,扩增产物大小分别为412和170 bp。特异性试验结果显示,该方法对参试的所有毒株只扩增MB和BVDV基因组,对其它牛病原体无扩增;敏感性试验结果显示,该方法最低能同时检测到104拷贝的两种目的核酸;干扰性试验结果显示,该方法能同时检测两个模板不同浓度的组合,试验结果不受模板影响。综上,本研究所建立的二重二温式PCR方法特异、敏感、快速、简便,可应用于MB和BVDV临床鉴别诊断和流行病学调查。     

南方不同季节育雏鸡舍主要环境因子的变化研究

试验以有窗封闭式笼养育雏鸡舍为对象,于2018年3月~2019年1月开展研究鸡舍内环境的温度、相对湿度、二氧化碳(CO2)、氨气(NH3)、硫化氢(H2S)、二氧化硫(SO2)浓度和细菌总数,并分析环境因子之间的关系。结果显示:不同季节育雏舍内环境温度满足鸡群正常需要,鸡群成活率超过97%。夏季舍内相对湿度达82.48%,并且料肉比高于春季、秋季和冬季。春季、秋季和冬季CO2浓度易超标,不同季节舍内白天温度均高于夜晚,而白天CO2浓度低于夜晚。不同季节舍内环境温度分别与相对湿度、CO2浓度呈负相关和正相关关系。试验表明:有窗封闭式育雏鸡舍内不同季节雏鸡生长发育良好,但夏季湿度过高,春季、秋季和冬季舍内CO2浓度高于标准。建议夏季应合理控制舍内相对湿度,春秋冬季注意平衡舍内的保暖和通风工作。     

H9亚型禽流感病毒和鸭坦布苏病毒二重PCR检测方法的建立

本试验旨在建立一种能同时快速检测H9亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)和鸭坦布苏病毒(duck Tembusu virus,DTMUV)的二重PCR检测方法。根据GenBank中H9亚型 AIV的HA基因和DTMUV的NS2基因序列,分别设计了1对针对H9亚型AIV和DTMUV保守基因序列的引物。利用这2对引物对混有H9亚型AIV和DTMUV的cDNA模板进行二重PCR扩增,得到了2个大小与试验设计相符的特异性扩增条带。利用本试验建立的二重PCR对其他鸭病病原体进行PCR扩增,结果均为阴性。利用这2对引物对H9亚型AIV和DTMUV进行敏感性检测,结果显示最低检测极限分别为6.3和 6.6 pg。对临床235份样品检测的结果表明该二重PCR检测方法具有快速、敏感、特异等优点,适用于临床检测的应用。     

应用RT-PCR检测人工感染鸡体内禽呼肠孤病毒的动态分布

应用一步法反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测禽呼肠孤病毒(ARV)在人工感染SPF雏鸡体内的动态分布情况。结果3日龄感染ARVS1133毒株后,12h就可以从关节、肝、脾等组织中检出病毒的RNA,感染后3—7天为检出的高峰期,至感染后27天还可从附关节组织检测到：在11种不同绀织中．均不同程度地检测到病原的核酸,其中以关节组织检出率最高(80．9%),其次为肝(67．6%)、脾(55.9％)、肾(50．0％),肛门棉拭子的检出率最低(13．2％),显示了ARV在感染机体内的动态分布情况。