5种主要海水养殖病原菌多重微流控荧光定量PCR快速检测技术的建立

在养殖现场开展多病原的快速检测是水产养殖产业健康发展的重要技术需求之一。本研究选取哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)的vhhA基因、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的toxR基因、大菱鲆弧菌(Vibrio scophthalmi)的luxR基因、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)的empA基因和美人鱼发光杆菌美人鱼亚种(Photobacterium damselae subsp. damselae)的Mcp基因作为靶基因,设计特异性引物,通过优化反应体系和条件,并在微流控芯片进行集成,建立了可同步检测这5种病原菌的多重微流控荧光定量PCR检测技术。结果显示,本研究所建立的检测技术最佳反应体系：2×Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix 5 μL,Primer F/R各1 μL,DNA模板2 μL,ddH2O 1 μL。反应条件为95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,61 ℃ 30 s,扩增30个循环。通过绘制标准曲线发现,在109~104 copies/μL浓度范围内均有良好的线性相关性。该方法对哈维氏弧菌、副溶血弧菌、大菱鲆弧菌、鳗弧菌和美人鱼发光杆菌美人鱼亚种特异性强,对5种病原菌的最低检测限分别为40、20、200、500和20 CFU/mL,显示出较高的灵敏度,且样品平均检测时间缩短至26 min左右。本研究结果为开发水产养殖多病原快速、精准的现场检测技术奠定了重要基础。     

矛尾复鰕虎鱼病原哈氏弧菌的鉴定及特异性检测方法的建立

取体表出血、肌肉溃疡的虾蟹养殖塘混养大量死亡的矛尾复鰕虎鱼的深层溃烂组织及肝脏进行细菌分离,2种被检组织中均分离到2种优势生长菌落;人工感染试验表明,其中的一株分离菌(S090801)浓度为106～108 cfu/ml可引起矛尾复鰕虎鱼全部死亡,该菌的形态特征、生理生化特性及基于16SrRNA和gyrB 2种基因的系统发育学分析确定为弧菌属的哈氏弧菌。同时基于gyrB基因序列设计1对特异性引物,建立了一种哈氏弧菌快速、敏感的PCR检测方法,扩增目的片段大小为363bp,该方法检测哈氏弧菌模板DNA最低质量浓度为0.046875ng/μl,可用于哈氏弧菌引起的水产动物疾病的快速诊断及分子流行病学的调查研究。     

刺参“参优1号”新品种在不同盐度下的代谢特征和适应性研究

本研究通过测定盐度为14~40条件下,刺参"参优1号"苗种的生长、存活、呼吸代谢及非特异性免疫酶活性差异,确定其适宜和最适盐度条件及其盐度适应机制。结果显示,盐度为23~40时,30 d苗种的存活率(SR)均为100%;盐度在16以下时,苗种全部死亡。盐度为23~40时,苗种的特定生长率(SGR)为正值;盐度为29~37时,SGR较高,为0.9932%/d,盐度为20以下时,SGR降为负值。耗氧率(R_O)和排氨率(R_N)随盐度的变化呈现出以32为波谷"M"型变化,盐度为32条件下的R_O和R_N分别为0.0130和0.00138 mg/(g·h)。不同盐度组刺参的O:N值均为8左右,O:N值随盐度升高无显著差异。盐度的升高和降低会引起刺参体腔液中酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、溶菌酶(LZM)、超氧化物歧化酶(SOD)活性显著升高(P<0.05),在苗种适应盐度胁迫过程中,各盐度组SOD活性的峰值一般在0 d出现,而ACP、AKP活性在第10天出现峰值,LZM活性的峰值在10~20 d。研究表明,刺参"参优1号"适宜的生长盐度为23~40,最适盐度范围为29~37,盐度变化会导致苗种呼吸代谢和免疫酶活性的变化,研究结果将为刺参"参优1号"苗种的推广提供科学依据。     

泥鳅体内凡隆气单胞菌拮抗细菌CMA 1的分离筛选及其抑菌活性

本研究从泥鳅养殖水体、底泥、健康泥鳅和患病泥鳅肠道等环境中采集样品,从中分离纯化出对凡隆气单胞菌具有拮抗作用的细菌57株.在TSB平板上采用牛津杯法进行体外拮抗实验,筛选出一株对凡隆气单胞菌具有明显拮抗作用的菌株CMA-1,经形态观察、生理生化鉴定和16SrDNA序列系统发育分析,将该菌鉴定并命名为Bacillus methylotrophicus CMA-1.菌株CMA-1生长24 h后进入稳定期,36 h时发酵上清液抑菌活性达到最大.对菌株CMA-1的发酵上清液采用硫酸铵分级沉淀,测得75％硫酸铵饱和度下的沉淀粗提物抑菌活性最高.     

美人鱼发光杆菌美人鱼亚种dly基因缺失株构建及其生物学特性研究

美人鱼发光杆菌美人鱼亚种(Photobacterium damselae subsp. damselae, PDD)是广泛分布于全球海洋环境中的一种致病菌。本研究以实验室保存的一株高致病性PDD菌株(PDD1608)作为对象,初步探究毒力基因dly对PDD菌株的生物学特性和致病力的影响。利用λRed重组技术成功构建毒力基因dly缺失株Δdly PDD1608::Cm,比较野生株和缺失株的生长、涌动性、药物敏感性、生理生化特性、生物被膜形成能力、菌株及胞外产物(extracellular products, ECP)的溶血性和磷脂酶活性等生物学特性。选用海水青鳉鱼(Oryzias melastigma)作为实验动物,通过人工感染实验测定野生株和缺失株及其ECP对海水青鳉鱼的致病性。结果显示,毒力基因dly缺失后导致PDD菌株生长变慢,涌动性、溶血性和磷脂酶活性均降低;野生株和缺失株的药物敏感性和生理生化特性未产生变化;与野生株相比,缺失株的生物被膜形成能力有显著差异(P<0.05);人工感染实验表明,缺失株及其ECP对海水青鳉鱼的致病性降低。毒力基因dly影响PDD菌株的生长、涌动性、溶血性和磷脂酶活性等多种生物学特性,并且与PDD菌株及其ECP的致病力强弱密切相关。     

番茄黄色柱头突变体ys的表型与遗传规律分析

通过EMS诱变获得了1个可稳定遗传的番茄黄色柱头突变体,命名为ys(yellow stigma)。色素含量测定发现:同野生型相比,突变体ys柱头中的叶绿素和类胡萝卜素含量没有明显变化,但对香豆酸和柚皮素查尔酮含量显著高于野生型,推测呈黄色的柚皮素查尔酮的大量积累可能在黄色柱头形成过程中起着重要作用。此外,分析发现,突变体和野生型在柱头表面结构、柱头可授性及花粉活力方面没有显著差异。对突变体ys与野生型构建的F_1、F_2、BC_1以及BC_2群体的遗传分析发现,F_1和BC_2均为绿色柱头植株,F_2和BC_1群体绿色柱头植株与黄色柱头植株的比例符合3∶1和1∶1的分离比(P0.05),表明黄色柱头突变受1对隐性基因控制,其遗传方式符合孟德尔遗传定律。     

CRISPR/Cas9介导的番茄SlMAPK6突变对植株形态的影响

促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联信号参与调控植物的多种逆境、生长发育以及花青苷的合成通路。为探究SlMAPK6在番茄中的功能,本研究利用CRISPR/Cas9技术设计3个靶标位点定点编辑SlMAPK6,并获得突变体CRISPR-3和CRISPR-7。PCR和测序结果发现SlMAPK6敲除载体构建成功。通过对T₁植株进行卡那霉素基因筛选、靶位点扩增测序及行脱靶效应分析,结果发现矮番茄植株成功突变且未脱靶,与野生型对照表型相比,所有突变植株表现出根系更发达、侧枝增多的表型,表明SlMAPK6在番茄植株形态建成的过程中发挥了重要作用,为进一步探究SlMAPK6在番茄生长发育中的作用奠定了基础。     

硫辛酸对蛋鸡早期抗氧化及免疫功能的影响

为研究饲料中添加硫辛酸对蛋鸡开产阶段血液抗氧化及免疫功能的影响,本试验选用22周龄的雪山鸡288只,随机分为3组,每组设6个重复,每个重复16只鸡,分别饲喂不同浓度(0、300、500 mg/kg)的硫辛酸日粮。进行为期6周的饲养试验。结果表明:试验组血清中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)和免疫球蛋白M含量显著提高(P<0.05),血清总抗氧化能力(T-AOC)、免疫球蛋白G(IgG)和干扰素-γ(INF-γ)含量有升高趋势,但各组间差异不显著(P>0.05),试验2组白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-4(IL-4)和γ-谷氨酰基转移酶(GGT)含量显著降低(P<0.05),肿瘤坏死因子-α(THF-α)、肌酐(CRE)和尿酸(UA)含量有降低趋势,各组间差异不显著(P>0.05)。由此可见,饲料中添加硫辛酸可以提高动物机体的健康水平。     

养殖大菱鲆的爱德华氏菌病

2004年5月至2005年9月间,先后对潍坊、烟台、威海和青岛等沿海区域养殖的大菱鲆自然发生的6宗爱德华氏菌感染病例进行了流行病学、病原分离鉴定和组织病理学等方面的调查研究。根据分离菌株的形态、生理生化特性,并结合16S rDNA序列分析,将其鉴定为迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)。人工感染实验证实该菌为大菱鲆爱德华氏菌病的致病菌。大菱鲆迟钝爱德华氏菌病具有急性和慢性两种感染形式。迟钝爱德华氏菌感染可引起大菱鲆肾脏、脾脏、肝脏、肠、鳃、皮肤等器官组织发生不同程度的病理变化,其显著特点是单核巨噬细胞增生,使得各器官组织出现巨噬细胞浸润现象。病鱼的组织病理变化以肾脏最为明显,包括巨噬细胞大量增生,多发性局灶坏死伴有渗出性炎症反应以及肉芽肿的产生;肾脏外观则显示异常膨大,正常组织转变为白色脓疡或豆腐渣状。本文属国内首次报道爱德华氏菌感染大菱鲆致病,为该鱼类的健康养殖和疾病防治提供参考和依据。     

膨化亚麻籽对肉鸡生产性能和屠宰性能的影响

为研究日粮中添加膨化亚麻籽对肉鸡生产性能及屠宰性能的影响,试验选用1日龄的罗斯308肉鸡240只,随机分为4组(对照组、试验1组、试验2组、试验3组),每组设6个重复,每个重复10只鸡,分别饲喂不同浓度(0、2.0%、3.8%、5.7%)的膨化亚麻籽日粮。试验期为6周,分别测定平均日增重、平均日采食量、胫骨长、胫骨周长等生产性能指标及屠宰率、半净膛率、胸肌率、腹脂率等屠宰性能指标。结果表明:第1周试验组的平均日增重显著高于对照组(P0.05),试验1,2,3组之间差异不显著(P0.05);试验1组和3组的平均日采食量显著高于对照组(P0.05),第6周对照组和试验2组的平均日采食量显著高于试验1组和3组(P0.05);第5周试验1组和试验3组的料重比显著高于试验2组(P0.05),高于对照组但差异不显著(P0.05),从全期结果来看,对照组与试验组之间无显著差异(P0.05);7日龄时试验2组的胫骨周长显著低于试验1组(P0.05),低于对照组但差异不显著(P0.05),其他日龄各组差异均不显著(P0.05);试验2组和试验3组肉鸡的屠宰率显著提高(P0.05),但是对半净膛率、全净膛率、胸肌率、腿肌率以及腹脂率无显著影响(P0.05)。