基于基因编辑技术创制高亚油酸水稻材料

【目的】亚油酸是一种人体必需的脂肪酸,能加快体内脂肪代谢与分解、减少胆固醇在血管壁上形成积存、有效预防动脉硬化的发生、提高人体免疫力、促进骨骼发育、提高记忆力、预防脑部功能退化等功能。利用基因编辑技术对控制脂肪酸合成途径的关键酶ω-3脂肪酸去饱和酶基因进行精准编辑,关闭下游产物的合成途径,以便提高水稻上游亚油酸的含量,为创制富集亚油酸水稻材料提供依据。【方法】水稻脂肪酸合成途径中的关键酶ω-3脂肪酸去饱和酶基因（OsFAD3）存在2个拷贝,分别分布在第11和第12染色体,且两者cDNA同源性达97.32%。根据基因编辑原理（编辑的特异性取决于引导RNA（gRNA）的特性）,在2个同源基因序列高度一致的外显子区域,分别设计合成2个gRNA,并分别构建植物基因编辑载体,利用农杆菌介导法转化本地受体材料（富源4号）。通过对基因编辑植株进行靶位点测序鉴定,分析2个位点的编辑效率和基因型。同时,对OsFAD3双突变体进行粒宽、粒长等主要籽粒农艺性状分析。采用气质联用检测法测量OsFAD3双突变体籽粒的37种脂肪酸含量。【结果】获得2个位点的纯合编辑材料,同时也获得了其他不同基因型组合的编辑材料;与对照材料相比,OsFAD3双突变体的粒宽、粒长等主要籽粒农艺性状均没有发生显著变化,但稻谷中亚油酸的相对含量提高了3.36个百分点。【结论】在不改变籽粒主要农艺性状的前提下,实现了利用基因编辑技术通过转化一个载体同时精准敲除2个ω-3脂肪酸去饱和酶基因,提高了籽粒中亚油酸的相对含量。     

基于叶片反射光谱估测水稻氮营养指数

【目的】基于叶片反射光谱建立快速、无损监测水稻氮营养指数（nitrogen nutrition index,NNI）的估算模型。【方法】2018—2019年开展2个水稻品种（徽两优898和Y两优900）及5个氮肥梯度（施氮量为0、75、150、225和300 kg·hm^-2,分别记为N₀、N₁、N₂、N₃、N₄）的田间小区试验,测定关键生育期不同叶位叶片反射光谱和植株NNI,构建多种光谱指数的水稻NNI监测模型。【结果】单叶及叶位组合的敏感波段均分布在540 nm的绿光波长处,其与近红外波段构成的窄波段比值指数SR（R₉₀₀,R₅₄₀）可较好反演水稻NNI。但不同叶位叶片窄波段比值指数与水稻NNI的预测精度表现不同,顶3叶（L₃）预测精度最好（R²=0.731,RMSE =0.130,RE=11.6%）,顶2叶（L₂）次之（R²=0.707,RMSE =0.136,RE =12.2%）,顶1叶（L₁）最差（R²=0.443,RMSE =0.187,RE =14.7%）;顶2叶和顶3叶组合平均光谱（L₂₃）的预测精度优于单叶水平和其他叶位组合（R²=0.740,RMSE =0.128,RE =11.5%）。再将窄波段比值指数SR（R₉₀₀,R₅₄₀）近红外与绿光区域分别重采样50 nm和10 nm,所构建的宽波段比值指数SR[AR_{（900±50）},AR_{（540±10）}]模型精度较SR（R₉₀₀,R₅₄₀）未明显降低,且在L₂₃水平下2个模型的模型精度和预测精度基本一致（R²=0.740,RMSE =0.128,RE =11.5%）。水稻NNI小于1时与产量呈线性的正相关关系（P<0.05）,大于1时产量趋于平稳。【结论】L₂和L₃叶片反射光谱为监测水稻NNI的敏感叶位,其中叶位组合L₂₃可提高模型预测精度。基于叶片反射光谱构建的多种波段比值指数（SR（R₉₀₀,R₅₄₀）和SR[AR_{（900±50）},AR_{（540±10）}]）可快速估测水稻NNI,从而为不同传感器对水稻氮营养指数估测监测研究提供了理论依据。     

中国东北和华北地区紫花苜蓿根瘤菌遗传多样性研究

【目的】紫花苜蓿（Medicago sativa L.）被誉为牧草之王,近年来,中国东北和华北地区种植面积不断扩大,但紫花苜蓿质量与产量仍不足以满足中国畜牧业发展的需求。本研究旨在分析中国东北和华北地区紫花苜蓿根瘤菌遗传多样性,为紫花苜蓿高效固氮根瘤菌的筛选与应用提供参考。【方法】采用表面消毒和平板划线法从根瘤中分离纯化根瘤菌单菌落;使用BOX-PCR方法对供试菌株进行基因型划分;选取代表菌株进行持家基因（atpD、glnII和rpoB）和共生基因（nifH和nodC）的系统发育分析。【结果】从中国东北和华北19个采样地共分离纯化了499株根瘤菌,BOX-PCR可将供试菌株分为37种BOX型,BOX型存在显著的地理分布现象,同时寄主品种对根瘤菌基因型具有一定的选择作用。97.60%（487/499）的根瘤菌为Sinorhizobium meliloti。其余12株分别为S. adhaerens、Mesorhizobium huakuii、Rhizobium loessense、R. mesosinicum、R. vignae、Mesorhizobium sp.和Phyllobacterium sp.,这12株根瘤菌仅在中国东北地区发现,华北地区根瘤菌均为S. meliloti。3个持家基因在紫花苜蓿根瘤菌种间系统发育分析结果一致,但其揭示优势种S. meliloti的种内多样性存在差异。共生基因系统发育结果显示,在根瘤菌属间和属内发生了共生基因的水平转移现象。nifH在S.meliloti种内显示出比nodC更丰富多样性。【结论】中国东北和华北地区紫花苜蓿根瘤菌具有较丰富的遗传多样性,且根瘤菌存在显著的地理分布特征和寄主选择现象。     

基于新遗传连锁图谱的豇豆抗豆象QTL定位

【目的】豆象是危害豇豆最主要的仓储害虫。发掘豇豆抗豆象基因为抗性品种的选育,以及减少豆象对豇豆生产的危害奠定基础。【方法】以中豇1号（感）和Pant-lobia-1（抗）为亲本构建的包含282个株系的RIL群体为研究材料,利用人工接种法分别对282个株系接种绿豆象和四纹豆象,进行抗豆象表型鉴定,并利用两亲本对3 992个来源于绿豆、小豆和豇豆的SSR标记进行多态性筛选,然后利用筛选到的多态性标记对282个株系进行基因型分析,最后结合RIL群体各株系抗豆象表型鉴定数据和基因型分型数据,采用完备区间作图法（ICIM-ADD）进行抗豆象QTL定位分析,在此基础上构建遗传连锁图谱,并定位豇豆抗豆象基因。【结果】中豇1号和F₁籽粒的被害率均为100%,Pant-lobia-1籽粒的被害率分别为22.5%和42.5%。推测Pant-lobia-1对绿豆象和四纹豆象的抗性均为隐性遗传;筛选到182个多态性标记,利用这些多态性标记构建了一个包含11个连锁群的豇豆遗传连锁图谱,图谱总长1 065.23 cM,相邻标记间平均遗传距离为5.85 cM;经2种豆象处理,分别在连锁群1和连锁群5上检测到2个稳定的QTL位点,暂定名为vubr1-1和vubr5-1,其中vubr1-1位于标记XD11-44和HAAS_VR_2274之间,标记间的遗传距离为7.6 cM,在2种豆象处理中分别可以解释表型变异的7.16%和6.92%;vubr5-1位于标记XD1-14和CP185之间,标记间的遗传距离为2.90 cM,在2种豆象处理中分别可以解释表型变异的6.96%和6.37%。【结论】构建了一个包含11个连锁群、182个多态性标记的豇豆遗传连锁图谱,检测到2个与抗豆象相关的QTL位点。     

铁氧化物-硅酸盐复合物的形成、性质及其对砷的固定

铁氧化物与硅酸盐矿物是土壤中最重要、最活跃的固相组分,它们之间的交互作用直接影响土壤物理化学特性,可有效地调控土壤(类)重金属的迁移、转化。本文以铁氧化物和硅酸盐矿物胶结过程中的一些表观特征变化为出发点,从宏观、表观到微观综述了二者交互作用的界面特性和机理、交互作用前后对土壤砷的固定与释放机制等内容。本文阐明层状硅酸盐与铁氧化物通过多种化学作用而发生表面复合,其中静电作用是作用力之一,带负电荷的硅酸盐与带正电荷的铁氧化物在静电引力的作用下迅速结合,在胶体表面双电层上形成二元团聚体;形成的二元团聚体可改变土壤矿物的表面积和孔性结构、表面电化学特性和物理性质。同时,铁氧化物-硅酸盐复合物表面的活性基团可以通过内层络合共氧的方式将土壤中AsO_4~(2-)络合,形成单核或双核表面络合物而固定砷。复合物对AsO_4~(2-)的吸附能力介于铁氧化物和硅酸盐矿物之间,并更接近铁氧化物的表面吸附特性。本文旨在为土壤砷的原位固定提供理论支撑。     

4种中药复方对长江鲟幼鱼抗氧化和抗应激指标的影响

【目的】探讨不同中药复方对长江鲟幼鱼抗氧化和抗应激指标的影响,筛选能有效提高长江鲟幼鱼免疫力及抗病力的中药复方,为中药在长江鲟养殖生产中的推广应用提供参考依据。【方法】将17味中药按照中药配伍理论设计4种中药复方,分别是复方I（鱼腥草:金银花:大黄:茯苓:甘草︰黄芪=3:3:1:2:1:2）、复方II（板蓝根:大黄:五加皮:党参=3:3:4:3）、复方III（金银花:杏仁:贯众:大青叶:山豆根:桔梗=3:2:2:2:3:2）、复方IV（黄芪:黄柏:甘草:山楂:五味子:大黄:党参=3:3:1:2:2:2:2）,以不添加中药为对照组,按0.5 g/kg的添加量进行长江鲟幼鱼饲喂试验,并于第7和第14 d采集血样测定各项血清生理指标。【结果】与对照组相比,复方I组和复方II组可不同程度地提高长江鲟血清超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化物酶（POD）、碱性磷酸酶（AKP）活性及总抗氧化能力（T-AOC）、热休克蛋白70（HSP70）含量,降低丙二醛（MDA）含量,但仅部分指标差异达显著水平（P<0.05,下同）;复方III组和复方IV组可明显提高长江鲟血清SOD、CAT、GSH-Px、POD、AKP活性及T-AOC,降低MDA和皮质醇（COR）含量,且大部分指标与对照组的差异达显著水平。相关分析结果表明,SOD活性与GSH-Px活性及T-AOC、POD活性与GSH-Px活性呈极显著正相关（P<0.01,下同）,POD活性与SOD活性、CAT活性及T-AOC呈显著正相关,SOD活性与COR含量、T-AOC与COR含量呈极显著负相关,GSH-Px活性与COR含量、T-AOC与MDA含量呈显著负相关。【结论】在基础饲料中添加适宜的中药复方对长江鲟幼鱼抗氧化和抗应激能力有显著促进作用,尤其以复方III（金银花、杏仁、贯众、大青叶、山豆根、桔梗）和复方IV（黄芪、黄柏、甘草、山楂、五味子、大黄、党参）的效果最佳,可有效缓解长江鲟幼鱼机体面临的应激反应,达到保护效果。     

多粘类芽胞杆菌分离鉴定及其对甘薯蔓割病的防治效果

【目的】筛选对甘薯蔓割病病原菌具有拮抗作用的芽胞杆菌,为甘薯蔓割病的生物防治提供菌种资源。【方法】通过平板对峙法从玉米根际土壤中筛选对甘薯蔓割病病原菌具有拮抗作用的芽胞杆菌;通过生物学特征和16S rDNA序列分析对拮抗菌株进行分类鉴定;通过盆栽试验进行拮抗菌株对甘薯蔓割病的防效试验,并检测拮抗菌株对甘薯叶片脱落酸(ABA)和赤霉素(GA)含量,超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性及可溶性蛋白含量的影响。【结果】从玉米根际土壤中分离获得1株乳白色且具有拮抗作用的芽胞杆菌,命名为HAAS05,通过16S rDNA鉴定及系统发育进化树比对分析,将HAAS05菌株鉴定为多粘类芽胞杆菌(Paenibacillus polymyxa)。盆栽试验结果显示,HAAS05菌株对甘薯蔓割病有明显的拮抗效果;OD_{600 nm}=0.20和OD_{600 nm}=0.40的HAAS05菌悬液处理第10 d后,甘薯叶片中ABA含量较仅接种病原菌处理(201.94 ng/g)显著降低(P<0.05,下同),分别为52.29和107.10 ng/g,而GA含量较仅接种病原菌处理(7.05 ng/g)显著升高,分别为8.10和10.31 ng/g,甘薯叶片SOD活性和可溶性蛋白含量均较仅接种病原菌处理显著升高,而POD活性变化无明显规律。【结论】多粘类芽胞杆菌HAAS05菌株对甘薯蔓割病有较好的拮抗作用,具有一定的开发应用潜力。     

江西省芝麻地方种质表型性状遗传多样分析

【目的】对江西省芝麻地方种质资源进行表型性状遗传多样分析,为江西芝麻种质资源的有效利用及开发提供理论参考。【方法】依托“第三次全国农作物种质资源普查与收集行动”从江西省39个县(市、区)收集到的132份芝麻地方种质为试验材料,对其23个表型性状(12个质量性状和11个数量性状)进行测定,并计算遗传多样性指数和变异系数。同时,对11个数量性状进行相关分析,并对供试种质进行聚类分析。【结果】23个表型性状的平均遗传多样性指数为1.2821,其中,12个质量性状的遗传多样性指数为0.3217~1.0307,平均0.7290;11个数量性状的变异系数为4.70%~43.58%,遗传多样性指数为1.6138~2.0627,平均1.8855。3种粒色类型芝麻种质中,以46份白芝麻种质表型性状的平均遗传多样性指数最高,为1.3602,74份黑芝麻种质和12份其他粒色(黄色、褐色、黄褐色、红褐色等)芝麻种质表型性状的平均遗传多样性指数分别为1.1782和1.0476。生育期与株高、始蒴高度、蒴果长、千粒重和蛋白含量呈极显著正相关(P<0.01,下同),但与含油量呈极显著负相关。供试的132份芝麻种质资源可分为四大类,不同类群种质的来源地存在地理位置的交错分布现象,其中,第Ⅰ类群可作为潜在选育芝麻高含油量新品种的亲本材料,第Ⅱ类群可作为潜在高产优良芝麻材料利用,第Ⅲ类群可作为潜在矮杆株型的亲本材料,第Ⅳ类群可作为潜在的高蛋白型亲本材料加以利用。【结论】江西芝麻地方种质资源的主要表型性状变异较大,遗传多样性较丰富,其中以46份白芝麻种质的遗传多样性更丰富。种质间亲缘关系与地理来源无必然联系。以高产高蛋白为育种目标时应选择株高较高,始蒴高度适中、蒴果较大、千粒重较高的材料为亲本,并据此进行后代选择。     

不同环境胁迫因子对猪源耐药大肠杆菌生长的影响

【目的】探究环境胁迫因子对猪源多重耐药大肠杆菌生存适应性的影响,为创造多重耐药菌株带来高适应代价的环境及加速降低种群耐药水平提供理论依据。【方法】以分离自贵州省规模化猪场的多重耐药大肠杆菌QL15为研究对象,以大肠杆菌质控(敏感)菌株ATCC25922为对照,经体外竞争试验测定不同环境(培养基浓度、碳源、氮源、pH和温度)胁迫下耐药菌株QL15相对于敏感菌株ATCC25922的适应性,并通过重测序变异位点和实时荧光定量PCR测定分析耐药基因表型及外排泵和外膜孔道蛋白基因表达与细菌适应性代价的关系。【结果】耐药菌株QL15在体外独立及混合培养时,除在稀释LB培养基(1/4、1/8和1/16)中的长势较敏感菌株ATCC25922低外,在低碳源(0.1%和0.5%)、低氮源(0.01%和0.05%)、酸碱性(p H=5.0、pH=6.0和pH=8.0)及低温(20℃)和高温(42℃)胁迫下的生长均优于敏感菌株ATCC25922,且混合培养结果优于独立培养。将耐药菌株QL15基因组序列与敏感菌株ATCC25922基因组序列进行比对,共检测到509个InDel突变位点,其中Delete突变位点233个、Insert突变位点276个;共注释到71个功能基因,以细胞壁与细胞膜相关基因突变最多(10个),占14.1%。与敏感菌株ATCC25922相比,耐药菌株QL15在不同环境胁迫下其外排泵与外膜孔道蛋白相关基因emrB、acrB、tolC和ompC呈下调表达,而ompF基因呈上调表达。【结论】多重耐药大肠杆菌耐药性的获得促使其具有更强的适应性,但对可直接利用营养物质的获取弱于敏感菌株,即处于竞争劣势。耐药大肠杆菌的多重耐药性主要是由多种外排泵和外膜孔道蛋白介导完成,其中,ompF基因在pH胁迫、全营养胁迫和高、低温胁迫下均处于上调表达状态,故推测ompF基因的高表达有利于大肠杆菌在上述胁迫条件下生长。