条斑紫菜6个品系的SRAP分析

为鉴别条斑紫菜不同品系的种质,使用相关序列扩增多态性(sequence-related amplified polymorphism,SRAP)标记对条斑紫菜的5个选育品系和1个野生品系进行遗传分析,结果从35对引物组合中筛选出可扩增出稳定清晰条带的组合11对,共获得131个扩增位点,其中多态性位点125个,多态性比例高达95.42%。6个品系 间的遗传距离为0.364 3～0.867 9,平均为0.593 0。用UPGMA法进行聚类分析,结果将6个品系分为2个群,所反映的亲缘关系与各品系的来源基本一致,说明SRAP 标记技术可以成为条斑紫菜品系间遗传分析的有效工具。在131个多态性位点中,选择扩增出的4个位点构建了6个品系的指纹图谱。另外,通过ME1/EM6引物组合 扩增得到耐高温品系TM-18的特异性条带,经回收测序和重新设计引物,该条带在其丝状体和叶状体DNA中均能稳定地被扩增出来,可用于该品系的种质鉴别 。     

光强、温度和N/P比对坛紫菜叶状体单性生殖发生的影响

为探究培养条件对坛紫菜叶状体生长和单性生殖发生的影响,研究了不同光强、温度和N/P比下坛紫菜叶状体的生长及单性生殖发生的特点。结果显示,当光强为10～40μmol/(m2·s)时,藻体生长缓慢、成熟晚、单性生殖发生晚;光强增至60～80μmol/(m2·s)时,藻体生长加快,成熟和单性生殖发生同时提前。温度为17～20°C时,藻体生长慢、成熟晚、单性生殖发生推迟;23°C时藻体生长最快;而29°C组的藻体虽然生长受到抑制,但藻体成熟和单性生殖发生得到促进。N/P比为16∶1处理组的叶状体比其他处理组(1∶1、4∶1、32∶1和64∶1)均生长变快,N/P比为64∶1时叶状体生长最慢,但易成熟、易发生单性生殖。因此,在高光强、高温和高N/P比下,藻体成熟和单性生殖发生均提早,说明这些因素对坛紫菜叶状体单性生殖的发生有重要影响。     

一株引起坛紫菜绿斑病病原的分离鉴定及致病性研究

为了明确引起坛紫菜绿斑病的病原,对2012年发生在福建省莆田养殖海区坛紫菜叶状体绿斑病开展了病原的分离鉴定和致病性研究。利用2216E海水培养基平板,从患病藻体分离得到一株优势细菌X5;在实验室条件下将X5进行回接感染实验,在显微镜下观察到坛紫菜叶状体发生组织病理变化,出现绿斑病症状:感染初期出现黄绿色小斑点,病斑逐渐扩大出现空洞,最后导致紫菜叶片流失;用浓度为10⁴~10⁸ cfu/mL的X5感染坛紫菜时,在7 d内引起紫菜出现10%~100%病斑面积,这些结果表明X5为坛紫菜绿斑病的病原。利用生理生化和多基因序列分析方法对X5进行鉴定,结果显示该菌为革兰氏阴性菌,大小为0.6 μm×0.4 μm~1.0 μm×0.4 μm,无鞭毛,在温度4~42℃、盐度50~150、pH6~10范围内生长,最适生长温度为16℃,最适生长盐度为50,最适pH为7,对甲硝唑、林可霉素和青霉素耐药,对25种抗生素敏感,Biolog和API ID-32E细菌鉴定系统的结果显示X5为弧菌属细菌(Vibriosp.);基于多基因序列(16S rRNA,rpoA,recA,pyrH)构建的系统进化树分析显示,X5与V.casei、V.litoralis、V.rumoiensis聚为一支,进化距离为0.095~0.108,这些结果说明X5为弧菌属的一个新种或是V.casei、V.litoralis、V.rumoiensis之一的一个新亚种。本研究报道了弧菌X5能够引起坛紫菜绿斑病,为紫菜流行病学及疾病防治提供了理论支撑。     

坛紫菜泛素连接酶PhCUL1基因克隆与功能验证

高温影响坛紫菜(Pyropia haitanensis)的产量和品质,是制约紫菜产业发展的主要因素。前期研究发现,高温胁迫下,坛紫菜泛素蛋白酶体系统相关基因显著上调表达,但其响应高温胁迫的分子功能还未知。本研究通过分子生物学、遗传学等技术手段对坛紫菜cullin E3连接酶基因(PhCUL1)的功能进行研究。利用PCR方法克隆了PhCUL1基因的全长,PhCUL1全长为2500 bp,开放阅读框(ORF)长度为2481 bp,该基因存在1个Cullin (407~618 aa)结构域和1个Cullin Nedd8 (754~821 aa)结构域,其中,Cullin Nedd8结构域为蛋白融合位点。进化树分析显示,PhCUL1在进化上与脐形紫菜(Porphyra umbilicalis)有较近的亲缘关系。qRT-PCR结果显示,PhCUL1基因被高温显著诱导。为进一步阐明PhCUL1的分子功能,将其转入莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)进行功能验证,过表达PhCUL1株系比野生型更能耐受高温胁迫。同时,在高温33℃下处理3 h和6 h内,转基因植株的PhCUL1基因呈上调表达。这初步说明PhCUL1基因在坛紫菜响应高温胁迫过程中发挥着重要作用,其具体调控机制有待进一步研究。本研究有助于阐明坛紫菜泛素蛋白酶体系统响应高温胁迫的分子机制,为指导耐高温新品种选育提供理论依据。     

坛紫菜叶状体的抗生素联合除菌效果

为研究坛紫菜及其外生菌群对氯霉素、竹桃霉素和头孢噻肟3种抗生素的敏感性,通过将其与氨苄青霉素、卡那霉素和庆大霉素的组合,优化坛紫菜叶状体的除菌方法,并利用涂布平板、qRT-PCR及16S rRNA测序分析其除菌效果。结果显示,当坛紫菜先以氨苄青霉素(300 mg/L)、卡那霉素(100 mg/L)和庆大霉素(100 mg/L)混合处理18 h,再以氯霉素(50 mg/L)、头孢噻肟(200 mg/L)和竹桃霉素(50 mg/L)混合处理4 d,叶状体的健康率保持在96.3%以上,而对可培养细菌的抑制率达到99.9%。根据qRT-PCR和16S rRNA的结果可知,该种组合方法较前3种抗生素的组合,其菌总数下降41.5%,微生物的丰度和多样性指数明显下降。其中,假单胞菌、交替赤杆菌、交替单胞菌以及海杆菌等得到针对性的抑制。研究表明,多种抗生素的优化组合能够对坛紫菜叶片的菌群结构产生显著影响,使其受到抑制,但仍无法达到绝对除菌的效果。     

3种植物生长调节剂对坛紫菜自由丝状体生长与光合色素含量的影响

采用单因素分析法,比较研究了添加3种外源植物生长调节剂(吲哚乙酸IAA、2,4-二氯苯氧乙酸2,4-D、激动素KT)对野生型坛紫菜(Pyropia haitanensis)自由丝状体生长及光合色素含量的影响。结果表明:与对照组相比,低浓度的IAA(0.5~4.0 mg·L~(-1))和KT(0.5~2.0 mg·L~(-1))对藻体的特定生长率有显著影响,以2.0 mg·L~(-1)IAA和1.0 mg·L~(-1)KT对藻体的促生长效应最大,培养25 d时藻体鲜重增加最大,分别是对照组的1.90倍和1.52倍(P0.05)。高浓度的IAA(6.0~10.0 mg·L~(-1))和KT(4.0~10.0 mg·L~(-1))却会抑制藻体生长(P0.05)。培养25 d时,与对照组相比,2.0 mg·L~(-1)IAA和1.0 mg·L~(-1)KT均有利于叶绿素a(Chl a)和类胡萝卜素(Car)的合成,Chl a含量分别增加了23.7%和23.8%;Car含量分别增加了31.0%和28.6%(P0.05)。然而,高浓度的IAA和KT(6.0、10.0 mg·L~(-1))不利于Chl a的合成,其处理浓度越高,Chl a含量下降越多。与对照组相比,较低浓度的IAA(1.0~2.0 mg·L~(-1))明显促进藻红蛋白(PE)和藻蓝蛋白(PC)合成,其中2.0 mg·L~(-1)IAA处理组PE、PC含量最高,分别增加了59.1%和45.7%(P0.05)。较低浓度的KT(0.5~2.0 mg·L~(-1))均有利于PE、PC合成,其中0.5 mg·L~(-1)KT处理组的PE、PC含量增加最多,分别提高了48.4%和50.5%(P0.05)。高浓度的IAA(6.0、10.0 mg·L~(-1))和KT(10.0 mg·L~(-1))则明显降低了PE、PC合成(P0.05)。2,4-D对藻体的特定生长率和光合色素合成无显著影响(P0.05)。     

印度产紫菜Pyropia chauhanii优良品系的选育与特性分析

为培育出藻体薄且适合在我国南方高水温海区栽培的紫菜新品种,利用~(60)Co-γ射线辐照和高温胁迫处理印度产紫菜Pyropia chauhanii野生型品系(PC-WT)的叶状体,分离出优良品系PC-M,随后通过研究2个品系在耐高温性、生长、主要光合色素含量、单孢子和壳孢子放散量等方面的差异后发现,在18和23°C温度组中,2个品系的壳孢子存活率、分裂率和假根发生率均无显著性差异,但在27和29°C温度组中,PC-M品系的壳孢子存活率比PC-WT品系分别提高了250.7%和305.4%,分裂率分别提高了42.4%和67.1%,假根发生率分别提高了86.6%和175.3%;将在23°C下培养30 d的叶状体分别置于18、23、27和29°C下培养10 d,在18、23和27°C组中,PC-M品系的叶状体绝对生长率分别是PC-WT品系的5.1、5.3和7.5倍,特定生长率分别是PC-WT品系的1.3、1.3和1.8倍;在27°C下培养15 d或在29°C下培养10 d,PC-WT品系的叶状体均放散了大量的单孢子,藻体流失严重,仅剩下基部,而PC-M品系的叶状体均没有放散单孢子、藻体形态完整、光泽好、生长速率快,培养至30 d后才发生轻微的卷曲。与PC-WT品系相比,常温组(23°C)的PC-M品系的3种主要光合色素(chl.a、藻红蛋白和藻蓝蛋白)含量以及壳孢子放散量分别提高了39.4%、209.8%、94.8%和36.7%,但藻体的平均厚度反而减少了31.6%。上述结果证实,与PC-WT品系相比,PC-M品系具有藻体薄、色素含量高、生长快、耐高温、壳孢子放散量大、单孢子不放散等优点,有望被培育成适宜栽培的新品种。     

基于液质联用技术的坛紫菜甘油-3-磷酸胁迫响应分析

甘油-3-磷酸作为渗透压调节物红藻糖苷的合成前体物,参与藻类抗逆应答过程。为了解坛紫菜的抗逆机制,通过超高效液相色谱-质谱联用技术(UPLC-MS)建立甘油-3-磷酸的定量分析方法,分析非生物(温度、盐度和干出)胁迫下的甘油-3-磷酸响应规律。结果表明,温度胁迫1 h后,甘油-3-磷酸的含量快速变化,当温度高于23℃时,甘油-3-磷酸含量与胁迫温度成正比,而在12℃低温下,甘油-3-磷酸的含量反而下降;盐度胁迫促使甘油-3-磷酸的含量快速上升,且高盐胁迫下的变化显著高于低盐环境;而短时间1 h干出胁迫后的甘油-3-磷酸含量略有上升(1.19倍,与对照组相比),但随着干出时间继续延长,甘油-3-磷酸含量总体呈现下降趋势。温度、盐度和干出胁迫后的坛紫菜进行恢复培养后,甘油-3-磷酸含量均趋于对照组水平。综上可知,甘油-3-磷酸可快速响应环境胁迫,这为坛紫菜红藻糖苷抗逆机制的多层次研究奠定了基础。     

2种坛紫菜品系栽培生长参数及CNP固定效率比较

以洞头海区养殖的"洞头本地菜"和"浙东1号"2种坛紫菜品系为研究材料,测定其不同收割期叶状体长度、干质量、CNP含量等参数,核算了S值、产量及CNP固定效率等指标。结果显示:随着收割期延长,2种坛紫菜品系的叶状体长度逐渐下降,单条叶状体干质量与S值逐渐增加,产量先升后降,CNP固定效率整体呈上升趋势。一水至四水"洞头本地菜"的单条叶状体长度、干质量均高于"浙东1号",二水至四水"洞头本地菜"的产量、CNP固定效率均高于"浙东1号",2种坛紫菜品系S值之间无明显差异。一水至四水"洞头本地菜"CNP总固定效率分别为900.74 kg/hm~2、110.16 kg/hm~2和14.16 kg/hm~2,"浙东1号"CNP总固定效率分别为683.34 kg/hm~2、84.3 kg/hm~2和10.75 kg/hm~2。上述指标在不同收割期均呈极显著差异(P0.01),在不同品系间均无显著差异(P0.05),研究结果有助于进一步认知坛紫菜养殖的生长性状与生态效益。     

高温胁迫下坛紫菜中红藻糖苷及其异构体的含量变化

为了解热激应答下坛紫菜中红藻糖苷和异红藻糖苷含量的变化,以及两者与坛紫菜高温耐受性之间的联系,以ME-05坛紫菜为样品,采用高效液相色谱三重四级杆质谱联用技术(HPLC-MS)分析35℃高温胁迫和20℃恢复培养条件下,坛紫菜中红藻糖苷及其异构体含量的变化趋势,通过两者的含量波动,探讨其与坛紫菜耐受性之间的关系。结果表明,相同品种、相同日龄但生长地点不同的坛紫菜中,红藻糖苷含量稳定;不同生长阶段的坛紫菜经35℃高温胁迫后,红藻糖苷和异红藻糖苷含量减少,经恢复培养3 h后发现红藻糖苷和异红藻糖苷含量逐渐回升并超过对照组;红藻糖苷和异红藻糖苷的变化率为:Ⅲ组(生长期第75天)>Ⅳ组(生长期第135天)>Ⅱ组(生长期第45天)>Ⅰ组(丝状体),红藻糖苷的变化更为敏感且具有规律。综上,红藻糖苷与坛紫菜的生长状况和抗逆能力相关,可作为紫菜选育的指标物。本研究结果为进一步探讨坛紫菜在高温胁迫下的生理响应及健康养殖奠定了理论基础。