斑马鱼早期胚胎发育囊胚sphere时期的蛋白组学研究

斑马鱼(Danio rerio)早期胚胎发育囊胚时期是胚胎发育过程的关键时期,利用i TRAQ蛋白质质谱分析技术,检测斑马鱼早期胚胎发育过程中囊胚sphere时期的蛋白质表达情况,并分析该时期表达的蛋白质的相应功能和参与调控的生物过程。以野生型斑马鱼发育至sphere时期即4 hpf的胚胎为样本,利用i TRAQ标记与LC-MS/MS串联质谱技术,结合数据库比对,对该时期表达的蛋白质进行定性和定量的鉴定分析。检测结果共鉴定到的总蛋白数为1 178个,利用生物信息学进行功能分析,发现这些蛋白广泛参与了细胞信号传递、细胞运动和细胞骨架构建、细胞增殖、细胞分化、物质合成与代谢等各项重要的生命活动过程。研究表明,利用i TRAQ标记的方法可以对4hpf时期的斑马鱼胚胎中的蛋白质进行有效的分离和鉴定,并初步建立了斑马鱼早期发育关键阶段sphere时期的蛋白质组表达图谱,以期为斑马鱼胚胎发育过程中蛋白质组学和调控机制的研究提供参考。     

斑马鱼雄核发育技术研究

为探索人工诱导斑马鱼雄核发育二倍体克隆鱼的途径和方法,运用紫外线照射卵子使其遗传物质失活,利用斑马鱼体表花纹形态作为遗传标记,使用热休克技术阻止受精卵的第一次卵裂加倍染色体。试验结果表明总辐射剂量为120mJ cm2紫外线照射斑马鱼卵可以使雌核遗传物质完全失活;体表花纹为豹斑花纹被证实是由纯合隐性基因控制的性状,可以作为雄核发育遗传标记;遗传失活卵受精后经2min,(41 5±0 5)℃的热休克后出现两个染色体加倍的高峰期,分别为受精后的11min和23min,且后一时期效果优于前一时期,最高二倍体诱导率达46 15%;经遗传分析,共获得正常存活的雄核发育二倍体克隆鱼19尾,说明经过优化的紫外线结合热休克等染色体操作技术,可以成为诱导雄核发育二倍体克隆鱼的有效手段。     

3种植物源农药对鹌鹑和斑马鱼的急性毒性评价

[目的]通过测试印楝素、除虫菊素、鱼藤酮3种植物源农药对鹌鹑和斑马鱼的急性毒性,评价其对环境的安全性。[方法]采用一次性＂经口染毒法＂和＂半静态法＂,确定3种农药对鹌鹑和斑马鱼的毒性大小与分级。[结果]印楝素、除虫菊素、鱼藤酮对鹌鹑急性毒性的LD50（168h）分别为13.09、97.04和111.75mg/kg.bw;对斑马鱼急性毒性的LC50（96h）分别为0.05、0.15和0.03mg/L。印楝素对鹌鹑的急性经口毒性等级为高毒,除虫菊素和鱼藤酮为中毒;印楝素和鱼藤酮对鱼的急性毒性等级为剧毒,除虫菊素为高毒。[结论]3种药剂对鹌鹑和斑马鱼都不安全,实际应用中必须减少其对生态环境的危害。     

甲基睾酮对雌性斑马鱼性腺发育的抑制作用

用含雄性激素甲基睾酮(MT)的饲料饲喂经产雌性斑马鱼(Danio rerio)来探讨外源激素对其性腺发育的影响。通过投饲含0、30、60、120、240和400 mg.kg-1 MT的饲料30 d后,石蜡切片观察斑马鱼卵巢的发育情况。结果表明,随着MT剂量的增加,斑马鱼性腺的发育受到抑制,卵巢结构变化明显。30 mg.kg-1剂量组的成熟系数有明显的降低,至400 mg.kg-1剂量组,成熟系数仅为对照组的1/6;同时外源雄性激素严重影响或抑制了卵巢的进一步发育,较低剂量组性腺发育停滞在Ⅲ时相左右,较高剂量组的性腺明显的退化,至400 mg.kg-1剂量组,卵巢已呈明显的萎缩状态,卵母细胞几乎不可见;卵母细胞在甲基睾酮作用下的退化过程为:抑制卵母细胞发育—细胞核结构变化—累及细胞器—形成凋亡小体、破坏细胞膜结构—凋亡小体逸散、细胞固缩—崩解。结果显示外源雄性激素对雌性斑马鱼的性腺发育影响明显,较高剂量时可导致外源激素的阉割作用。     

Cu（2＋）、Cd（2＋）、Cr（6＋）胁迫对斑马鱼抗氧化酶活性的影响

[目的]研究Cu2＋、Cd2＋、Cr6＋对斑马鱼抗氧化酶活性影响,探讨重金属对斑马鱼毒性大小。[方法]以斑马鱼为模式生物,采用半静态法对斑马鱼进行驯养和试验,测定Cu2＋、Cd2＋和Cr6＋对超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）活性影响。[结果]Cu2＋暴露1d胁迫斑马鱼SOD和CAT为诱导效应,胁迫POD为抑制-诱导-抑制效应,Cu2＋暴露7 d胁迫斑马鱼SOD为诱导效应,胁迫POD和CAT为抑制效应;Cd2＋和Cr6＋暴露1 d和7 d胁迫斑马鱼SOD和CAT均为诱导效应,胁迫POD为抑制效应。且暴露1 d和暴露7 d酶活性变化均显著。[结论]Cu2＋、Cd2＋和Cr6＋单一胁迫斑马鱼抗氧化系统酶活性变化显著,在短时间和低浓度暴露下,Cr6＋毒性作用最显著;在短时间中、高浓度暴露下,Cd2＋毒性作用最显著;长时间暴露时,Cu2＋毒性作用最强,可为重金属污染对水生生物毒性机理研究提供参考。     

两种季铵盐阳离子表面活性剂对水生生物的毒性效应

为评价两种季铵盐阳离子表面活性剂对水生态的安全性,运用评价化学品对水生生物毒性的标准试验方法,测定了十二烷基二甲基苄基氯化铵(1227)和双八、十烷基季铵盐(C8-10)两种季铵盐阳离子表面活性剂对3种水生生物(斜生栅藻、大型溞和斑马鱼)的毒性。结果表明,在0.05~0.5 mg.L-1的浓度范围内,1227、C8-10对斜生栅藻的毒性表现出明显的剂量-效应关系,随处理浓度的增大抑制效应增强,0.5 mg.L-1C8-10对斜生栅藻具有杀灭作用;同时1227、C8-10与斜生栅藻还存在时间-效应关系,处理后抑制率随时间呈先升高后下降的趋势,72 h时抑制率最高。1227和C8-10对斜生栅藻96 h的EC50分别为0.109、0.103 mg.L-1,对大型溞的48 h LC50分别为1.56×10-2、1.45×10-2mg.L-1,对斑马鱼的96 h LC50分别为2.36、2.19 mg.L-1。C8-10对3种水生生物的毒性均高于1227,两种季铵盐阳离子表面活性剂对大型溞和斑马鱼的致死率(LC50)均随作用时间延长逐渐减小。     

斑马鱼血管紧张素转换酶(ACE)的生物信息学分析

采用生物信息学方法对模式生物斑马鱼中的血管紧张素转换酶进行了系列预测分析.结果表明,斑马鱼中有两个ACE基因,它们所编码的蛋白分别由1 324和785个氨基酸组成,其中1个是酸性蛋白,在水中不稳定,没有信号肽,属线粒体跨膜蛋白;另一个为酸性水溶性稳定蛋白,有信号肽.它们均含保守的Pfam Peptidase_M2结构域,属于M2家族蛋白.通过ESTs搜索发现这两个基因在斑马鱼不同组织和不同发育期的表达情况存在较大的差异.同源性比对和系统发育分析表明,斑马鱼ACE蛋白与低等脊椎动物(红原鸡、热带爪蟾等)、高等脊椎动物(人、鼠等)的同源性较高,达60%以上,说明ACE蛋白在系统演化上比较保守.     

温度对斑马鱼胚胎发育的影响研究

观察了不同温度（22℃、24℃、26℃、28℃、30℃、32℃）下斑马鱼受精卵的死亡率、孵化周期、孵化率等指标的变化规律。结果表明：在22-28℃范围内,随温度升高,死亡率逐渐降低;在28-32℃范围内,随温度升高,死亡率逐渐增高,28℃为斑马鱼胚胎发育的最适温度。该研究结果为丰富硬骨鱼类繁殖生理学提供参考资料。     

斑马鱼CDKAL1基因的生物信息学分析

[目的]深入了解斑马鱼CDKAL1基因的结构特点。[方法]运用生物信息学方法对斑马鱼CDKAL1基因的基因序列、编码蛋白的理化性质、结构及功能进行分析。[结果]分析结果显示,此基因一部分存在于细胞质,并存在一个跨膜结构域,没有信号肽。该基因编码蛋白质的变异不大;含有3个功能结构域,均为Erk D-domain,分别位于L189L、384、V315;在Y292位置有一磷酸化位点;有UPF0004超家族、Radical SAM超家族和MiaB结构域3个保守结构域;在脑、肌肉、肾脏中表达。推测该基因表达的蛋白质可能是酶、异构酶或者中间代谢产物,与胰岛素受体的作用有关。[结论]该研究为今后进一步研究人类Ⅱ型糖尿病提供了科学依据。     

离子液体对靶标生物和非靶标生物AChE的影响

[目的]探究不同离子液体对靶标生物及非靶标生物体内酶活性的影响,明确其对靶标生物的毒杀作用及对非靶标生物的安全性.[方法]研究了3种离子液体对2种生物体内AChE活性的影响.[结果]溴化1-乙基-3-甲基咪唑对斜纹夜蛾AChE活性的影响在LC20浓度处理下呈抑制趋势,LC50浓度处理下呈先抑制后诱导的趋势;对斑马鱼肝脏AChE活性的影响在LC20浓度处理下呈始终抑制趋势,在LC50浓度处理下呈诱导-抑制-诱导的趋势.溴化1-丁基-3-甲基咪唑对斜纹夜蛾AChE活性的影响在LC20浓度处理下呈先抑制后诱导的趋势,在LC50浓度处理下呈抑制趋势;对斑马鱼肝脏AChE活性的影响在LC20浓度处理下呈先诱导后抑制的趋势,在LC50浓度处理下呈抑制趋势.1,2-二甲基咪唑对斜纹夜蛾AChE活性的影响在LC20浓度处理下呈先抑制后诱导的趋势,在LC50浓度处理下呈先诱导后抑制的趋势;对斑马鱼肝脏AChE活性的影响在LC20浓度处理下呈抑制趋势,在LC50浓度处理下呈先抑制后诱导趋势.[结论]3种离子液体在斑马鱼和斜纹夜蛾体内的积累对2种生物体内AChE的活性均有不同程度的影响,改变生物体内神经信号的传导,导致生物体严重的行为改变、功能紊乱、瘫痪,从而产生毒害作用.