一株感染深水网箱养殖许氏平鲉的病原菌分离与鉴定

2016年7月,山东省长岛县深水网箱养殖许氏平鲉(Sebastes schlegeli)暴发严重皮肤溃疡症。作者对病鱼进行病原菌分离。通过形态学观察、常规生理生化试验、gyrB和16S rDNA基因克隆测序等方法对分离菌株进行鉴定。在病灶溃疡处分离到一株绝对优势菌BZ01,该菌株在TSB固体培养基上呈半透明菌落,在TCBS选择性培养基上菌落呈绿色。透射电镜观察为短棒状,具有单根极生鞭毛。人工回接感染证明,该菌株对许氏平鲉具有较强的致病力,可以引起皮肤溃疡等症状,且与自然感染症状一致,其LD₅₀为2.07×10~6 CFU/ml。通过gyrB和16S rDNA基因序列测定并构建系统发育树显示,菌株BZ01与弧菌属同源性最高,并在系统发育树中与轮虫弧菌(Vibrio rotiferianus)聚为一枝,结合形态及生理生化表型测定结果,将该菌株鉴定为轮虫弧菌(V.rotiferianus)。药敏试验结果显示,该菌株对四环素类、喹诺酮类、香豆素类、肽酰转移酶类高度敏感,而对大环内酯类、多肽类、磺胺类、β-内酰胺类、氨基糖苷类中度敏感或不敏感。     

刺参响应灿烂弧菌侵染差异microRNAs鉴定及靶基因分析

microRNA参与基因的转录后调控,在真核生物的生长发育、细胞分化和免疫防御等过程中发挥重要作用。刺参(Apostichopus japonicus)病害问题已成为产业发展的主要限制因素之一,而其病害发生的分子机制尚待进一步完善。本研究以刺参重大疾病“腐皮综合征”的重要致病原灿烂弧菌(Vibrios splendidus)为侵染菌株,通过人工侵染实验制备患病刺参样本,采用miRNA-seq技术对侵染组(PT16S)和对照组(PT10H)各3头刺参的体壁组织进行miRNA测序,通过相关生物信息学软件对miRNAs进行鉴定和分析,筛选差异表达miRNAs (DEmiRNAs)并预测其靶基因,构建关键调控途径的miRNA-mRNA调控网络。结果显示,PT10H组平均得到5 902 588条有效序列,194个已知miRNA和19个新的miRNA;PT16S组平均得到5 053 529条有效序列,182个已知miRNA和42个新的miRNA。对2组鉴定到的miRNA进行差异表达分析,共筛选到2个上调和11个下调的具有显著差异的DEmiRNAs (P≤0.05),上调的DEmiRNAs靶基因预测结合到3010个靶基因,注释到585个GO terms及24条信号通路(P≤0.05),下调的DEmiRNAs靶基因预测到19 072个靶基因,注释到514个GO terms以及22条信号通路(P≤0.05)。对筛选到的DEmiRNAs进行实时荧光定量PCR (qRT-PCR)验证,显示miRNA-seq与qRT-PCR的一致率达到70%。根据KEGG分析结果构建泛素介导的蛋白水解途径和Notch信号通路的miRNA-mRNA调控网络,结果显示,13个DEmiRNAs分别靶向结合134个与泛素介导的蛋白水解相关的mRNAs和109个与Notch信号通路相关的mRNAs,Aja-miR-184、Aja-miR-2478和Aja-miR-9277p等DEmiRNAs可能参与对Notch信号通路和对泛素介导的蛋白水解的调控。相关研究结果将为刺参疾病发生调控网络建立和机制解析提供依据。     

刺参响应灿烂弧菌侵染的基因组DNA甲基化水平和转录组差异及其关联分析

为探讨病原菌胁迫下刺参(Apostichopus japonicus)基因组DNA甲基化水平和转录组表达的差异,本研究采用人工攻毒侵染胁迫,获得刺参化皮体壁组织,并以未攻毒组的健康体壁组织为对照,对刺参2种体壁组织进行全基因组甲基化测序(WGBS)和转录组高通量测序,解析刺参体壁基因组DNA甲基化差异,筛选响应病原胁迫的差异甲基化区域和差异表达基因。同时,通过基因组甲基化和转录组联合分析,筛选负相关关联基因,为解析刺参响应灿烂弧菌(Vibrio splendidus)侵染的分子机理提供基础数据。结果显示,刺参对照组和侵染组基因组总甲基化水平分别为(3.59±0.04)%和(3.87±0.27)%,侵染组甲基化水平显著升高;在发生甲基化的位点中,攻毒组和对照组的mCpG占比分别为83.06%和81.91%,mCpG为最主要的甲基化形式。本研究共筛选出差异甲基化区域(DMRs) 626 677个,注释到23 706个功能基因。转录组测序共检测到29 290个基因,筛选到差异表达基因496个,其中,上调基因214个,下调基因282个。在基因组甲基化与转录组的关联分析中,筛选到180个负相关关联基因,其中,差异甲基化区域位于启动子区域的负相关基因为60个。对负相关关联基因的GO和KEGG富集分析,筛选到相关通路和LRR、hsp20和CARD等关键基因。本研究将为解析刺参抗病的表观遗传调控机制提供数据,也为刺参抗病性状选育提供科学参考。     

基于gyrB基因的SYBR Green I实时定量PCR检测病原灿烂弧菌

灿烂弧菌Vibrio splendidus是多数海水养殖动物的主要致病菌,对养殖业危害较大。本研究根据灿烂弧菌gyrB基因的保守序列设计特异性引物,建立了SYBR Green I实时定量PCR检测灿烂弧菌的方法。构建含gyrB基因的重组质粒作为标准品,进行SYBR Green I实时定量PCR,在Tm为62℃时,扩增产物的熔解曲线仅有一个单特异峰,扩增所得标准曲线为y=-3.338x+37.67,相关系数为0.999,扩增效率为0.99,最低能检测到20个拷贝。实验结果表明,该检测技术具有较高的特异性、敏感性和重复性,对灿烂弧菌病的快速诊断和流行病学调查有重要意义。     

美人鱼发光杆菌美人鱼亚种dly基因缺失株构建及其生物学特性研究

美人鱼发光杆菌美人鱼亚种(Photobacterium damselae subsp. damselae, PDD)是广泛分布于全球海洋环境中的一种致病菌。本研究以实验室保存的一株高致病性PDD菌株(PDD1608)作为对象,初步探究毒力基因dly对PDD菌株的生物学特性和致病力的影响。利用λRed重组技术成功构建毒力基因dly缺失株Δdly PDD1608::Cm,比较野生株和缺失株的生长、涌动性、药物敏感性、生理生化特性、生物被膜形成能力、菌株及胞外产物(extracellular products, ECP)的溶血性和磷脂酶活性等生物学特性。选用海水青鳉鱼(Oryzias melastigma)作为实验动物,通过人工感染实验测定野生株和缺失株及其ECP对海水青鳉鱼的致病性。结果显示,毒力基因dly缺失后导致PDD菌株生长变慢,涌动性、溶血性和磷脂酶活性均降低;野生株和缺失株的药物敏感性和生理生化特性未产生变化;与野生株相比,缺失株的生物被膜形成能力有显著差异(P<0.05);人工感染实验表明,缺失株及其ECP对海水青鳉鱼的致病性降低。毒力基因dly影响PDD菌株的生长、涌动性、溶血性和磷脂酶活性等多种生物学特性,并且与PDD菌株及其ECP的致病力强弱密切相关。     

5种主要海水养殖病原菌多重微流控荧光定量PCR快速检测技术的建立

在养殖现场开展多病原的快速检测是水产养殖产业健康发展的重要技术需求之一。本研究选取哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)的vhhA基因、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的toxR基因、大菱鲆弧菌(Vibrio scophthalmi)的luxR基因、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)的empA基因和美人鱼发光杆菌美人鱼亚种(Photobacterium damselae subsp.damselae)的Mcp基因作为靶基因,设计特异性引物,通过优化反应体系和条件,并在微流控芯片进行集成,建立了可同步检测这5种病原菌的多重微流控荧光定量PCR检测技术。结果显示,本研究所建立的检测技术最佳反应体系：2×Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix 5μL,Primer F/R各1μL,DNA模板2μL,ddH2O 1μL。反应条件为95℃30 s,95℃5 s,61℃30 s,扩增30个循环。通过绘制标准曲线发现,在10⁹～10⁴ copies/μL浓度范围内均有良好的线...     

刺参养殖池塘中新敌害生物澳洲异尾涡虫的鉴定及其危害

为了对导致辽宁大连、山东东营的2家养殖场池塘养殖刺参大量化皮死亡的新的敌害生物进行鉴定并确定其对养殖刺参的危害。本实验通过形态学观察、分子鉴定及系统发育分析确定了涡虫的分类地位,通过生态学方法确定了其生态适应条件,通过切割后培养的方法观测了其再生能力,通过与刺参苗种的共培养实验测试了该物种对刺参的危害及其危害方式。形态学观察结果显示,该涡虫体长0.96～3.26 mm,体宽0.49～1.93 mm,外观黄色或黄褐色,头部钝圆,具一对暗红色棒状眼点,尾部具两条并列的尾垂;显微镜镜检发现其表皮下分布密集的虫黄藻,体表周生纤毛,雌雄同体,口后具有两个生殖孔;对该物种COⅠ及18S r DNA基因片段扩增测序结果进行分析,并构建基于18S rDNA基因的系统发育树,结果显示该生物与澳洲异尾涡虫序列同源性达99.64%,根据其形态学特征,并结合18S rDNA分子鉴定结果,将该生物鉴定为澳洲异尾涡虫;进一步对其生活习性进行了研究,结果显示,该生物具有避光性,其适宜温度为18～24°C,适宜pH为5.5～8.0,适宜盐度为20～40;再生实验表明,该物种具有很强的前后轴极性再生能力;该生物与刺参的...     

金乌贼幼体弧菌性坏死病的病原、组织病理特征和药物敏感性

对青岛市黄岛区人工繁育金乌贼(Sepia esculenta)苗种大规模坏死病进行了病原、组织病理、传播途径和防控药物研究。发病金乌贼幼体不摄食,生长缓慢,体色发黑;体表、肌肉、口腕、触腕及内脏团大面积溃烂,死亡率高达90%;组织病理学显示:患病金乌贼皮肤色素细胞崩解,肌丝断裂,鳃丝崩解,肝细胞大量坏死脱落,肠道微绒毛脱落;从患病金乌贼分离出3株优势菌(SE-A、SE-B和SE-C),人工感染实验表明,SE-B、SE-C对金乌贼半数致死量分别为3.98×10~6 CFU/mL和8.91×10~5 CFU/mL,有较强致病力,为该病的致病菌;根据细菌形态、生理生化和16S rDNA序列分析将SE-B和SE-C鉴定为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和塔氏弧菌(Vibrio tubiashii)。分析金乌贼幼体、育苗用水和生物饵料糠虾的病原菌来源、分布和优势度,发现致病菌主要由糠虾携带进入育苗系统。分析了2株致病菌的药物敏感性,SE-B对强力霉素和氟苯尼考等敏感,对链霉素、庆大霉素等耐药;SE-C对氟苯尼考和罗美沙星等敏感,对新霉素和克拉霉素等耐药。     

过硫酸氢钾干预下对虾养殖系统中水质指标和菌群结构变化分析

摘要：该文通过水质理化因子监测、虾体和水体中可培养细菌和弧菌检测及高通量测序方法,系统解析过硫酸氢钾（PMS）干预下对虾养殖池塘水体环境指标和菌群结构的变化情况。结果表明：施用0.2 g/L PMS对对虾养殖水体中低含量氨氮也具有一定改善作用,泼洒PMS 24h和72h后的水温、溶解氧、pH、盐度、亚硝酸盐无显著差异。PMS泼洒后对虾肝胰腺内可培养细菌和弧菌数量分别由3.13×106 CFU/g和1.98×106 CFU/g降低至4.30×105 CFU/g和1.09×105 CFU/g,弧菌占比由63.36%降低至25.35%;水体中可培养细菌和弧菌数量分别由2.70×104 CFU/mL和6.00×103 CFU/m降低至8.50×103 CFU/mL和1.20×103 CFU/mL,弧菌占比由22.22%降低至14.11%,PMS可显著降低虾体和水体中可培养细菌数量及弧菌占比。对水体菌群结构进行高通量测序分析表明,放线菌门、拟杆菌门、蓝藻门和变形菌门为主要优势菌门,泼洒PMS前后（PB1/PA1）,腈基降解菌科、PeM15、DS001、Llumatobacteraceae、微杆菌科、红细菌科相对丰度显著升高（P<0.05）,巴纽尔斯菌科、腐螺菌科、Stappiaceae相对丰度显著降低（P<0.05）,对比泼洒PMS前后3天的变化趋势表明,泼洒PMS后池塘优势菌相对丰度发生显著变化且菌群结构PCoA指数偏离度较低。相关研究结果为评判PMS在水产养殖中的防控作用及其科学使用提供数据支撑。     

对虾肝胰腺坏死病副溶血弧菌双重微流控荧光定量PCR快速检测技术的建立与应用

急性肝胰腺坏死病(AHPND)是对虾养殖过程中最常见、最严重的疾病,给对虾养殖造成重大经济损失。AHPND病原种类多、基因型复杂,现有的针对不同病原的检测技术目标导向较弱、检测成本高、时间消耗长,对虾健康养殖亟待开发AHPND的精准快速诊断技术。本研究针对AHPND病原体携带编码一种二元毒素pirA和pirB大型质粒的遗传共性,基于pirA和pirB基因设计特异性引物并建立微流控荧光定量PCR检测方法。该方法对致病基因pirA和pirB特异性强、灵敏度高,最低检测限分别为5.43×10⁰和4.31×10¹ copies/μL,样品平均检测时间为26min左右。为进一步评估该方法在实际应用中的准确性,以含有pirA和pirB毒性质粒的副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)进行人工感染实验。结果表明,感染后的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)鳃丝、肝胰腺、肠道和肌肉等组织随时间的推迟均能检测到pirA和pirB;从感染2h的结果来看,pirB比pirA检出率更高。此外,致病因子pirA和pirB比toxR...