桑果qRT-PCR候选内参基因的表达稳定性评估

桑果是药品和功能性食品研发的重要原料.近年来针对桑果发育和调控的研究多有报道,但所选用的内参基因并不统一.利用qRT-PCR方法,对9个候选内参基因在感染菌核病和处于不同发育阶段的桑果样品中的表达稳定性进行评估.通过geNorm、NormFinder和BestKeeper等3种统计软件的评估分析,发现在感染菌核病的桑果中GST1和Tub是表达最稳定的基因,而eIF-5α和60S是表达稳定性最差的基因;在不同发育阶段的桑果中,GST1和UBQ是表达最稳定的基因,而60S和eIF-5α的表达稳定性最差.综合分析认为,桑果发育和菌核病研究中应选择GST1作为qRT-PCR内参基因.     

慢病毒载体介导的稳定表达eIF5A细胞系的建立及其对猪繁殖与呼吸综合征病毒增殖的影响

本研究旨在通过慢病毒载体构建稳定表达真核翻译起始因子5A(eukaryotic translation initiation factor 5A,eIF5A)的MARC-145细胞系并验证该细胞系对PRRSV感染的影响。全基因合成eIF5A序列，双酶切后构建慢病毒表达载体pLV-CMV-MCS-EF1a-Puro。将该载体和慢病毒包装质粒psPAX2与包膜蛋白质粒pMD2.G共转染HEK293T细胞，包装得到能表达eIF5A的慢病毒。将慢病毒转导至MARC-145细胞，经过嘌呤霉素筛选、细胞有限稀释法获得能稳定表达eIF5A的MARC-145细胞系。MTS试验证实构建的细胞系细胞活力无显著变化，病毒TCID₅₀测定、实时荧光定量PCR、蛋白质免疫印迹和间接免疫荧光技术检测eIF5A稳定表达对PRRSV滴度、PRRSV N基因及N蛋白表达的影响，发现MARC-145-eIF5A细胞系能显著促进PRRSV的增殖。本研究成功构建了稳定表达eIF5A的细胞系MARC-145-eIF5A,PRRSV感染试验证实体外稳定表达eIF5A可以促进PRRSV在MARC-145细胞的...     

日粮能量水平对乌金猪肌肉组织蛋白质翻译起始因子基因表达的影响

试验旨在研究日粮不同能量水平对乌金猪肌肉组织蛋白质翻译起始因子基因表达的影响。选取健康、体重约15 kg的乌金猪54头,随机分为3组,每组3个重复,每个重复6头猪。各组猪饲喂不同能量水平的日粮（11.84、12.97、14.18 MJ/kg）,试验分15～30、31～60、61～100 kg 3个阶段。各阶段换料过渡期为7 d,分别于猪30、60、100 kg时分批屠宰。结果显示,高能量水平日粮可降低猪的瘦肉率和肌肉粗蛋白含量,增加肌内脂肪含量,降低蛋白质翻译起始因子基因的表达。屠宰体重为30 kg时,低能量组猪的真核起始因子-2B(eIF-2B)、真核起始因子-4E(eIF-4E)表达水平显著高于高能量组（P<0.05）,真核起始因子-4B (eIF-4B)基因表达量显著高于中能量组（P<0.05）。屠宰体重为60 kg时,高能量组和中能量组猪的eIF-2B、eIF-4B、eIF-4E表达水平显著低于低能量组（P<0.05）。屠宰体重为100 kg时,高能量组猪的真核起始因子-4A (eIF-4A)的相对表达水平显著低于低能量组和中能量组（P<0.05）,低能...     

植物响应重金属胁迫的蛋白质组学研究进展

重金属对生态系统造成的污染已成为全球关注的问题。植物对重金属的摄取不仅影响其正常生长,并能通过食物链来威胁人类及整个生态系统的健康。在mRNA水平上的基因表达分析,增强了人们对植物响应重金属的理解。然而,关于相关功能基因组翻译方面的问题仍未得到有效解决。通过分析鉴定相关响应基因和功能蛋白,获取翻译及翻译后水平上的信息,能为植物响应重金属胁迫提供更深层次的理解。本研究分析比较了近年来重金属胁迫蛋白组学研究技术,综述了植物响应重金属胁迫的蛋白组学研究进展,探讨从亚细胞蛋白组学水平解析植物解毒重金属过程的可能性,并提出未来该研究方向所面临的挑战及应对策略,为揭示植物与重金属相互作用的分子机制提供有效方法。     

绵羊WNT5A基因克隆及其组织表达分析

WNT5A(Wnt family member 5A)参与了多种细胞的增殖、凋亡和分化等生物学过程,在乳腺形态发生、毛囊发育等方面发挥了重要作用。该试验利用RT-PCR获得绵羊WNT5A基因的CDS区,分析WNT5A蛋白的结构特征并利用RT-qPCR检测WNT5A基因在9个组织中的表达情况。绵羊WNT5A基因的CDS区全长1062 bp,编码353个氨基酸。该蛋白的二级结构主要以α-螺旋和无规则卷曲为主,β转角、延伸链贯穿于整个蛋白质结构中。String分析结果表明,WNT5A与卷曲蛋白受体、低密度脂蛋白相关蛋白和受体酪氨酸激酶有相互作用。RT-qPCR研究结果表明,WNT5A基因表达具有组织特异性及品种特异性。WNT5A基因在绵羊心脏、肝脏、肺脏、脾脏、肾脏、卵巢、背最长肌、乳腺和皮肤9个组织中均广泛表达,其中在皮肤中的表达量高于其他组织(P<0.05),而在脾脏中表达量较低。它在甘肃高山细毛羊皮肤、乳腺、背最长肌、肾脏、肺脏、脾脏和肝脏中的表达量高于小尾寒羊(P<0.05),而在甘肃高山细毛羊卵巢中的表达量低于小尾寒羊(P<0.05),在心脏中该基因的表达量无差异(P>0.05)。该结果为深入研究绵羊WNT5A基因的功能提供了重要依据,同时也丰富了绵羊基因组内容。     

外源基因在甲醇酵母Pichia pastoris中的表达策略

甲醇酵母Pichia pastoris表达系统是近几年发展起来的一个真核表达系统，在其乙醇氧化酶基因启动子的控制下，某些外源基因的表达量可达克／升以上。虽然该系统是一种优良的表达系统，但有许多因素影响外源基因在其中的表达，包括外源基因的拷贝数及其整合到酵母染色体的位置和方式、mRNA的5′和3′端非翻译区、转录起始密码子的上下文、外源基因A＋T的组成与转录和翻译的阻断、密码子的偏爱性、信号肽序列的特性、产物的稳定性、宿主菌的生理特性、培养基成份和培养条件等。在应用该表达系统过程中，这些因素均需予以考虑。本文就这些因素作了概述和讨论，有利于提高外源基因在该系统中的表达水平。     

家蚕Poly(A)结合蛋白基因BmPABP的克隆及序列与功能分析

Poly(A)结合蛋白[Poly(A)-binding protein,PABP]是广泛存在于真核生物细胞内的一类高保守性蛋白,通过与Poly(A)的结合形成翻译起始复合物调节mRNA的稳定性和翻译效率。利用RT-PCR方法克隆了家蚕Poly(A)结合蛋白基因Bm-PABP,该基因含有4个外显子,开放阅读框(open reading frame,ORF)长度为1 812 bp,编码603个氨基酸,具有4个典型的RNA识别模体(RNA recognization motif,RRM)和1个保守的C末端结构域。基因芯片数据分析显示,BmPABP在家蚕5龄第3天幼虫各组织以及5龄第4天至化蛾阶段具有高水平的转录表达。构建基于家蚕Actin4启动子的瞬时转染载体pSLA4-Bm-PABP,将其与携带有荧光素酶报告基因的pSLA4-LUC质粒分别按1∶1和2∶1的摩尔比混合后共转染昆虫Sf9细胞,于转染后72 h检测荧光素酶活性,结果显示荧光素酶的活性较对照分别提高了11.9倍和7.5倍。研究结果初步证实了BmPABP具有促进目的基因表达的功能,同时提示利用BmPABP有望提高外源基因在转基因家蚕中的表达水平,可应用于家蚕生物反应器研究。     

伋牛磺伋酸对伋M伋srA敲伋除小伋鼠伋心脏伋氧化伋应激的保护作用

在不同病理生理情况下，牛磺酸具有有效的抗氧化作用。之前报道过敲除蛋氨酸硫氧化物还原酶A基因的小鼠出现了心肌细胞机能障碍及线粒体损害。在本研究中，通过对蛋氨酸硫氧化物还原酶A基因敲除小鼠给予牛磺酸治疗与不给予牛磺酸治疗，来探讨牛磺酸对心脏的氧化应激的保护作用。通过细胞检测分析技术测定受试动物的心肌细胞收缩性和Ca2+动态变化，通过高分辨率超声心动图监控其在体心脏功能。数据表明，与同龄野生对照组小鼠比较，8月龄的蛋氨酸硫氧化物还原酶A基因敲除小鼠显示了其心脏机能障碍逐渐加重，且心脏的射血分数（EF）和缩短分数（FS）显著降低。但是当蛋氨酸硫氧化物还原酶A基因敲除小鼠经过5个月的饮食补充牛磺酸后，其心脏机能障碍被改善。本试验进一步研究了牛磺酸对心脏保护作用的细胞机理。数据表明，经过牛磺酸治疗的蛋氨酸硫氧化物还原酶A基因敲除乳鼠的心肌细胞的细胞收缩性提高，能更好地适应氧化应激。此外，牛磺酸处理显著降低了蛋氨酸硫氧化物还原酶A基因敲除小鼠线粒体蛋白质氧化水平，表明牛磺酸对心脏线粒体具有抗氧化作用。研究表明，长期饮食补充牛磺酸有益于那些对环境氧化应激敏感的心脏。     

绵羊NYD-SP27基因真核表达载体的构建及表达

为了构建绵羊NYD-SP27基因重组真核表达载体,进一步研究该基因的功能,试验根据GenBank中公布的绵羊NYD-SP27基因序列设计引物,克隆绵羊NYD-SP27基因,将其连接至真核表达载体pmcherry-n1中,在目的基因和红色荧光蛋白之间通过猪捷申病毒2A肽(P2A)连接以实现共表达,将重组质粒pmcherry-Flag-NYDSP-P2A转染至HEK-293FT细胞中,48 h后通过荧光显微镜可观察红色荧光,构建NYD-SP27真核表达载体成功。结果表明:重组质粒pmcherry-Flag-NYDSPP2A在HEK-293FT细胞中得以表达;P2A在NYD-SP27蛋白和红色荧光蛋白翻译过程中已起到自我剪切的作用。     

植物CYP450家族研究进展

植物细胞色素P450(Cytochrome P450,CYP450s)是超基因家族编码的单加氧酶,参与植物体内的多种代谢反应,在植物生长发育及胁迫响应调节机制中具有重要作用。目前,关于植物CYP450s的研究主要集中在模式植物、农作物和药用植物,对牧草中CYP450s的研究鲜有报道。综述了CYP450s家族基因的分类、结构特点和功能等,为深入研究CYP450s家族基因的分子机制提供参考,并为牧草CYP450s相关研究提供借鉴。     

猪细胞周期蛋白A基因的克隆及其功能研究

本研究旨在克隆猪细胞周期蛋白A基因(CyclinA),并在猪脐静脉血管内皮细胞(SUVEC)中表达,以验证其功能。以人的CyclinA基因为信息探针,经电子克隆得到猪CyclinA基因,通过RT-PCR和DNA测序验证电子克隆结果并对其作生物信息学分析,用RT-PCR、Westernblot研究它在SUVEC中的表达情况。应用激光共聚焦显微镜分析它在细胞中的亚细胞定位,并通过流式细胞仪分析细胞周期以及用MTS法测定细胞的增殖能力。结果如下:核酸测序证明RT-PCR产物同电子克隆结果相符。该cDNA包含1299bp的完整开放阅读框(ORF),共编码432个氨基酸,经NCBIBLAST分析,该基因定位于猪的8号染色体上。Westernblot结果显示CyclinA基因编码蛋白的相对分子质量大小约为40ku,亚细胞定位研究表明该蛋白定位于细胞核中。经流式细胞仪分析表明稳定表达该基因的细胞,其G1期的细胞数量比对照组细胞增加了15%～20%,而S期的细胞数量比对照组细胞减少了约18%;MTS法检测显示细胞株SUVEC-CycAGFP的增殖活性明显高于对照组细胞。作者成功克隆到新基因猪源细胞周期蛋白A,并验证了其生物学功能,为今后开展病毒感染对猪细胞周期蛋白A影响的研究奠定了基础。     

猪生长激素基因的克隆及在哺乳动物细胞中的表达

应用RT—PCR技术克隆了猪生长激素(pGH)cDNA，该基因编码蛋白的信号肽序列与已有报道的pGH基因存在2个氨基酸残基的差异，而成熟肽却无差异。将pGHcDNA定向插入真核表达载体VRl020，构建了重组真核表达质粒VpGH；利用脂质体法转染哺乳动物细胞COS7，对转染后的COS7细胞进行RT—PCR、ELlSA和免疫荧光分析，分另1在转录和翻译水平证实了目的基因在COS7细胞中得到正确转染表达。     

SLC24A5基因影响脊椎动物色素沉积的研究进展

黑色素广泛分布于细菌、真菌、植物和动物体内并扮演了重要的作用。人类浅色皮肤的色素沉积是由于黑色素细胞内黑色素小体数量、大小和密度的减少造成的,而黑色素小体变化也导致斑马鱼由灰色突变为金色,这个金色突变位点编码一个推定的阳离子交换体SLC24A5基因,该基因位于黑色素小体或其前体的细胞膜上。人类和斑马鱼在这个基因的序列及功能上有很高的同源性。该基因的多态性主要出现在非洲和东亚人身上。而等位基因固定在欧洲人的身上,这与局部杂和性大量减少和较浅的皮肤色素沉积有关,表明SLC24A5基因在人类色素沉积方面起关键作用。作者总结了SLC24A5基因与黑色素的研究进展,并简要介绍了乌骨绵羊的发现及其分子特征。     

野生大豆盐胁迫响应基因GsPIP的克隆及其序列分析

盐胁迫是影响植物生长、发育以至产量的重要因素,野生大豆是优良的非生物胁迫抗性材料,是天然的优质抗性基因库.本研究以耐盐东北野生大豆为试材.利用东北农业大学植物生物工程研究室已获得的基因芯片杂交结果,对植物生物工程研究室构建的野生大豆盐胁迫EST数据库中各EST在胁迫下的表达情况进行了分析,从中选出了1个在高盐、低温、干旱胁迫早期均上调表达的3'-EST,序列分析表明该EST编码质膜结合蛋白(plasma membrane intrinsic protein,PIP),属于主嵌入蛋白(major intrinsic protein,MIP)家族;通过电子克隆和改进的5‘-RACE获得了基因完整的编码区;其翻译产物与含羞草质膜结合蛋白的相似性为90%,将该基因命名为GsPIP.GsPIP基因的翻译产物具有主嵌入蛋白家族特征性的跨膜结构域,无信号肽,与已发现的植物PIP蛋白一致.本研究获得的基因具有自主知识产权,通过进一步的功能分析,可为耐渗透胁迫基因工程研究提供基因资源,并为植物耐渗透胁迫机理研究提供依据.     

牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的亚细胞定位研究

为深入研究牛病毒性腹泻病毒E_2蛋白的生物学功能,了解其在哺乳动物细胞中的亚细胞定位情况,采用RT-PCR扩增牛病毒性腹泻病毒Changchun184株E_2基因,将其克隆至真核表达载体pc DNA3.1/V5His A中,并进行酶切鉴定和测序分析,将构建的重组质粒pc DNA3.1/V5His A-E_2经脂质体介导转染至MDBK细胞。继续培养48h后,在激光共聚焦显微镜下观察E_2蛋白在细胞中的亚细胞定位情况。结果表明,E_2蛋白在细胞核与细胞质中均有表达,且绿色荧光呈点状均匀分布。该研究为进一步研究牛病毒性腹泻病毒E_2蛋白的相关功能奠定了基础。     

WOX转录因子家族研究进展

WOX转录因子家族是植物特有的一个转录因子家族,其特征序列是含有一个由65个氨基酸残基组成的同源异型结构域;根据系统进化关系,该家族转录因子可以划分为3支:远古支、中间支和WUS支。该家族基因最早从绿藻单起源,远古支是该家族中最古老的一支。已有的研究表明,该家族基因在植物发育关键时期,如胚的形成、干细胞稳定性和器官的形成过程中发挥重要调控作用。这些功能的发挥与他们能够促进细胞分裂或阻止未成熟细胞的提前分化密不可分。本文对近年来WOX基因家族的研究进展进行了总结,为深入研究WOX基因在植物生长发育调控以及逆境适应过程中的作用机制提供参考。此外,WOX基因在植物叶片发生、叶型发育等形态建成方面的关键调控作用,对提高作物地上部分的生物量,培育高产牧草新品种具有十分重要的指导意义。     

家蚕真核翻译起始因子3f基因结构与表达研究

在对家蚕5龄丝腺cDNA文库测序的过程中,发现一个编码家蚕翻译起始因子基因(eIF3f)的EST序列。利用电子克隆、3′RACE(3′rapid amplification of cDNA ends)方法克隆了家蚕eIF3f基因cDNA序列全长,命名为eIF3f(GenBank登录号为DQ868530)。家蚕eIF3f基因cDNA全长为1 009 bp,由870 bp的开放阅读框序列(openreading frame,ORF)、55 bp的5′端非翻译区序列(5′-UTR)和65 bp的3′端非编码区序列(3′-UTR)组成,编码289个氨基酸。氨基酸序列比较分析显示,家蚕eIF3f与其他物种的eIF3f都具有翻译起始功能所必需的JAB_MPN结构域。家蚕eIF3f基因组结构分析:该基因由5个外显子和4个内含子组成;5′调控序列存在E74A、DFD、DRI等多个潜在的转录因子结合位点,但没有TATA盒启动子序列。家蚕eIF3f基因的表达在不同组织和不同发育时期存在差异,eIF3f是一种负调控翻译起始因子。研究结果有助于进一步研究真核翻译起始因子的相关基因调控规律。     

戊型肝炎病毒RdRp基因真核表达质粒的构建及表达

目的 构建戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV )RdRp基因真核表达质粒,并检测其在PLC/PRF/5、A549和HepG2 3种细胞中的表达,为后续RdRp的研究提供实验依据.方法 利用RT-nPCR法从阳性HEV粪便中扩增RdRp基因片段,插入pcDNA3.0真核表达载体中,并在其3’端插入EGFP报告基因,构建融合表达质粒pcDNA3.0-RdRp-EGFP,脂质体法转染PLC/PRF/5、A549和HepG2细胞,荧光显微镜观察报告基因的表达,RT-nPCR检测RdRp基因mRNA的转录情况,Western blot检测RdRp蛋白的表达.结果 重组表达质粒经酶切鉴定和测序证实构建正确;RdRp基因和蛋白在A549和HepG2细胞中可高效、特异性表达.结论 成功构建了RdRp基因对真核表达质粒,并在A549和HepG2培养细胞中大量表达,为进一步研究RdRp在HEV复制过程中的功能奠定了基础.     

野生大豆盐胁迫响应基因GsPIP的克隆及其序列分析

盐胁迫是影响植物生长、发育以至产量的重要因素,野生大豆是优良的非生物胁迫抗性材料,是天然的优质抗性基因库。本研究以耐盐东北野生大豆为试材,利用东北农业大学植物生物工程研究室已获得的基因芯片杂交结果,对植物生物工程研究室构建的野生大豆盐胁迫EST数据库中各EST在胁迫下的表达情况进行了分析,从中选出了1个在高盐、低温、干旱胁迫早期均上调表达的3′-EST,序列分析表明该EST编码质膜结合蛋白(plasma membrane intrinsic protein, PIP),属于主嵌入蛋白(major intrinsic protein, MIP)家族;通过电子克隆和改进的5′-RACE获得了基因完整的编码区;其翻译产物与含羞草质膜结合蛋白的相似性为90%,将该基因命名为GsPIP。GsPIP基因的翻译产物具有主嵌入蛋白家族特征性的跨膜结构域,无信号肽,与已发现的植物PIP蛋白一致。本研究获得的基因具有自主知识产权,通过进一步的功能分析,可为耐渗透胁迫基因工程研究提供基因资源,并为植物耐渗透胁迫机理研究提供依据。