半胱氨酸对氧化损伤小鼠胚胎抗氧化能力的影响

为了进一步了解活性氧(ROS)、半胱氨酸(Cys)与胚胎体外发育之间的关系,通过H2O2建立小鼠胚胎氧化损伤模型,采用2’,7’-二氯荧光素二乙酸盐(DCHFDA)法测定胚胎内部ROS水平,半定量PCR法测定小鼠胚胎内部NADPH氧化酶基因的表达。结果表明:胚胎经不同浓度半胱氨酸处理后,0.4 mmol/L半胱氨酸处理组的4-细胞率和囊胚率都显著比对照组高(P0.05);氧化损伤胚胎经0.4 mmol/L半胱氨酸处理后,胚胎发育率显著高于H2O2处理组(P0.05);DCHFDA法检测发现,H2O2+Cys处理组的ROS水平显著比H2O2处理组低(P0.05);H2O2上调Nox3、Noxo1基因的表达(P0.05),半胱氨酸下调Nox3、Noxo1基因的表达(P0.05)。说明胚胎培养的最佳半胱氨酸添加浓度为0.4 mmol/L;半胱氨酸有效抑制NADPH氧化酶的活性,提高氧化损伤胚胎的抗氧化能力,利于胚胎发育。     

吡格列酮对MZT期小鼠胚胎发育阻滞的影响

本研究旨在了解活性氧(Reactive oxygen species,ROS)、发育阻滞与抗氧化物吡格列酮(Pioglitazone,PIO)之间的关系。试验分3组:对照组、H_2O_2处理组和H_2O_2+PIO处理组。通过H_2O_2建立小鼠胚胎氧化损伤模型,添加抗氧化物质PIO对胚胎进行氧化修复,DCHFDA测定胚胎内部ROS水平,半定量PCR测定母型-合子型胚胎内部相关母性效应基因和合子型基因的表达。结果表明:(1)1-细胞和2-细胞胚胎H_2O_2处理组的ROS水平明显比对照组和H_2O_2+PIO处理组的高(P0.05);(2)H_2O_2处理组的2-细胞向4-细胞过渡率明显比对照组和H_2O_2+PIO处理组低(P0.05),但各处理组之间1-细胞向2-细胞过渡率差异不显著(P0.05);(3)H_2O_2处理组的母性效应基因Hsf1、Zfp3612、Zp3和合子型基因Eif1-α、Zscan4d和Muerv-L的表达明显比对照组和H_2O_2+PIO处理组低(P0.05)。综上表明,氧化应激通过下调2-细胞胚胎母型效应基因和合子型基因表达,导致小鼠胚胎2-细胞发育阻滞,抗氧化物质吡格列酮可促进胚胎发育,有效克服胚胎体外2-细胞发育阻滞现象。     

甘氨酸对H_2O_2诱导氧化应激的小鼠胚胎抗氧化能力的影响

本实验旨在探究甘氨酸(Gly)对H_2O_2诱导氧化应激的小鼠胚胎抗氧化能力的影响。实验分为对照组、H_2O_2处理组和H_2O_2+Gly处理组,对照组胚胎不经H_2O_2处理培养于M16培养液中;其他2组胚胎均置于25μmol/L的H_2O_2中孵育30 min,然后,H_2O_2处理组和H_2O_2+Gly处理组分别在M16培养液和最佳浓度Gly的培养液中进行培养。通过2',7'-二氯荧光素二乙酸盐(DCHFDA)法测定胚胎内部的活性氧水平和巢式PCR法检测内源抗氧化酶基因的表达。结果表明:胚胎经不同浓度Gly处理后,4 mmol/L Gly处理组的4-cell发育率(P0.05)和囊胚发育率(P0.05)均高于对照组;氧化应激胚胎经4 mmol/L的Gly处理后,胚胎的4-cell发育率(P0.01)和囊胚发育率(P0.05)显著高于H_2O_2处理组;H_2O_2+Gly处理组的活性氧水平显著低于H_2O_2处理组(P0.05);Gly能上调CAT(P0.05)和SOD1(P0.01)基因的表达,而对SOD2基因的表达无影响(P0.05)。综上可知,添加Gly可以有效提高胚胎的抗氧化能力,在胚胎体外培养过程中添加Gly的最适宜浓度为4 mmol/L。     

WY14643对小鼠早期胚胎抗氧化损伤的影响

旨在研究WY14643对小鼠早期胚胎发育的影响,探讨WY14643对早期胚胎抗氧化损伤的机理。通过H2O2诱导建立胚胎氧化损伤模型,添加WY14643对胚胎进行体外培养,DCHFDA测定胚胎内部H2O2含量,分别用超氧化物歧化酶(SOD)和微量丙二醛试剂盒测定胚胎不同发育阶段SOD活性和丙二醛MDA含量,并观察后续胚胎发育情况。结果表明:(1)不同浓度WY14643处理2h后,0.1μmol·L-1 WY14643处理组4-细胞率、囊胚率显著高于其他各组(P<0.05);(2)经0.1μmol·L-1 WY14643和H2O2联合处理后,其胚胎发育率显著高于单独H2O2处理组和对照组(P<0.05);(3)DCHFD荧光检测发现,WY14643添加组胚胎内部H2O2水平显著低于其他各组(P<0.05);(4)经SOD、MDA检测,发现添加WY14643胚胎内部各时期SOD水平显著高于其他各组(P<0.05),MDA水平显著低于其他各组(P<0.05)。综上表明,氧化应激对早期胚胎发育是不利的,WY14643通过增加抗氧化酶SOD活性、降低脂质损伤等途径减少胚胎内部ROS,增加抗氧化能力,促进胚胎在体外更好地发育。     

活性氧对猪卵母细胞SUMO-1表达及其质量的影响

本研究旨在调查活性氧过氧化氢(hydrogen peroxide,H_2O_2)对猪卵母细胞体外成熟(in vitro maturation,IVM)过程中蛋白质类泛素SUMO-1表达及精-卵结合能力的影响。试验分为0(control)、10、50、75和100μg/mL H_2O_2处理组。利用Western blotting、流式细胞术、实时荧光定量PCR、Hoechst染色等方法检测猪卵母细胞体外成熟、蛋白质类泛素SUMO-1含量、细胞活力、凋亡基因mRNA表达、透明带(zona pellucid,ZP)溶解度和精子-卵母细胞结合的表达。结果表明,75μg/mL H_2O_2组与对照组、10和50μg/mL H_2O_2组比较卵母细胞体外成熟率及细胞活力显著降低;75μg/mL H_2O_2组与其他H_2O_2组相比ZP溶解时间显著延长,并减少了精子黏附在成熟卵母细胞透明带上的数量(P0.05)。在77和18 ku处出现SUMO-1蛋白标记,75μg/mL H_2O_2组与对照组、10和50μg/mL H_2O_2组比较SUMO-1蛋白含量显著降低(P0.05)。75μg/mL H_2O_2与对照组、10和50μg/mL H_2O_2组比较显著下调了Bcl-2基因,而Caspase-3基因表达与对照组和10μg/mL H_2O_2组比较显著升高(P0.05),50μg/mL H_2O_2与对照组和10μg/mL H_2O_2组相比显著上调了Bax基因水平(P0.05)。综上所述,H_2O_2能调控猪卵母细胞体外成熟过程中类泛素化水平以及精-卵结合能力。     

肉牛肌肉细胞的分离培养和鉴定及其氧化应激模型的建立

本研究采用组织块法分离培养获得肉牛肌肉细胞并进行鉴定,利用过氧化氢(H_2O_2)构建氧化应激模型,为深入研究氧化应激对肉牛肌肉生长发育和肉品质的影响机制提供技术支撑。选用体重为252 kg的利鲁(利木赞×鲁西黄牛)杂交公牛背最长肌,利用组织块培养法分离培养肌肉细胞。通过形态学观察、免疫荧光法及流式细胞仪等手段对细胞进行鉴定。采用不同浓度(0、50、100、150、200、250、300、350、400、450μmol/L)的H_2O_2处理细胞24 h,通过观察细胞形态、检测细胞存活率及氧化还原状态,筛选适宜作用浓度。然后利用该浓度H_2O_2处理细胞不同时间(0、0.75、1.5、3、6、12、24 h),通过分析确定适宜作用时间。结果表明:1)分离获得的细胞长势良好,形状细长,呈纺锤体形和梭形。免疫荧光法和流式细胞仪鉴定肌肉细胞的特异性蛋白(生肌决定因子1和配对盒基因7)均得到较高表达。2)视野内细胞数量随H_2O_2浓度升高逐渐减少,至450μmol/L时,细胞发生明显死亡现象。细胞存活率随H_2O_2浓度的升高显著降低,与0浓度H202处理相比,300μmol/L时降至65.4%(P0.05),450μmol/L时仅为6.7%(P0.05)。细胞活性氧(ROS)水平先略微降低后逐渐升高(P0.05),超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性先升高后逐渐降低(P0.05),丙二醛(MDA)和蛋白质羰基(PC)含量逐渐升高(P0.05),8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)含量先升高后降低(P0.05)。3)细胞存活率随300μmol/L H_2O_2处理时间的延长逐渐降低,与0 h相比,6 h降至61.2%(P0.05),12 h降至47.4%(P0.05),但在24 h时略有升高(P0.05)。随着处理时间的延长,细胞ROS水平先升高后逐渐降低(P0.05),SOD和CAT活性先升高后降低(P0.05),MDA、PC和8-OHdG含量均逐渐升高(P0.05)。综上所述,本研究通过组织块培养法分离培养获得较高纯度的肉牛肌肉细胞,并成功构建氧化应激模型,H_2O_2的适宜作用浓度和时间分别为300μmol/L和6 h。     

过氧化氢对成肌细胞的氧化损伤作用研究

旨在以体外培养的小鼠成肌细胞(C2C12)为研究对象,探讨氧化损伤可能的路径。本试验分为3个处理组,每个处理组6个重复。处理组分别为:对照组(Control),以DMEM培养基培养的细胞作为空白对照,培养24 h;吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(PDTC)组(PDTC),以每个孔1 mL的PDTC(20μmol·L^-1)孵育细胞24 h;H_2O_2组(H_2O_2),加入0.5 mmol·L^-1的H_2O_2处理细胞24 h。检测各组细胞的存活率、ROS水平与凋亡率,采用荧光定量PCR和蛋白免疫印记法检测细胞凋亡和自噬相关基因的表达以及NF-κB信号通路相关因子的表达。结果表明,与对照组相比,PDTC可显著提高细胞的总凋亡率(P<0.05),可显著上调细胞半胱天冬蛋白酶-3(caspase-3)、caspase-6、caspase-9的mRNA表达量以及caspase-3蛋白表达水平(P<0.05),显著上调Beclin 1的mRNA表达量和微管相关蛋白1轻链3(LC3)-II/I的值以及LC3-II蛋白表达水平(P<0.05),显著下调核因子kappa B副族1(p50)、B型白细胞/2型淋巴细胞样蛋白(Bcl-2)、v-rel禽网状内皮增生病病毒癌基因同源物A(RelA)和环氧合酶(Cox)-2的mRNA表达量以及NF-κB蛋白表达水平(P<0.05);H_2O_2可显著提高细胞的ROS水平和细胞总凋亡率(P<0.05),可显著上调caspase-3、caspase-6、caspase-8、caspase-9的mRNA表达量以及caspase-3蛋白表达水平(P<0.05),显著上调Beclin 1和LC3-II/LC3-I的mRNA表达量以及LC3-II蛋白表达水平(P<0.05),显著提高Bcl-2相关X蛋白(Bax)的mRNA表达量(P<0.05),显著下调p50、Bcl-2、RelA和Cox-1、Cox-2的mRNA表达量以及核因子kappa B(NF-κB)蛋白表达水平(P<0.05)。结果提示,H_2O_2会引起C2C12细胞的ROS升高,并且能够通过抑制NF-κB信号通路介导细胞凋亡和自噬的发生,这与NF-κB因子的特异性抑制剂PDTC的作用相类似。     

奶牛小肠上皮细胞氧化损伤模型的构建

本试验旨在构建奶牛小肠上皮细胞氧化损伤模型,为研究氧化应激状态下的肠道养分吸收机制提供平台和基础。采用不同浓度的H_2O_2(0、50、100、200、400、800μmol/L)处理奶牛小肠上皮细胞不同时间(2、4、6 h),用噻唑蓝(MTT)法测定细胞存活率,氯化硝基四氮唑蓝(NBT)法测定细胞内活性氧(ROS)含量,比色法测定乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性。结果表明:与对照组相比,200μmol/L H_2O_2作用奶牛小肠上皮细胞2 h的细胞存活率(64.03%)显著降低(P0.05),细胞内ROS含量和培养液中LDH活性显著上升(P0.05),细胞内SOD和GSH-Px活性均显著降低(P0.05)。综上所述,200μmol/L H_2O_2作用奶牛小肠上皮细胞2 h,可构建奶牛小肠上皮细胞氧化损伤模型。     

添加环格列酮对延边黄牛骨骼肌卫星细胞成脂转分化的影响

试验旨在探究过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARγ)激动剂(环格列酮)对延边黄牛骨骼肌卫星细胞成脂转分化的影响。试验分为4组:对照组(CON,不添加环格列酮)、CL组(5μmol/L环格列酮)、CM组(10μmol/L环格列酮)和CH组(20μmol/L环格列酮),利用不同浓度环格列酮处理骨骼肌卫星细胞96 h后,通过油红O染色法和甘油三酯的测定来验证脂滴的形成,并使用实时荧光定量PCR和Western blotting测定基因表达和蛋白质定量的变化来验证脂肪细胞的生成。甘油三酯测定和油红O染色显示,与对照组相比,添加环格列酮后,骨骼肌卫星细胞内有脂滴生成,且脂滴形成量和甘油积累量与环格列酮添加量呈正相关。实时荧光定量PCR和Western blotting结果表明,与对照组相比,环格列酮组显著增加了成脂转录因子PPARγ、CCAAT/增强子结合蛋白α(C/EBPα)和围脂滴蛋白-2(PLIN2)基因的表达,显著下调了成肌相关因子MyoD的表达(P0.05),且所有蛋白与基因表达趋势保持一致,表明环格列酮可以促进牛骨骼肌卫星细胞向脂肪细胞分化。     

嗜酸乳杆菌对氧化应激仔猪小肠上皮细胞抗氧化能力和紧密连接蛋白表达的影响

本研究旨在探讨嗜酸乳杆菌对氧化应激仔猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)抗氧化能力及紧密连接蛋白-1(ZO-1)、闭锁蛋白(occludin)和闭合蛋白(claudin)蛋白表达的影响。首先将IPEC-J2分为9组,分别加入0(对照)、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8和2.0 mmol/L的过氧化氢(H_2O_2),每组6个复孔,根据细胞活力确定最佳H_2O_2浓度。然后根据结果选择1.2 mmol/L的H_2O_2建立氧化应激IPEC-J2模型,将细胞分为7组,分别加入为0(对照)、1.0×10~5、1.0×10~6、1.0×10~7、1.0×10~8、1.0×10~9和1.0×1010CFU/mL嗜酸乳杆菌,每组6个复孔,处理时间为24 h,分析嗜酸乳杆菌对氧化应激IPEC-J2抗氧化能力。最后选择1.2 mmol/L的H_2O_2建立氧化应激IPEC-J2模型,加入1.0×10~9CFU/mL嗜酸乳杆菌继续培养24 h,将细胞分为4组,分别是对照组(添加等量的磷酸盐缓冲液)、H_2O_2氧化应激组、嗜酸乳杆菌组、嗜酸乳杆菌组+H_2O_2组(先加入H_2O_2后加入嗜酸乳杆菌),每组6个重复,测定ZO-1、occludin和claudin蛋白的表达量。结果显示:1)与对照组相比,当H_2O_2浓度高于0.6 mmol/L时,细胞活力显著降低(P0.05)。与对照组和0.6～1.0 mmol/L H_2O_2组相比,当H_2O_2浓度处于1.2～1.8 mmol/L时,细胞活力显著下降(P0.05)。2)与对照组相比,当嗜酸乳杆菌浓度高于1.0×10~8CFU/mL时,细胞活力显著提高(P0.05)。3)在氧化应激条件下,随着嗜酸乳杆菌浓度的增加,细胞活力逐渐上升。与对照组相比,当嗜酸乳杆菌浓度低于1.0×10~7CFU/mL时,细胞活力显著降低(P0.05),当嗜酸乳杆菌浓度高于1.0×10~9CFU/mL时,细胞活力显著提高(P0.05)。4)与对照组相比,当嗜酸乳杆菌浓度高于1.0×10~6CFU/mL时,细胞中丙二醛(MDA)含量显著降低(P0.05),嗜酸乳杆菌浓度高于1.0×10~7CFU/mL时,细胞中超氧化物歧化酶(SOD)活性显著上升(P0.05),其他各组中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性较对照组显著升高(P0.05)。5)与H_2O_2氧化应激组相比,嗜酸乳杆菌组和嗜酸乳杆菌+H_2O_2组中细胞浆内ZO-1和occludin蛋白表达量显著降低(P0.05);与对照组和H_2O_2氧化应激组相比,嗜酸乳杆菌组和嗜酸乳杆菌+H_2O_2组中claudin蛋白表达量显著降低(P0.05)。由此可知,嗜酸乳杆菌能够促进细胞的生长,增强细胞的抗氧化能力,降低胞浆内紧密连接蛋白的表达量。