文心兰多倍体诱导及其鉴定

以类原球茎薄切片为外植体,用秋水仙素对离体薄切片再生类原球茎过程进行多倍体诱导,建立文心兰多倍体离体化学诱变技术体系。探讨了不同浓度的秋水仙素在不同诱变时间内对离体薄切片类原球茎形成及苗再生的诱变效应,比较了二倍体和多倍体试管苗的形态特征、叶片下表皮组织细胞结构特征,并对多倍体根尖细胞染色体数进行了鉴定。结果表明,秋水仙素对文心兰离体薄切片类原球茎的形成及其再生苗产生较大影响,较高浓度的秋水仙素处理较长时间时,形成类原球茎的薄切片比率及再生苗数减少明显,但多倍体形成的比率相对较高;多倍体苗叶片厚实、紧凑、植株较矮;叶片下表皮组织细胞、气孔结构与二倍体存在一定差异,细胞核明显较大,染色体加倍成功。     

四合木体细胞胚胎发生中细胞组织学的淀粉积累动态的研究

本文对四合木 (TetrenamongolicaMaxim)种子萌发 12d产生的无菌苗为外植体进行离体培养。通过在MS培养基上附加 2 ,4—D　 0 5mg/L ,6—BA　 0 1mg/L培养基上诱导愈伤组织和在分化培养基 2 ,4—D　0 2 5mg/L和 6—BA　 0 5mg/L培养过程中 ,组织切片观察结果表明 ,淀粉粒在体细胞胚胎发生过程中积累的变化 ,淀粉粒与体细胞发生过程有一定的消长关系     

仙客来愈伤组织的诱导及其抗褐变的研究

该试验以仙客来的叶片、叶柄、花梗为外植体,分别以MS为基本培养基,并添加了不同种类和浓度的植物生长激素,对其进行愈伤组织的诱导.另外,还初步研究了活性炭(AC)、VC、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和黑暗培养对仙客来外植体抗褐变的作用.结果表明,以叶片为外植体诱导效率最高,叶柄、花梗次之.叶片愈伤组织诱导的最适培养基为1/2MS 6-BA 2.0 mg/L 2,4-D 0.5 mg/L KT 0.25 mg/L;叶柄愈伤组织诱导的最适培养基是MS 6-BA 0.2mg/L NAA 2.5 mg/L;花梗愈伤组织诱导的最适培养基是MS 6-BA 0.2 mg/L 2,4-D0.5 mg/L.5种抗褐化处理方法中黑暗培养抗褐化效果最好.     

马蹄金叶片离体培养及植株再生的研究

在不同植物生长调节剂组合、不同培养基条件下,探讨了马蹄金叶片离体培养的方法和影响因素。结果表明,含不同植物生长调节剂组合的培养基对愈伤组织的诱导频率无显著影响,出愈率均达90%～100%;以MS或B5培养基作诱导愈伤组织的基本培养基效果较好;将叶片接种到MS 2mg/L6-BA的诱导培养基中诱导愈伤组织,再用B5 1.5mg/L6-BA 0.5mg/LZT 0.2mg/Lα-NAA作分化培养基出苗效果最佳,愈伤组织分化频率高达20%。     

南高丛蓝莓明星叶片不定芽再生技术研究

为建立南高丛蓝莓明星离体再生体系,以带腋芽嫩枝条为外植体试材,诱导腋芽萌发获得无菌材料的叶片为离体培养试验材料,研究了灭菌时间、不同浓度和种类的植物生长调节剂对外植体灭菌、不定芽的诱导和继代增殖培养的影响。结果表明：外植体最佳灭菌方法为75%酒精浸泡1Os,再用0.1%升汞溶液灭菌5-6min;腋芽萌发最适培养基为PM+2.0mg?L-1ZT;不定芽诱导最适培养基为WPM+0.5 mg?L-1TDZ+0.2 mg?L-1IBA;不定芽增殖培养最适培养基为WPM+2.5 mg?L-1ZT。     

马蹄金子叶的愈伤诱导与植株再生研究

以不同植物生长调节剂组合和不同基本培养基,探讨了马蹄金子叶离体培养的方法和影响因素.结果表明,不同植物生长调节剂组合的培养基对愈伤组织的诱导频率有显著影响,出愈率为16%～100%;以MS或B5培养基作诱导愈伤组织的基本培养基效果较好;将子叶接种到MS+1.0 mg/L 2,4-D+0.2 mg/L 6-BA的诱导培养基中诱导愈伤组织,再用MS+0.1 mg/L2,4-D+2.0 mg/L 6-BA+3.0 mg/L AgNO3作分化培养基出苗效果最佳,愈伤组织分化频率高达20.7%.     

马蹄金子叶的愈伤诱导与植株再生研究

以不同植物生长调节剂组合和不同基本培养基,探讨了马蹄金子叶离体培养的方法和影响因素。结果表明,不同植物生长调节剂组合的培养基对愈伤组织的诱导频率有显著影响,出愈率为16%～100%;以MS或B5培养基作诱导愈伤组织的基本培养基效果较好;将子叶接种到MS+1.0mg/L2,4-D+0.2mg/L6-BA的诱导培养基中诱导愈伤组织,再用MS+0.1mg/L2,4-D+2.0mg/L6-BA+3.0mg/LAgNO3作分化培养基出苗效果最佳,愈伤组织分化频率高达20.7%。     

唐古特白刺组织培养及其培养基筛选研究

本试验选用唐古特白刺幼嫩茎段和叶片作为材料,研究白刺不同外植体的离体培养技术及其适宜的培养基。结果表明,白刺带芽嫩茎是诱导丛生芽的良好外植体,恒温20℃以下,可有效降低白刺丛生芽初代培养污染严重的程度;叶片是诱导愈伤组织的良好外植体,且低浓度生长素2,4-D培养基较高浓度培养基形成的白刺愈伤组织致密,也不易褐化。白刺的最适增殖、壮芽培养基为MS+6-BA 2 mg/L+NAA 1.00 mg/L,而且是以腋芽形成丛生芽的方式进行增殖的;最适生根培养基是1/2 MS+KT 1 mg/L+IBA 0.5 mg/L;形成愈伤组织较好的培养基是MS+2,4-D 0.5～1.0 mg/L。     

狐狸尾兰原球茎快速繁殖问题研究

[目的]为狐狸尾兰的组培快繁提供依据。[方法]以狐狸尾兰种子作外植体,研究了不同诱导培养基、增殖培养基、生根培养基在狐狸尾兰组培快繁中的效果。[结果]诱导类原球茎体以MS附加6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L的激素配比较好,分化时间短。增殖培养基为MS+6-BA0-3.0mg/L+NAA0-0.2mg/L,以MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.1mg/L效果最好,平均增殖系数为3-8,把生长健壮并具有2-3片真叶的单个小芽,转接到生根培养基1/2MS+NAA1.0mg/L上,经60d培养,即可获得生长健壮的完整植株。狐狸尾兰试管苗的移栽基质以粗椰糠∶河沙=1∶1的比例混合较好,湿度80%-90%,移栽成活率达90%以上。[结论]狐狸尾兰种子在温度(25±2)℃,光照强度1500-2000lx,光照时间12h/d的条件下,最适诱导培养基为MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L;最适增殖培养基为MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.1mg/L,生根培养基为1/2MS+NAA1.0mg/L。     

白三叶×高加索三叶草F1代茎段离体培养器官发生的研究

以白三叶Trifoliumrepens×高加索三叶草T.ambiguum未成熟胚离体培养产生的F1代无菌苗的茎段为外植体,进行不定芽途径的直接器官发生培养。筛选适宜的诱导、分化及生根培养基,研究不同质量浓度激素组合对体细胞器官发生的影响,为建立扩繁体系及之后的回交试验奠定基础。结果表明:MS+2,4-D 0.1 mg/L、6-BA2 mg/L为适宜的诱导培养基,MS+NAA0.5 mg/L、6-BA1 mg/L、KT 1 mg/L为适宜的分化培养基,不添加任何激素的1/2 MS培养基为适宜的生根培养基。     

奇岗微繁技术建立及幼苗耐盐性评价

以奇岗茎段作为外植体,确定了最佳取材时期、诱导培养基、生根培养基和分化培养基等,成功建立了奇岗微繁技术体系,并研究了不同浓度NaCl对微繁苗生长速率和生物量的影响。结果表明：腋芽生枝途径微繁体系以5~6叶期茎段为外植体,在75%酒精喷洒表面后,1.0%次氯酸钠浸泡20 min时,污染率为0且出芽诱导率较高（85.2%）。当诱导和继代的MS培养基添加5.0 mg·L^-1 6-苄氨基嘌呤（6-BA）和0.25 mg·L^-1萘乙酸（NAA）时,出芽诱导率为84.0%,繁殖系数最高（320.3%）。生根培养基添加5.0 g·L^-1活性炭适合于生根壮苗培养。将试管苗炼苗后移栽到不同NaCl浓度的培养液中,随着NaCl的浓度增加,微繁苗生长速率呈降低趋势;在低于0.8%NaCl条件下奇岗能正常成活,表明微繁苗具有较高的耐盐性。为奇岗快繁、遗传转化体系构建和在盐渍化土地推广应用提供了理论和技术支持。     

马卵母细胞体外成熟的研究进展

随着全球马产业的发展,马发挥的经济价值越来越大。辅助生殖技术有利于发挥优良马匹的潜在价值。马卵母细胞体外成熟(IVM)是辅助生殖技术重要的组成部分,卵母细胞的获取是体外成熟的前提,切刮法能从离体卵巢中获得较多的马卵母细胞,而活体采卵技术(OPU)则能持续地获得卵母细胞,并能较好的保存马卵母细胞的发育能力。扩张型卵母细胞的成熟率高于紧密型卵母细胞,母马的年龄会影响到其卵母细胞的质量。马卵母细胞体外存放较长时间不会影响其发育能力,现在已有较为成熟的体系能使马卵母细胞在体外保存24 h以上而不影响其成熟率。在马卵母细胞成熟体系中常用的基础培养液是M199,添加胎牛血清(FBS)、促卵泡素(FSH)、促黄体生成素(LH)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)等物质能显著提高成熟率,常用培养环境为38~39℃,5%CO2饱和湿度下培养,培养时间30 h。成熟的卵母细胞有扩张的卵丘细胞和极体,且成熟的卵母细胞的细胞骨架及微管结构也会发生变化。本文针对马卵母细胞的采集和体外成熟培养的相关研究进行总结,重点阐述了不同采集技术的回收率以及影响马卵母细胞体外成熟率的关键因素,以期对今后马卵母细胞体外成熟的进一步研究及后期体外受精技术的发展提供借鉴与参考。     

牛体外胚胎冷冻保存的研究进展

体外胚胎冷冻保存技术是胚胎移植技术的重要组成部分,在辅助生殖技术中发挥重要作用,同时对种质资源保存、加强遗传改良和促进优质种源国际交流等方面具有重要意义。然而,体外胚胎冷冻过程中存在脂质含量过高、活性氧水平升高及机械损伤等问题,导致体外胚胎冷冻效率低,这极大地限制了体外胚胎冷冻保存技术的广泛应用。大量研究表明,通过去脂质、优化体外胚胎培养液、人工塌陷囊胚腔和优化冷冻程序等手段,可以有效提高冷冻后胚胎的存活率和发育能力。因此,本文概述了体外胚胎冷冻保存技术的研究进展和胚胎冷冻过程中存在的问题,总结了提高体外胚胎冷冻效率的方法措施,旨在为提高体外胚胎冷冻保存效率提供一定参考。     

The effect of insulin and relaxin upon mitosis (in vitro) in mammary tissue from pregnant and lactating pigs

The rate of cellular proliferation in the mammary glands of pigs during late gestation and lactation was assessed by measuring the incorporation of ³H-thymidine (T₁) into the DNA of mammary gland explants in vitro. The T₁ showed a linear response over the first 9 hr in vitro, and was not affected by the addition of 500 ng insulin/ml medium. From day 100 to parturition the T₁ rose, reached a peak at 2 d after parturition and declined during lactation to the lowest levels seen at day 21 of lactation.

The inclusion of 0–1000 ng relaxin/ml medium on T₁ at 24–72 hr in vitro had no effect in stimulating T₁ in mammary tissue explants taken from either pregnant or lactating pigs.     

菊苣组织培养与植株再生的研究

以菊苣叶片、茎段，花蕾和花瓣为外植体，进行离体培养试验，结果表明，叶片，茎段，花蕾可产生淡黄色的愈伤组织，并可诱导出不定芽，出愈率为100％，叶片和茎段的分化率为100％，诱导愈伤组织及分化的最佳培养基为：MS＋BA 2mg/L IBA0.3mg/L，生根培养基为：1／2MS＋NAA 0．1mg/L，生根率为100％。     

柠檬苦素对小鼠卵母细胞体外成熟及其体外受精胚胎发育的影响

【目的】研究柠檬苦素(limonin,Lim)对小鼠卵母细胞体外成熟(IVM)及后续体外受精(IVF)胚胎发育潜能的影响,旨在为体外成熟培养系统的优化提供参考。【方法】在小鼠体外成熟培养液中添加不同浓度的Lim(0、10、20、50 μmol/L),成熟培养12 h后统计小鼠卵母细胞第一极体(PBI)排出率,筛选体外成熟培养液中添加Lim的最适浓度;在体外成熟培养液中添加最适浓度的Lim,以0 μmol/L Lim为对照组,成熟培养12 h,通过免疫荧光染色检测活性氧(ROS)、谷胱甘肽(GSH)以及线粒体膜电位(MMP)水平;通过实时荧光定量PCR检测卵母细胞抗氧化及凋亡相关基因的mRNA表达水平。将最适Lim组及对照组卵母细胞体外成熟24 h后进行体外受精,于体外受精24 h和3.5 d分别统计胚胎卵裂率和囊胚率,并用Fluorescein-dUTP和Hoechst 33342染色分别检测囊胚总细胞数及囊胚内凋亡细胞比率。【结果】与0 μmol/L Lim组相比,20 μmol/L Lim组小鼠卵母细胞PBI排出率显著升高(P＜0.05),后续试验均用20 μmol/L Lim进行处理。与对照组组相比,20 μmol/L Lim组小鼠卵母细胞内ROS水平显著降低(P＜0.05),GSH、MMP水平均显著增加(P＜0.05),抗氧化相关基因(GPx3、CAT和Prdx3)、抗凋亡相关基因(Bcl-2、Bcl-xl)表达水平均显著上调(P＜0.05),促凋亡相关基因(Caspase-3)表达水平显著下调(P＜0.05);体外受精胚胎的卵裂率、囊胚率、囊胚总细胞数均显著增加(P＜0.05),囊胚内细胞凋亡比率显著下降(P＜0.05)。【结论】在体外成熟培养液中添加20 μmol/L Lim可以通过抑制氧化应激和细胞凋亡、增加MMP水平提高小鼠卵母细胞质量,从而提高体外受精胚胎的发育潜力。     

SIRT1对牦牛卵母细胞体外成熟与老化的影响

旨在探索SIRT1在牦牛卵母细胞体外成熟与老化过程中的作用。本研究在体外成熟液中分别添加SIRT1特异性激动剂SRT2104（SRT组）和特异性抑制剂Inauhzin（INZ组），牦牛卵丘卵母细胞复合体（COCs）体外培养24 h后，观察卵丘细胞的扩展和第一极体的排出情况；利用免疫荧光检测体外培养24与36 h后卵母细胞内的ROS水平；采用实时荧光定量PCR法检测体外培养24与36 h后卵母细胞内SIRT1、FOXO3a、SOD2以及Bax的表达水平；体外培养24与36 h后的牦牛卵母细胞进行体外受精，观察并统计其卵裂率与囊胚形成率。结果显示，体外培养24 h，SRT组的卵丘细胞扩展程度显著高于对照组（P<0.05），而INZ组的卵丘细胞扩展程度和第一极体排出率显著低于对照组（P<0.05）。随着体外培养时间的增加，卵母细胞内的ROS水平显著增加（P<0.05）；添加SRT2104能显著抑制卵母细胞中ROS水平的积累（P<0.05），而添加Inauhzin则显著上调卵母细胞内的ROS水平（P<0.05）。体外培养24 h后，SRT组SIRT1、FOXO3a与SOD2的表达水平显著高于对照组（P < 0.05），但Bax的表达水平显著降低（P<0.05）；INZ组的SIRT1、FOXO3a与SOD2表达均显著低于对照组（P<0.05），但Bax的表达水平显著上调（P<0.05）。牦牛卵母细胞体外培养24 h后，SRT组的卵裂率与囊胚形成率显著高于INZ组和对照组（P<0.05）；卵母细胞体外培养36 h后，INZ组的卵裂率和囊胚形成率显著低于其他组（P<0.05）。综上表明，SIRT1参与了牦牛卵母细胞的体外成熟，在体外培养液中适当添加SIRT1激动剂，有利于卵母细胞体外成熟及缓解老化，同时改善早期胚胎的发育能力。     

Culture of Piglet Intestinal Epithelial Cells in vitro and the Infectivity of Porcine Epidemic Diarrhea Virus on the Cells

The study was aimed to establish a simple in vitro culture system for piglet small intestinal epithelial cells,and to provide materials for researches on porcine epidemic diarrhea virus (PEDV).In this study,newborn piglets that did not eat colostrum were used as the initial donors,and the primary cells were separated in vitro by scraping the intestinal mucosa from the intestinal lumen and mechanical separation and dispersion.The piglet intestinal epithelial cells were purified using 0.1% trypsin differential digestion method.Compared the effects of newborn weak piglets and normal piglets as donors on the activity of primary intestinal epithelial cells.MTT method was used to compare the proliferation activity of primary cells of different generations.Immunofluorescence and Real-time RT-PCR were used to detect the infection and proliferation of PEDV strain CV777 in primary intestinal epithelial cells.The results showed that the isolation and culture method in vitro used in this study could obtain primary intestinal epithelial cells with good proliferation activity,with obvious S-type cell proliferation curves.The cells with high purity and single morphology could be obtained by differential digestion,and had good proliferation activity after five consecutive passages.The proliferative activity of intestinal epithelial cells isolated from weak piglets and normal piglets had no obvious difference,and provided new way for reducing the cost of primary cell culture.The results of immunofluorescence and Real-time RT-PCR showed that PEDV could infect the primary intestinal epithelial cells,and replicated and proliferated in them.In this study,we established a simple,practical and low-cost method for in vitro culture of piglet primary small intestinal epithelial cells.The primary cells cultured by this method could be used as basic materials for the isolation and culture of PEDV and related research.     

仔猪小肠上皮细胞的体外培养及猪流行性腹泻病毒对其感染性研究

本研究旨在建立一种操作简单的仔猪小肠上皮细胞体外培养体系，为猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）的相关研究提供材料。研究以未吃初乳的新生仔猪作为肠道供体，采用肠腔面刮取肠黏膜和机械分离分散的方式进行原代细胞的体外分离。采用0.1%胰蛋白酶差速消化法进行仔猪小肠上皮细胞的纯化；比较新生弱仔猪和正常仔猪作为供体对原代小肠上皮细胞活性的影响；MTT法比较不同代次原代细胞的增殖活性；免疫荧光和实时荧光定量RT-PCR方法检测PEDV毒株CV777在原代小肠上皮细胞感染和增殖情况。结果显示，本研究建立的体外分离培养方法能获得增殖活性良好的原代小肠上皮细胞，具有明显的"S"型细胞增殖曲线。通过胰酶差速消化可得到纯度高、形态单一的小肠上皮细胞，同时细胞连续传代5次仍保持良好的增殖活性。弱仔猪和正常仔猪分离培养的小肠上皮细胞的增殖活性比较显示，两者并没有明显区别，这为降低原代细胞培养的成本提供新的思路。免疫荧光和实时荧光定量RT-PCR结果显示，PEDV可感染本方法分离培养的仔猪原代小肠上皮细胞，并在其中进行复制增殖。本研究建立了一种操作简单、实用性强、成本较低的仔猪原代小肠上皮细胞体外培养方法，该方法培养的原代细胞可作为PEDV分离培养和相关研究的基础材料。     

猪精原干细胞体外分离培养及移植的研究进展

精原干细胞（spermatogonial stem cells,SSCs）位于睾丸曲细精管基底小室内,因其具有持续的自我更新能力和分化为精子的能力,被认为是雄性哺乳动物体内唯一能将自身遗传物质传递给后代的成体干细胞。对SSCs的研究已成为干细胞学科研究的热点之一,但目前SSCs的研究多集中于啮齿类动物,而猪SSCs（porcine SSCs,pSSCs）的研究进展相对落后,主要是由于存在以下几个问题：睾丸中pSSCs本身数量极少,且缺乏特异的分子标记;pSSCs的分离纯化技术仍不成熟;pSSCs体外培养体系仍不够完善。这些问题的存在导致pSSCs分离纯化效率低,并且难以在体外长期稳定培养及传代,以至于pSSCs的相关机理研究缺乏稳定的材料,为其体外研究及应用带来了不便。基于以上现状,文章总结了pSSCs体外分离培养及移植的研究进展,详细介绍了pSSCs的分子标记、分离纯化和体外培养的相关方法,以及pSSCs移植技术的研究现状,旨在为pSSCs研究提供参考,以期加快pSSCs在猪的遗传育种与繁殖领域以及男性生殖医学领域的研究和应用。