猪源牛病毒性腹泻病毒JLS-01株的分离鉴定及致病性研究

为了解猪源牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)的分子特征及致病性,本研究利用RT-PCR从吉林省某猪场出现严重腹泻症状的仔猪病料中检测到BVDV核酸阳性,将处理后的BVDV阳性样品接种于MDBK细胞,分离到1株病毒,命名为BVDV JLS-01。通过免疫荧光检测、5′UTR与Npro RT-PCR扩增对其分子进化特征进行分析。结果显示,该分离毒株在MDBK细胞上盲传至8代未出现细胞病变,在免疫荧光试验中呈阳性荧光信号。RT-PCR扩增获得大小分别为280和735bp的5′UTR和Npro片段。BVDV JLS-01株5′UTR与Npro序列遗传进化分析表明,其与LN-1和ZM-95亲缘性最近,与牛源毒株LN-1基因同源性达99.3%,提示该毒株可能来源于牛源毒株。将BVDV JLS-01株F8代细胞培养液人工感染BVDV和猪瘟病毒(CSFV)抗体阴性猪,感染猪未表现出明显的体温升高,但白细胞数量下降,并在感染猪的白细胞提取物中分离到该毒株,表明该毒株具有一定的致病性。该毒株的成功分离对进一步开展BVDV流行病学调查及致病机理等方面的研究具有重要意义。     

猪源牛病毒性腹泻病毒JLS-01株的分离鉴定及致病性研究

为了解猪源牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)的分子特征及致病性,本研究利用RT-PCR从吉林省某猪场出现严重腹泻症状的仔猪病料中检测到BVDV核酸阳性,将处理后的BVDV阳性样品接种于MDBK细胞,分离到1株病毒,命名为BVDV JLS-01。通过免疫荧光检测、5′UTR与Npro RT-PCR扩增对其分子进化特征进行分析。结果显示,该分离毒株在MDBK细胞上盲传至8代未出现细胞病变,在免疫荧光试验中呈阳性荧光信号。RT-PCR扩增获得大小分别为280和735bp的5′UTR和Npro片段。BVDV JLS-01株5′UTR与Npro序列遗传进化分析表明,其与LN-1和ZM-95亲缘性最近,与牛源毒株LN-1基因同源性达99.3%,提示该毒株可能来源于牛源毒株。将BVDV JLS-01株F8代细胞培养液人工感染BVDV和猪瘟病毒(CSFV)抗体阴性猪,感染猪未表现出明显的体温升高,但白细胞数量下降,并在感染猪的白细胞提取物中分离到该毒株,表明该毒株具有一定的致病性。该毒株的成功分离对进一步开展BVDV流行病学调查及致病机理等方面的研究具有重要意义。     

牛病毒性腹泻病毒XC株的分离与鉴定

将BVDV阳性血清样品接种MDBK细胞,结果分离出1株BVDV。采用MDBK细胞培养法、直接免疫荧光、RT-PCR与TCID_(50)等方法对分离毒株进行鉴定分析。结果表明,分离株在MDBK细胞上盲传至10代均未出现细胞病变;在直接免疫荧光试验中呈阳性;RT-PCR扩增均获得5'-UTR、Npro预期大小DNA片段;分离株滴度为10~(-5.9)TCID_(50)/0.2 mL。进化分析显示,该分离株属于BVDV-1m。以上结果推断,成功分离鉴定1株BVDV,该分离株为非致细胞病变型BVDV-1m,命名为BVDV-1 XC株,为研究致病机理奠定基础。     

胎牛血清中牛病毒性腹泻病毒2型毒株分离及脱脂奶粉中抗体的检测

本研究旨在对进口胎牛血清中的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)进行分离及鉴定。利用BVDV抗原和抗体检测试剂盒检测,提取胎牛血清中的病毒RNA,用5′-UTR巢式PCR进行扩增,PCR扩增产物连接pMD19-T进行测序分析。胎牛血清样品接种MDBK细胞,进行细胞传代培养,通过细胞分离培养、直接免疫荧光抗体检测对实验室进口胎牛血清样品进行病毒分离及鉴定,应用DNAStar对BVDV 5′-UTR、N~(pro)与GenBank中公布的瘟病毒参考株进行多序列比对,采用Mega 6.0进行遗传进化分析。同时通过包被脱脂奶粉进行间接ELISA检测其中的BVDV抗体。结果显示,胎牛血清中BVDV抗原和抗体均为阳性,并且从胎牛血清中成功分离到一株新的牛源BVDV,命名为BVDV-GC株,该病毒株在MDBK细胞上进行增殖培养时未能引起细胞病变;5′-UTR与N~(pro) PCR扩增为阳性,扩增产物大小均与预期相符;直接免疫荧光检测荧光信号为阳性;病毒滴度为10~(-3.6)TCID_(50)/0.1 mL;遗传进化分析表明,该分离株与USMARC-60779(BVDV-2)株有较近的亲缘关系,同属于BVDV-2型毒株;通过包被脱脂奶粉和商品化的ELISA试剂盒进行检测,结果表明脱脂奶粉中存在BVDV抗体。本研究从进口胎牛血清中分离出1株BVDV-2型非致细胞病变病毒,从脱脂奶粉中检测到BVDV抗体,表明进口胎牛血清和脱脂奶粉中都存在BVDV抗原和抗体污染,本研究为后续试验分析提供参考。     

牛病毒性腹泻病毒BVDV-LC株的分离与鉴定

为分离鉴定新疆地区牛病毒性腹泻病毒(BVDV)流行株,本研究通过RT-PCR检测、细胞分离培养、直接免疫荧光抗体检测、核苷酸序列测定及生物信息学分析对新疆某奶牛场采集的腹泻牛粪便样品进行了病毒分离和鉴定。结果显示,分离得到一株新的牛源BVDV,命名为BVDV-LC株。该病毒株在MDBK细胞培养时未能引起细胞病变;5'-UTR与N~(pro) PCR扩增为阳性,扩增片段与预期大小一致;直接免疫荧光检测荧光信号为阳性;病毒滴度为10~(5.6) TCID_(50)/0.1 mL;遗传进化分析显示,该分离株与猪源BVDV-SD0803株有较近的亲缘关系,同属于BVDV-1q基因亚型。本研究表明BVDV-LC株的分离鉴定对进一步开展疫苗研发、牛病毒性腹泻致病机理等方面的研究具有重要意义。     

一株牛病毒性腹泻/黏膜病强毒株的分离与鉴定

从云南某牛场疑似BVDV感染的病料通过接种MDBK细胞分离到1株BVDV,将其命名为BVDV/W。该分离毒株连传15代均不产生CPE,为NCP型BVDV。通过电镜检测可观察到直径为 40～60nm病毒粒子。该分离病毒能被牛病毒性腹泻标准阳性血清中和,且能被BVDV IFA荧光抗体识别;针对常用作BVDV基因分型的5′-UTR设计特异性引物,经RT-PCR可扩增出288bp特异性片段。将所测的目的片段序列与中参考序列进行同源性比较,结果显示与293株和Y2株同源关系较近,分别为90.0%和89.9%,与2014年以来我国报道的分离株同源性在88%左右,具有一定的代表性。5′-UTR遗传进化分析证实该分离毒株为BVDV-1型。动物回归试验显示,该分离毒株可引起出现体温升高、腹泻、粘膜病等典型的BVD/MD症状,表明该毒株为1株BVD强毒株。     

2株牛病毒性腹泻病毒基因2型的分离鉴定

为了对疑似污染牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)的牛肾细胞系(MDBK)进行检测并分离鉴定病毒,采用RTPCR、间接免疫荧光、电镜观察、病毒序列的分子进化分析等方法对细胞中污染的BVDV进行鉴定。结果显示:从2株不同来源的污染细胞中检测到2株BVDV(C201602和C201704),RT-PCR均可扩增得到288 bp的5'-UTR片段,进化分析表明其均为BVDV-2a型;2株病毒接种MDBK细胞传代,均无细胞病变产生,测得第3代病毒效价分别为105和104.5TCID50/m L,电镜观察病毒为50~60 nm的圆形有囊膜颗粒。研究表明,BVDV-2具有潜在的流行风险,为试验材料中BVDV-2污染的风险控制提出了警示。     

猪瘟疫苗中牛病毒性腹泻病毒2型的检测

为对上海某猪场送检的一份猪瘟疫苗进行牛病毒性腹泻病毒(BVDV)检测,本研究将猪瘟疫苗样品接种于MDBK细胞,盲传15代后仍无致细胞病变效应,但间接免疫荧光试验表明接种该疫苗后的MDBK细胞能够被单克隆抗体BZ-53(BVDV-2)识别。采用BVDV-1和BVDV-2的5’-UTR的通用检测引物和针对BVDV E2的引物,对样品RNA进行RT-PCR检测,结果显示,样品能够扩增出约288 bp的BVDV特异性片段;此外,5’-UTR和E2基因片段的测序分析结果表明分离株属于BVDV-2,并且其E2基因与牛源XJ-04株(BVDV-2)的E2基因同源性最高(92.3%),而与猪源ZM-95株(BVDV-1)的E2基因同源性较低(64.5%)。由此证明,该猪瘟疫苗中的确污染有一株BVDV-2株。     

猪源牛病毒性腹泻病毒的分离与鉴定

为了对临床疑似牛病毒性腹泻病毒(BVDV)感染病料进行确诊,并掌握致病原的生物学和遗传变异特征,试验通过临床样品PCR检测、病毒分离培养与细胞病变特征观察、理化特性试验、5′UTR基因序列分析等方法对临床病料进行了BVDV的分离和鉴定。结果表明:临床病料BVDV特异性引物PCR扩增为阳性,可引起单层MDBK细胞产生细胞病变,分离毒株的TCID_(50)高达1×10~(-5.23)/0.1 mL,其对氯仿、乙醚、胰酶、酸、热均敏感,在基于5′UTR基因的遗传进化树中其位于BVDV-1型的分支中,归属于BVDV-1a型,与登录号为JN400273.1的猪源BVDV-1a型毒株的亲缘关系最近,同源性达100%。说明试验获得了1株猪源BVDV分离毒株,属于BVDV-1a型,并掌握了该毒株的生物学特性和遗传特征。     

一株源于商品胎牛血清的BVDV-2型的分离鉴定及基因组序列分析

牛病毒性腹泻病毒(BVDV)是引起牛病毒性腹泻/黏膜病的重要病原,也是牛血清及其制品污染中的常见病原体。本研究从商品化胎牛血清中分离到一株致细胞病变(CP)型BVDV(GS2018株),利用电镜观察、免疫荧光检测、分子鉴定、基因组测序及遗传进化分析对其进行鉴定。结果表明,GS2018株接种MDBK细胞后可见明显的细胞病变(CPE),培养第4天病毒滴度达1×10~(6.2)·0.1 mL~(-1)。病毒粒子呈圆形,直径为50～60 nm,间接免疫荧光检测为阳性;其5′UTR扩增片段与BVDV-2相应序列高度相似,病毒基因组包含12 235个核苷酸(nt)。5′UTR、N~(pro)及E2基因系统进化分析发现,GS2018株与美国BVDV-2 USMARC-60764分离株核苷酸一致性达98%,证明其属于CP型BVDV-2a亚型。但GS2018株在NS2/3区无核酸片段插入,这与大多数CP型BVDV-2明显不同,说明BVDV致细胞病变可能涉及更复杂的机制。     

胎牛血清中牛病毒性腹泻病毒2型毒株分离及脱脂奶粉中抗体的检测

本研究旨在对进口胎牛血清中的牛病毒性腹泻病毒（BVDV）进行分离及鉴定。利用BVDV抗原和抗体检测试剂盒检测,提取胎牛血清中的病毒RNA,用5'-UTR巢式PCR进行扩增,PCR扩增产物连接pMD19-T进行测序分析。胎牛血清样品接种MDBK细胞,进行细胞传代培养,通过细胞分离培养、直接免疫荧光抗体检测对实验室进口胎牛血清样品进行病毒分离及鉴定,应用DNAStar对BVDV 5'-UTR、N^pro与GenBank中公布的瘟病毒参考株进行多序列比对,采用Mega 6.0进行遗传进化分析。同时通过包被脱脂奶粉进行间接ELISA检测其中的BVDV抗体。结果显示,胎牛血清中BVDV抗原和抗体均为阳性,并且从胎牛血清中成功分离到一株新的牛源BVDV,命名为BVDV-GC株,该病毒株在MDBK细胞上进行增殖培养时未能引起细胞病变;5'-UTR与N^pro PCR扩增为阳性,扩增产物大小均与预期相符;直接免疫荧光检测荧光信号为阳性;病毒滴度为10^-3.6TCID₅₀/0.1 mL;遗传进化分析表明,该分离株与USMARC-60779（BVDV-2）株有较近的亲缘关系,同属于BVDV-2型毒株;通过包被脱脂奶粉和商品化的ELISA试剂盒进行检测,结果表明脱脂奶粉中存在BVDV抗体。本研究从进口胎牛血清中分离出1株BVDV-2型非致细胞病变病毒,从脱脂奶粉中检测到BVDV抗体,表明进口胎牛血清和脱脂奶粉中都存在BVDV抗原和抗体污染,本研究为后续试验分析提供参考。     

甘肃、青海和宁夏地区牛病毒性腹泻病毒Erns基因的变异分析

分析2013—2019年中国西北部分省区不同基因亚型牛病毒性腹泻病毒（BVDV）抗原基因E^rns的分子特征,了解其遗传演化规律。从甘肃、青海、宁夏规模化牛场送检的疑似牛病毒性腹泻发病牛150份EDTA抗凝血提取总RNA,利用RT-PCR扩增病毒基因组E^rns-E1区,克隆测序后比对,构建系统进化树进行遗传演化关系分析。利用牛肾细胞MDBK对检出的不同基因亚型BVDV进行分离,并鉴定其生物型。RT-PCR扩增结果表明,BVDV总体阳性率为37.33%,其中甘肃省、青海省、宁夏回族自治区BVDV阳性率分别为37.68%、35.71%、40.00%。获得56份E^rns-E1 DNA,克隆测序获得33条不同的E^rns序列,长度均为681 bp,分析表明流行株分属10个BVDV基因亚型：BVDV-1a （2株）、BVDV-1b （5株）、BVDV-1c （1株）、BVDV-1d （3株）、BVDV-1m （11株）、BVDV-1o （1株）、BVDV-1p （4株）、BVDV-1q （4株）、BVDV-1v （1株）、BVDV-2a （1株）。分离获得BVDV-1a亚型、BVDV-1b亚型、BVDV-1v亚型、BVDV-2a亚型分离株各1株,BVDV-1 d亚型分离株2株,均为非致细胞病变型。各亚型株间E^rns基因核苷酸相似性以BVDV-1a～1d经典亚型株（79.8%～85.9%）或1m～1q及1v新亚型株（81.0%～87.3%）较高,以BVDV-1 m和BVDV-1p流行株亚型间相似性最高（87.3%）。各亚型株E^rns基因编码蛋白的RNA酶活性位点以及双链RNA作用基序（₁₃₉KKGK₁₄₂）保守,但E^rns第26位糖基化位点（26 NRSL）在1m～1q、1v亚型株移位（24 NVSR）。首次以E^rns核苷酸序列构建系统进化树,结果显示1m～1q及1v等亚型BVDV株在进化上关系较为密切。本研究首次选用E^rns靶标基因对甘肃、青海、宁夏部分省区牛源BVDV株进行同源性及系统进化分析,发现10个基因亚型流行株,以1m亚型株最为普遍,1m～1q及1v等亚型株亲缘关系密切。     

Ⅱ型牛病毒性腹泻病毒的分离鉴定

为了解内蒙古呼和浩特部分地区牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)的流行情况,本研究采用RTPCR技术从采集自内蒙古某屠宰场的32份牛肺脏样品中检测出两株BVDV,命名为BVDV-HT1704、BVDV-HT1723株。通过在MDBK细胞上传代、免疫荧光试验、5’-UTR基因序列测定及分子进化分析对检测出BVDV阳性的肺脏组织进行鉴定。结果显示:在MDBK细胞中盲传10代后没有病变产生;经IFA检测,在病毒感染的细胞浆内产生特异性荧光;序列同源性和系统进化分析表明该毒株属于BVDV-Ⅱa型,且两株分离株属于单一的分支。本研究首次在我国正常牛肺脏组织中分离到BVDV,为了解BVDV在内蒙古自治区的流行情况及地理分布提供依据,并为相关疫苗的研发奠定了基础。     

一株源于商品胎牛血清的BVDV-2型的分离鉴定及基因组序列分析

牛病毒性腹泻病毒（BVDV）是引起牛病毒性腹泻/黏膜病的重要病原,也是牛血清及其制品污染中的常见病原体。本研究从商品化胎牛血清中分离到一株致细胞病变（CP）型BVDV（GS2018株）,利用电镜观察、免疫荧光检测、分子鉴定、基因组测序及遗传进化分析对其进行鉴定。结果表明,GS2018株接种MDBK细胞后可见明显的细胞病变（CPE）,培养第4天病毒滴度达1×10^6.2·0.1 mL^-1。病毒粒子呈圆形,直径为50~60 nm,间接免疫荧光检测为阳性;其5'UTR扩增片段与BVDV-2相应序列高度相似,病毒基因组包含12 235个核苷酸（nt）。5'UTR、N^pro及E2基因系统进化分析发现,GS2018株与美国BVDV-2 USMARC-60764分离株核苷酸一致性达98%,证明其属于CP型BVDV-2a亚型。但GS2018株在NS2/3区无核酸片段插入,这与大多数CP型BVDV-2明显不同,说明BVDV致细胞病变可能涉及更复杂的机制。     

Genetic Heterogeneity of Bovine Viral Diarrhoea Virus In Italy

The genetic characteristics, of 38 field isolates of bovine viral diarrhoea virus (BVDV) collected in 1999 from sick or healthy and persistently infected cattle of dairy farms situated in northern Italy, were investigated. A partial 5-untranslated region (5-UTR) sequence of each isolate was determined and a phylogenetic analysis was performed. All the isolates were classified as belonging to the BVDV-1 genotype and could be assigned to different BVDV-1 groups, namely BVDV-1b (n = 20), BVDV-1d (n = 6) and BVDV-1e (n = 10). Two remaining isolates could be classified as BVDV-1f and BVDV-1h, respectively. These results provided evidence for genetic heterogeneity of BVDV in Italy, and contribute to a better knowledge of the circulation of BVDV strains, and to their classification.     

牛病毒性腹泻病毒BVDV-JL分离株全基因序列测定与分析

为了解中国农业科学院特产研究所分子生物学重点实验室前期分离的牛病毒性腹泻病毒BVDV-JL毒株完整的基因序列信息,本试验对BVDV-JL F6代毒株进行了完整基因序列测定。利用反转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)方法分段扩增了BVDV-JL分离毒株的7段cDNA片段,分别克隆于pMD18-T载体并进行测序。BVDV-JL株基因组序列全长为12276 bp,编码3901个氨基酸。基因组两端为非编码区5'UTR和3'UTR。基因比对及进化树分析结果表明BVDV-JL与BVDV CP7同源性最高,核苷酸同源性为93.2%,归类于BVDV-1b2基因亚型。BVDV-JL是第1个在中国报道的BVDV-1b2亚型毒株。了解BVDV-JL完整基因序列有利于中国BVDV流行病学调查。     

Genetic diversity of international bovine viral diarrhoea virus (BVDV) isolates: identification of a new BVDV-1 genetic group

In the last decade, several studies were performed to characterise bovine viral diarrhoea virus (BVDV) isolates and define genetic groups by genotyping. Much data is now available from GenBank, predominantly sequences from the 5' untranslated region (5'-UTR). In order to find out whether genetic grouping of isolates from different countries could be harmonised, 22 new isolates from five countries were analysed in combination with published sequences. Eighteen of these isolates were typed as BVDV genotype 1 (BVDV-1), and one isolate from Argentina and three isolates from Brazil were typed as BVDV-2. BVDV-1 isolates were clustered into five previously defined genetic groups: BVDV-1a, b, d, e and f. Two isolates from Finland and one from Egypt formed a group which was tentatively labelled as BVDV-1j, since statistical support was low. By using a fragment of the Npro gene for typing, we found that these isolates fall into the same group as a deer strain, and are statistically significant. Some Swiss BVDV strains taken from GenBank were found in a new genetic group which was designated as BVDV-1k. The BVDV-2 isolates included in this study seemed to fall into two genetic groups.     

猪源牛病毒性腹泻病毒SD0803株细胞传代研究

为研究猪源牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)生物学特性,将本实验室分离得到的SD0803毒株在马-达氏牛肾细胞(mardin-darby bovine kidney,MDBK)上连续传40代,提取第40代病毒基因组RNA,设计扩增及测序引物,用RT-PCR方法分5段扩增第40代病毒基因片段,并进行全长测序,利用DNASTAR软件进行序列拼接及分析,与亲代病毒SD0803序列比对分析;用Real-time PCR方法测定第1、10、20、30和40代细胞上清中的病毒复制效率,并绘制多步生长曲线。测序结果表明,第40代病毒与亲代病毒核苷酸序列的同源性为99.8%,氨基酸序列的同源性为99.6%,其中有23处发生核苷酸突变,14处为有义突变,氨基酸变化主要集中在E2和NS5B区域。多步生长曲线显示,传代病毒和亲本病毒均能在MDBK细胞上获得较高的复制效率,并有着相似的生长特性,复制效率基本一致。本次研究为研制猪源BVDV疫苗做好了物质储备,为下一步研究其致病性和抗原性奠定基础。