鼠伤寒沙门菌LH430株asd基因缺失株平衡致死系统的构建及生物学特性分析

本研究旨在构建基于减毒鼠伤寒沙门菌的平衡致死系统。将打靶基因片段Cat基因重组入鼠伤寒沙门菌LH430株asd基因位置,之后将温敏型质粒pCP20转入菌体中用以消除Cat基因片段,通过PCR技术两步法筛选出缺失株Δasd LH430;将asd⁺的原核表达质粒pYA3493转入Δasd LH430,经PCR及测序鉴定表明鼠伤寒沙门菌平衡致死系统Δasd LH430（pYA3493）构建成功。对构建的基因缺失株研究表明,该缺失株失去了在二氨基庚二酸（DAP）阴性环境中生存的能力;糖发酵试验表明,缺失菌株在利用碳源的能力方面与亲本菌株保持一致;9种生化试验结果显示,缺失菌株遗传了亲本菌株的生化特性;遗传稳定性试验表明,缺失菌株能够稳定遗传缺失的423 bp的基因片段;将绿色荧光基因转入所构建的平衡致死系统,成功构建携带绿色荧光基因的重组菌Δasd LH430（pYA-gfp）,对其研究表明该重组菌能够有效表达绿色荧光蛋白。本研究成功构建了鼠伤寒沙门菌平衡致死系统Δasd LH430（pYA3493）,能够有效表达所携带的基因,该系统可作为疫苗活载体来携带外源基因。     

铜绿假单胞菌F_(190-342)-I_(21-83)基因重组鼠伤寒沙门氏杆菌生物学特性研究

为了研究载体菌株Δasd LH430 (pYA3493)携带外源基因的能力,试验采用分子生物学方法构建了携带铜绿假单胞菌的保护性抗原基因F_(190-342)-I_(21-83)(F1I2)的重组表达质粒pYA-F1I2,将其重组到减毒的鼠伤寒沙门氏杆菌Δasd LH430 (pYA3493)中,成功构建重组菌株Δasd LH430 (p YAF1I2),并研究了重组菌株的遗传稳定性、表型、毒力。结果表明:构建的重组菌株Δasd LH430 (pYAF1I2)能够稳定遗传所携带的F190-342和I21-83基因;重组菌株生长速度略低于亲本菌株,且遗传了亲本菌株的糖利用能力,在碳源利用方面没有改变;与亲本菌株相比,重组菌株毒力略有下降,对动物更加安全。说明重组菌株Δasd LH430 (pYA-F1I2)可作为铜绿假单胞菌-沙门氏杆菌二联疫苗的候选菌株。     

减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpΔcyaSL1344株asd平衡致死系统的构建及其特性

为构建能稳定携带外源基因的减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpΔcyaΔasdSL1344,本研究在减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpΔcyaSL1344基础上,以χ7213（pREΔasd）为供体菌,ΔcrpΔcyaSL1344为受体菌,利用自杀性质粒介导的等位交换技术成功筛选出缺失编码天冬氨酸β-半乳糖脱氢酶基因（aspartic semialdehyde dehydrogenase,asd）的ΔcrpΔcyaΔasdSL1344菌株,进一步对其生物学特性进行初步研究。结果显示,其血清型和亲本株ΔcrpΔcyaSL1344及强毒株SL1344相同且该缺失菌株能稳定遗传缺失后的asd基因;其生化特性和生长速度与强毒株SL1344相比有很大差异,与亲本株ΔcrpΔcyaSL1344基本一致,ΔcrpΔcyaΔasdSL1344失去了利用麦芽糖、乳糖、山梨醇等碳源的能力,也不能分解H2S、半乳糖和鼠李糖,但仍保留了利用葡萄糖的能力,其生长速度比强毒株更加缓慢。1日龄雏鸡攻毒试验表明ΔcrpΔcyaΔasdSL1344互补携带asd基因的pYA3493质粒后,ΔcrpΔcyaΔasdSL1344（pYA3493）毒力较强毒株SL1344降低了至少105倍,与亲本株ΔcrpΔcyaSL1344相比毒力仅相差10倍。结果表明,减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpΔcyaΔasdSL1344菌株构建成功,为深入研究以鼠伤寒沙门菌为载体的口服多价疫苗奠定基础。     

以减毒鼠伤寒沙门氏菌为载体的重组NDV-HN口服疫苗的构建与鉴定

试验旨在构建表达鸡新城疫病毒(NDV)HN基因的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌SL1344ΔcrpΔasd(pYA3493-HN)。以pMD18-T-HN为模板,通过PCR扩增出NDV HN基因片段,定向插入原核表达载体pYA3493中,将重组表达质粒pYA3493-HN转入χ6097,再转入减毒鼠伤寒沙门氏菌SL1344ΔcrpΔasd,通过双酶切和PCR对质粒进行鉴定。结果表明,携带NDV HN基因片段的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌SL1344ΔcrpΔasd(pYA3493-HN)构建成功。本研究结果为开发鸡新城疫的口服基因工程活载体疫苗奠定了基础。     

大肠杆菌融合基因K88ac-STⅡ的减毒鼠伤寒沙门疫苗菌的构建与表达

本研究为构建表达产肠毒素性大肠杆菌融合基因K88ac-STⅡ的无抗性减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗株,从质粒pET-K88ac-STⅡ中扩增编码融合蛋白K88ac-STⅡ的基因并插入线性T载体pBS-T中,经酶切、PCR、测序鉴定正确后,再用限制性内切酶切下,插入含有asd基因的表达载体pYA3334,构建pYA-K88ac-STⅡ重组质粒。重组质粒鉴定正确后电穿孔转入缺失腺苷酸环化酶基因（Δcya）、环腺苷酸受体蛋白基因（Δcrp）以及天冬氨酸p-半醛脱氢酶基因（Aasd）的鼠伤寒沙门菌（X4550）中,以获得重组菌株X4550（含pYA-K88ac-STⅡ）。结果显示该无抗药性的重组菌株在体外营养选择压力下,可较稳定地携带重组质粒传代繁殖,口服该疫苗菌株无明显的毒性作用。通过本试验成功构建了表达K88ac-STⅡ融合基因平衡致死的减毒鼠伤寒沙门重组菌X4550（含pYA-K88ac-STⅡ）。为防治仔猪腹泻提供了口服活菌疫苗候选株。     

SG97A平衡致死系统的构建及其初步应用

敲除鸡伤寒沙门菌(SG)减毒疫苗株97Aasd基因,构建宿主载体平衡致死系统并表达新城疫病毒(NDV)F蛋白,构建二价活菌苗。PCR扩增两段位于asd基因外侧的序列作为等位基因,以氯霉素抗性(CmR)基因替代asd基因,构建自杀质粒pGMB151Δasd::CmR,通过E.coliχ7213与SG97A固相杂交,将质粒转入SG97A,反向筛选获得SG97AΔasd::CmR,利用质粒pCP20去除CmR后,DAP的依赖菌株命名为SG97AΔasd。将含asd基因的质粒pYA3334转入SG97AΔasd中构建宿主载体平衡致死系统,并表达NDV-F蛋白。结果表明,通过等位基因重组方法,成功构建SG97AΔasd及宿主载体平衡致死系统,重组菌能够表达NDV-F蛋白,并能在鸡体内诱导产生特异性抗体。本研究成功构建SG97AΔasd宿主载体平衡致死系统,并表达NDV-F蛋白及其诱导宿主产生抗体,为应用该系统构建二价活菌苗的研究奠定了基础。     

表达破伤风毒素C片段的重组鼠伤寒沙门菌的构建与鉴定

为构建表达破伤风毒素C片段基因的减毒鼠伤寒沙门菌，将编码破伤风毒素C片段的基因插入到asd^＋的组成型表达载体pYA3333，转化asd基因突变的E．coli X6212。获得重组质粒pYA3333-TetC，再将重组质粒通过电穿孔法转入宿主菌，构建成表达破伤风毒素C片段基因的平衡致死的鼠伤寒沙门菌X4550（pYA3333-TetC）。免疫印迹试验证实，该重组菌表达的蛋白与预期的目的蛋白一致。重组菌X4550（pYA3333-TetC）的稳定性试验表明，在体外培养100代后，随机挑选的重组菌落全部都能生长，重组菌X4550（pYA3333-TetC）的生长曲线测定表明，X4550（pYA3333-TetC）和X4550（pYA3333）的生长状态基本一致。动物试验证明，该重组菌是安全的，破伤风毒素攻击后能提供良好的保护作用。     

表达IBDV VP2蛋白重组减毒沙门菌活载体疫苗株的构建及免疫原性分析

通过PCR克隆出IBDV VP2基因,将其插入到表达载体pYA3341中,构建重组质粒pYA3341-VP2。将重组质粒电转入鼠伤寒沙门菌疫苗株X4550（缺失Asd、Cya、Crp基因）,获得重组疫苗菌株X4550（pYA3341-VP2）。进行重组菌VP2蛋白表达的鉴定;测定重组菌的稳定性、生长曲线、安全性以及小鼠免疫试验。结果表明,酶切鉴定证实重组质粒构建成功;SDS-PAGE和Western blot证实重组菌表达的VP2蛋白能与鸡抗IBDV阳性血清特异性结合;重组菌株在体外营养选择压力下,可稳定地携带重组质粒传代繁殖,在体内可稳定地定居于肠系膜淋巴结和脾脏;小鼠口服试验证实重组菌无毒性作用;口服重组菌免疫小鼠,ELISA检测产生了抗IBDV抗体;中和试验表明产生的抗体具有中和活性。本试验成功构建了能稳定表达IBDV VP2蛋白的口服减毒鼠伤寒沙门菌疫苗株X4550（pYA3341-VP2）,为研究IBD口服基因工程疫苗奠定了基础。     

鼠伤寒沙门菌sapC基因缺失株的构建及生物学特性分析

旨在研究鼠伤寒沙门菌ABC转运膜蛋白SapC在沙门菌致病机制中的功能。本研究利用λ-Red重组技术构建了鼠伤寒沙门菌sapC基因缺失突变株SMΔsapC,对其进行生长特性、酸性应激试验、多黏菌素B敏感性试验、生物被膜检测、胞内存活和小鼠体内毒力试验。结果显示,基因缺失株SMΔsapC与亲本菌株和互补菌株相比,其生长速度无明显差异;在酸应激条件下,SMΔsapC存活率显著低于亲本菌株;sapC基因缺失降低了鼠伤寒沙门菌生物被膜的形成能力;同时,SMΔsapC基因缺失株在鼠源巨噬细胞内的增殖能力和小鼠体内的毒力显著低于亲本菌株。研究表明,sapC基因影响鼠伤寒沙门菌的抗酸能力、生物被膜形成能力,从而影响沙门菌在体内外的毒力。本研究为进一步阐释鼠伤寒沙门菌的致病机制奠定了基础。     

鼠伤寒沙门菌SL1344株cAMP受体蛋白基因缺失株的构建及其生物学特性

通过自杀性质粒介导的细菌同源重组技术,构建鼠伤寒沙门菌SL1344株的crp基因缺失疫苗候选菌株,并对其生物学特性进行初步研究。首先构建含缺失321bp crp基因的重组自杀性质粒pREΔcrp,然后利用重组自杀性质粒介导的等位基因交换技术,两步法筛选SL1344的Δcrp缺失株,用PCR鉴定结果表明该缺失株构建成功。生物学特性研究发现,缺失株ΔcrpSL1344保留了亲本菌株SL1344的血清型1,4,5,12：i：1,2,且能够稳定遗传缺失321bp的crp基因;但是,与亲本株SL1344相比,其生化特性发生明显改变,生长速度明显减慢。缺失株ΔcrpSL1344口服感染1日龄雏鸡的LD50为7.40×109 CFU,毒力较亲本株SL1344降低32 456倍。以上研究结果表明,SL1344株crp基因缺失株构建成功,且遗传稳定,毒力明显降低,为进一步将其开发为鼠伤寒沙门菌弱毒疫苗候选菌株奠定基础。     

调控表达LacI蛋白的猪霍乱沙门氏杆菌C500Δasd株的构建

为了构建具有asd基因缺失和LacI蛋白表达调控的猪霍乱沙门氏杆菌C500株,试验以猪霍乱沙门氏杆菌C500株为载体,对其基因组进行改造,使沙门氏杆菌asd基因缺失,随后将araC PBADLacI序列置于其中,构建包含araC PBAD-LacI基因表达框的猪霍乱沙门氏杆菌C500Δasd基因突变株以及包含Ptrc启动子的EGFP表达质粒pYA4514-EGFP,并验证是否有LacI蛋白表达。结果表明:试验成功构建出包含araC PBAD-LacI基因表达框的猪霍乱沙门氏杆菌C500Δasd基因突变株,以及包含Ptrc启动子的EGFP表达质粒pYA4514-EGFP; Western-blot检测验证了突变菌在阿拉伯糖存在的条件下可大量表达LacI蛋白,而当pYA4514-EGFP质粒上的Ptrc启动子受到抑制时,EGFP蛋白不表达;用IPTG诱导后可以消除LacI对Ptrc启动子的抑制作用,EGFP蛋白表达。说明试验成功构建了调控表达LacI蛋白的猪霍乱沙门氏杆菌C500Δasd基因突变株。     

表达NDV HN蛋白重组减毒鸡白痢沙门菌ΔcrpΔasdC79-13的构建及生物学特性

利用平衡致死系统构建表达鸡新城疫病毒(newcastle disease virus,NDV)血凝素-神经氨酸酶(HN)的减毒鸡白痢沙门菌活载体疫苗株。以p MD18-T-HN为模板,经PCR扩增出HN基因,定向插入原核表达载体p YA3493,构建重组质粒p YA-HN,再将其电转入减毒鸡白痢沙门菌ΔcrpΔasd C79-13中,获得重组减毒鸡白痢沙门菌ΔcrpΔasd C79-13(p YA-HN)。对重组菌的生化特性、生长特性、稳定性及安全性进行测定;并对重组菌表达的HN蛋白进行SDSPAGE和Western blot分析。结果显示,该重组菌保留了在DAP阴性环境中的生存能力;不能利用麦芽糖、蔗糖及乳糖等碳源,但保留了利用葡萄糖的能力;其生长速度明显低于强毒株C79-13,而与ΔcrpΔasd C79-13相比变化不明显;在体外连续传代能稳定遗传HN基因片段;经SDS-PAGE出现1条蛋白质量约为63 000的蛋白条带;Western blot证明重组菌表达的HN蛋白能与NDV阳性血清特异性结合;雏鸡口服接种试验表明ΔcrpΔasd C79-13(p YA-HN)的毒力较强毒株C79-13下降183倍。上述结果表明,成功构建了能稳定表达NDV HN蛋白的口服重组减毒鸡白痢沙门菌,为开发鸡白痢—新城疫的基因工程口服疫苗奠定了初步基础。     

绿荧光蛋白基因在猪霍乱沙门氏菌C500株asd-缺失株平衡致死载体系统中的表达

猪霍乱沙门氏菌C500株是用化学方法致弱用于预防仔猪副伤寒病的弱毒疫苗株，毒力弱且免疫原性良好。为将猪霍乱沙门氏菌开发为适于粘膜免疫的疫苗活载体并保持原有免疫原性，构建了以C500为亲本菌，用负向选择的重组自杀性质粒介导接合转移的方法构建了无抗性标记的asd^-缺失株。首先构建asd（天冬氨酸β-半乳糖脱氢酶）基因缺失1408bp的带有蔗糖敏感基因sacB的重组自杀性质粒，与C500接合转移，两步法筛选无抗性的asd^-缺失株，通过PCR鉴定。该缺失株在无外源DAP（二氨基庚二酸）条件下溶菌死亡，它的生长必需外源DAP。PCR扩增绿荧光蛋白突变体4基因，克隆到带有asd基因的原核表达载体pYA3493中，电转化C500 asd^-缺失株，转化子在LB中生长，并激发强的绿荧光。上述结果表明，该asd^-缺失株的构建是成功的，并且可以用来作为宿主载体平衡致死系统来高效表达外源基因，为开发C500为载体的口服多价疫苗奠定了基础。     

表达NDV HN和IBDV VP2融合蛋白的重组减毒沙门菌的构建及其生物学特性分析

为构建表达鸡新城疫病毒(NDV)HN和传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2融合蛋白的重组减毒沙门菌,并分析其生物学特性。本研究扩增了NDVHN和IBDVVP2主要抗原基因片段,通过重叠延伸PCR扩增获得HN-VP2融合基因,构建重组质粒pYA-HN-VP2,将该重组质粒电转化至减毒鼠伤寒沙门菌SL1344ΔcrpΔcyaΔasd中,获得表达HN-VP2融合蛋白的减毒重组菌SL1344ΔcrpΔcyaΔasd(pYA-HN-VP2),并分析其生化特性、遗传稳定性和毒力等生物学特性。Westernblot结果显示,重组减毒沙门菌可分泌表达HN-VP2融合蛋白,大小为84ku,且该融合蛋白分别能与相应特异性阳性血清发生反应;生物学特性结果显示,重组菌株失去了利用麦芽糖、山梨醇及乳糖等碳源的能力,其生长速度显著慢于野生菌株SL1344;毒力较野生菌株至少下降5个对数单位,且能够稳定遗传重组质粒pYA-HN-VP2。本研究为鸡新城疫-传染性法氏囊病-沙门菌病的三联口服疫苗研制奠定重要基础。     

减毒猪霍乱沙门菌△cya△asdC78-1宿主-载体平衡致死系统的构建及其生物学特性研究

为研制能够稳定携带外源基因的猪霍乱沙门菌口服活疫苗载体,本研究在减毒猪霍乱沙门菌△cyaC78-1基础上,利用自杀性质粒介导的等位交换技术,构建了△cya△asdC78-1宿主-载体平衡致死系统,并对其生物学特性进行了鉴定。PCR及测序结果表明△cya△asdC78-1构建正确,其生物学特性检测结果显示△cya△asdC78-1生化特性与△cyaC78-1完全相同,血清型与△cyaC78-1和疫苗株C500相同,并且具有稳定的遗传特性;其生长速度与△cya C78-1基本相同,均明显慢于疫苗株C500。动物试验表明△cya△asdC78-1电转化携带asd基因的互补质粒pYA3493后,其毒力比△crp△asdC78-1(p YA3493)降低1.14倍,比△asdC500(pYA3493)降低了5.1倍。以上结果表明,减毒猪霍乱沙门菌△cya△asdC78-1同样可以作为口服活疫苗载体用于高效表达外源基因,为开发以C78-1为基础的口服多价疫苗载体奠定了基础。     

新型重组减毒鸡白痢沙门菌ΔcrpΔasdC79-13(pcD-asd)平衡致死系统的构建及其特性

为开发新型重组减毒鸡白痢沙门菌口服活疫苗载体。本研究以pcDNA3.1-Zeo(+)质粒为基础,用沙门菌asd基因替代其氨苄抗性基因Amp,构建不含抗性基因的真核互补质粒pcD-asd;再将互补质粒pcD-asd电转入沙门菌ΔcrpΔasdC79-13,构建ΔcrpΔasdC79-13(pcD-asd)平衡致死系统,研究其生物学特性,进一步将报告基因EGFP克隆入pcD-asd,构建重组菌株ΔcrpΔasdC79-13(pcD-asd-EGFP),感染鸡胚成纤维(CEF)细胞,Western blot分析该系统递呈外源抗原的能力。PCR、酶切及测序结果表明ΔcrpΔasdC79-13(pcD-asd)平衡致死系统构建成功;生物学特性鉴定结果表明,其血清型与亲本株ΔcrpΔasdC79-13及野生株C79-13保持一致;其生化特性与亲本株基本相近,但与野毒株相比发生明显变化;生长速度也更为缓慢,对氨苄抗生素敏感;重组菌株ΔcrpΔasdC79-13(pcD-asd)的LD50较野生株C79-13降低了3.4×104倍;Western blot结果发现,重组菌株感染CEF细胞后,可表达大小约为27 000EGFP蛋白。以上结果证实,本研究成功构建了新型重组减毒鸡白痢沙门菌ΔcrpΔasdC79-13(pcD-asd)株,其能够有效递呈外源抗原,该重组菌株有潜力作为安全、稳定、高效表达外源基因的口服重组活疫苗载体。     

鼠伤寒沙门菌oppCDF基因缺失株的构建及生物学特性分析

利用λ-Red同源重组技术构建鼠伤寒沙门菌oppCDF基因缺失株,并检测其生长特性、运动性、生物被膜形成能力、胞内存活能力及LD₅₀毒力。结果显示,与野生型菌株相比,oppCDF基因缺失株的生长特性无明显变化;oppCDF基因缺失株可降低鼠伤寒沙门菌的运动性;oppC与oppF基因缺失后可提高鼠伤寒沙门菌生物被膜形成能力;同时,oppC基因缺失可降低在RAW267.4细胞内的存活能力和其在小鼠体内的毒力,oppF基因缺失可显著增强在RAW267.4内的存活能力和对小鼠毒力的影响,而oppD基因缺失后其在小鼠体内的毒力和RAW267.4内的存活率均无显著变化。研究表明,oppCDF基因与鼠伤寒沙门菌的运动性、生物被膜形成和毒力密切相关,为进一步揭示鼠伤寒沙门菌致病作用中的复杂调控和机制提供了理论基础。     

禽伤寒沙门氏菌SG9R株asd基因缺失株平衡致死系统平台的构建

为研发以禽伤寒沙门氏菌(SG)SG9R弱毒疫苗株为载体表达外源基因的活菌疫苗,本研究利用Red同源重组系统对SG9R株基因组中编码天冬氨酸β-半醛脱氢酶的asd基因进行敲除,构建SG9R△asd缺失突变株。该突变株在缺乏外源DAP培养条件下溶菌死亡,而在添加DAP或导入表达链球菌asd+质粒p YA3342后才能够恢复增殖能力,以此建立了以asd营养基因为筛选标志的SG染色体-质粒平衡致死系统。并且进一步采用绿色荧光蛋白(GFP)基因作为报告基因,将其克隆于asd+质粒p YA3342中,电转化于SG9R△asd缺失突变株中,通过无DAP培养条件的筛选,获得了表达GFP外源基因的SG重组菌,经体外连续25次传代后,鉴定结果显示,GFP仍能够在重组SG中持续稳定的表达。本研究结果为以SG弱毒疫苗菌株作为活载体的基因工程疫苗的研制提供简便易行的操作平台。     

鼠伤寒沙门菌cpxR和acrB双基因缺失菌株的构建及其对抗菌药物敏感性分析

为了探索cpxR基因对鼠伤寒沙门菌多重耐药性的调控机制,同时避免外排泵acrB的存在掩盖cpxR对其他外排泵或外膜蛋白的调控作用,利用基于Red同源重组系统的一步法失活染色体基因,用含有同源臂的线性打靶DNA片段替换目的基因,构建鼠伤寒沙门菌JS株的acrB基因缺失株JSΔacrB。然后利用噬菌体转导技术,以前期构建的cpxR缺失株JSΔcpxR∷kan为供体菌,本研究新构建的JSΔacrB为受体菌,在P22噬菌体的作用下构建双基因缺失菌株JSΔacrBΔcpxR∷kan,同时制备cpxR基因回补菌株JSΔacrBΔcpxR∷kan/pcpxR。最后用微量稀释法测定10种临床常用代表性抗菌药物对JS和各缺失株的最小抑菌浓度(MIC)。结果表明,成功构建鼠伤寒沙门菌的双基因缺失菌株JSΔacrBΔcpxR∷kan以及其cpxR基因互补菌株JSΔacrBΔcpxR/pcpxR。MIC结果显示,acrB基因缺失后,多西环素、庆大霉素、阿米卡星、环丙沙星、恩诺沙星、氟苯尼考、头孢曲松和头孢噻呋的MIC值分别降低32、4、4、16、32、4、2和128倍;双基因缺失后,多西环素、庆大霉素、阿米卡星和头孢噻呋的MIC值进一步降低2、8、2和2倍;而将cpxR基因回补之后,这4种抗菌药物的MIC值会升高4、16、2和4倍。结果表明,cpxR能调控鼠伤寒沙门菌对多西环素、庆大霉素、阿米卡星和头孢噻呋的敏感性。     

猪链球菌2型溶菌酶释放因子MRP在重组沙门菌中的表达

从猪链球菌2型(SS2)四川分离株分离溶菌酶释放因子基因mrp,将其克隆至T载体上,再将asd基因插入到重组质粒的抗生素抗性基因中,电击转入asd缺陷型沙门菌X4072中表达,形成依赖asd基因的质粒-宿主平衡致死系统。经酶切、PCR及蛋白电泳鉴定,证实重组菌株能够稳定表达MRP,从而为SS2的防制提供了可能候选疫苗株。