Cdc25B mRNA在早期鸡胚中的动态表达

本试验旨在研究Cdc25B mRNA在早期鸡胚中的时空表达模式。通过分子克隆的方法获得Cdc25B基因特异性目的片段,并用体外转录的方法合成了Cdc25B RNA探针,通过全胚胎原位杂交的方法检测了早期不同发育阶段鸡胚中的Cdc25B mRNA水平。结果表明,Cdc25B的杂交信号主要分布于中枢神经系统(CNS)、体节和肢芽的顶端,在尾部神经上皮中缺乏杂交信号。早期阶段,Cdc25B的杂交信号不对称地分布在亨氏节的左侧。随着胚胎的发育,Cdc25B的杂交信号逐渐增强,并且在即将封闭的神经管中,杂交信号呈现出腹背递减的浓度梯度。然而,在早期各个阶段,脊索都是阴性的。这些结果提示,Cdc25B在前、后期的CNS、体节和肢芽发育中可能发挥不同的功能,这种功能的改变可能与Cdc25B的表达浓度有关。此外,鸡胚胎内部器官的左右不对称性发育可能是Cdc25B与其它基因共同调控的结果,这些调控发育的机制可能是Cdc25B蛋白参与了细胞周期进程,调控细胞增殖或分化。     

Legumain基因在斑马鱼胚胎发育中的表达分析

为明确天冬酰胺内肽酶(legumain)基因在斑马鱼发育中的表达特性,利用全胚胎原位杂交的方法检测legumain在斑马鱼胚胎发育过程中的表达分布情况,并采用双色原位杂交的方法研究legumain和泛髓系细胞、巨噬细胞、中性粒细胞的共定位情况。结果显示,legumain转录本为母系表达,在胚胎发育早期泛在性表达。在受精18h后在造血组织有特异的高丰度表达。双色原位杂交显示,legumain和泛髓系细胞、巨噬细胞、中性粒细胞有共定位表达。结果提示legumain在斑马鱼发育过程中有重要作用,在巨噬细胞中高表达并参与相关生理功能的完成。     

鸡、鹌鹑及其杂交禽胚胎肌肉发育过程中MSTN和p21基因的表达规律

旨在研究MSTN和p21基因在鸡、鹌鹑和杂交禽胚胎肌肉发育过程中的表达规律,比较这2个基因在杂交禽与亲本鸡和鹌鹑中的差异表达,探讨MSTN和p21基因与肌肉发育的关系。通过人工受精获得鸡(♂)与鹌鹑(♀)杂交禽蛋,与鸡蛋、鹌鹑蛋按照鸡标准孵化条件同批入孵,采集第7～17天活胚胸肌组织,应用实时荧光定量PCR技术检测MSTN和p21基因在3个物种中每一天mRNA的相对表达量。MSTN和p21基因在胚胎肌肉发育的第7～17天均有表达,这2个基因mRNA的表达在鸡胚中第9天到达第1次峰值,在鹌鹑中第7天到达第1次峰值,后都随胚胎的发育表达水平上升,并维持相对稳定的高水平表达。杂交禽的表达规律与鸡一致,也在第9天达到峰值,而p21mRNA表达极显著高于鸡和鹌鹑(P<0.01)。MSTN mRNA表达规律与成肌细胞退出细胞周期的时间规律一致;在胚胎肌肉发育过程中,MSTN基因特异性上调p21的表达。     

鲤鱼MyoD基因克隆及原位杂交分析

为了研究成肌分化因子(MyoD)基因在鲤鱼发育中的功能,采用鲤鱼完整早期胚胎作为试验材料,通过对MyoD基因的克隆,利用整体原位杂交技术,从个体水平研究其在鲤鱼早期发育中的表达情况,明确该基因在鲤鱼胚胎早期的表达部位。结果表明:MyoD是生肌调节因子MRFs家族(MyoD、Myf-5、myogenin、MRF4)的重要成员,是脊椎动物胚胎期肌肉发育的主导调控基因,对骨骼肌的形成和分化起主要作用,MyoD基因的表达不仅能促进肌细胞的发育,还能使其他类型细胞转化成肌细胞,并能促进肌细胞进一步融合,分化成成熟的肌纤维。     

昆明小鼠早期胚胎G6PDH在CZB和KSOM中的转录与表达

根据小鼠肌肉 6 -磷酸葡萄糖脱氢酶 (G6 PDH)的 c DNA序列 ,设计并合成内外 2对引物 ,以巢式 RT- PCR检测了昆明小鼠体外培养的 2 -、4 -细胞期早期胚胎 G6 PDH m RNA的表达情况。结果显示 ,以不含葡萄糖的培养液 CZB体外培养发育至 2 -、4 -细胞阶段昆明小鼠早期胚胎 G6 PDH m RNA经反转录后 ,均能以外引物扩增产物为模板通过内引物扩增出 1条 378bp特异性条带 ;而以含葡萄糖的培养液 KSOM体外培养发育至 2 -、4 -细胞阶段昆明小鼠早期胚胎G6 PDH m RNA经反转录后 ,通过内外 2对引物均不能扩增出特异性条带。表明 CZB液培养的昆明小鼠 2 -、4 -细胞期胚胎 G6 PDH基因已转录与表达 ,磷酸戊糖途径已是其代谢葡萄糖的主要方式之一 ;而以 KSOM液培养的昆明小鼠2 -、4 -细胞期胚胎 G6 PDH基因没有转录与表达。说明培养液中含有葡萄糖的昆明小鼠 2 -、4 -细胞期胚胎不存在磷酸戊糖代谢途径 ,不含葡萄糖的则存在磷酸戊糖途径。     

利用CRISPR/Cas9系统构建绿色荧光转基因斑马鱼

斑马鱼是研究人类疾病的重要动物模型,基因组定点编辑技术在利用斑马鱼研究同源基因功能方面提供了简便高效的途径。利用CRISPR/Cas9系统,在斑马鱼TU品系第5号染色体中选择靶位点,将Cas9 mRNA、靶位点识别的sgRNA和带有同源重组臂、利用短链肌球蛋白(Mylz2)启动子启动的绿色荧光蛋白(eGFP)基因显微注射到斑马鱼受精卵中,获得在该位点定点插入外源基因,并在肌肉中特异表达绿色荧光蛋白的转基因斑马鱼。利用基因组DNA的PCR扩增,结合激发光下斑马鱼胚胎荧光表达情况,在存活的87尾幼鱼中发现其中45尾有荧光表达,同源重组率为51.724%。研究表明,利用CRISPR/Cas9系统成功定点插入外源基因,并获得在肌肉中特异性表达绿色荧光的斑马鱼。     

家蚕体节极性基因(Bmdpp)的克隆与表达研究

体节极性基因dpp是昆虫发育过程中的关键基因。采用生物信息学的方法,利用家蚕EST数据获得了家蚕dpp基因(Bmdpp)cDNA序列。该cDNA序列全长1 206 bp,ORF1 146 bp,编码381个氨基酸,预测蛋白分子质量38.6 kD,等电点9.18。将克隆的Bmdpp基因完整CDS序列亚克隆到pET-28a(+)表达载体,转化、诱导后经SDS-PAGE电泳检测到约40 kD与预测分子质量相符的目的蛋白条带。对Bmdpp在家蚕胚胎不同发育时期的表达分析发现,该基因在受精6~14 h的表达量很低,甚至没有表达。这一表达模式和果蝇dpp基因在胚胎发育过程中的表达模式相似,推测Bmdpp在家蚕早期胚胎发育的背-腹轴分化中起作用。     

牛孤雌发育胚胎干扰素-τ基因的表达规律

采用地高辛(DIG)标记的DNA探针,对体外生产的不同日龄(3,5,6,7,9d)的牛孤雌发育胚胎细胞中干扰素(IFN)τ基因表达产物mRNA进行原位杂交,研究牛孤雌发育胚胎中IFNτ基因的表达情况。结果显示IFNτ基因从第6d的早期囊胚开始表达,第7d囊胚的IFNτ表达量明显提高。胚龄相同而发育阶段不同的胚胎IFNτ表达量有差异,第9d的孵化囊胚IFNτ表达量要高于未孵化囊胚的。     

小鼠胚胎母源基因转向合子基因组的转换起始点

为研究母、父源基因以及合子基因在动物胚胎早期发育中发挥功能的重要时间节点,本实验利用转增强型荧光蛋白(EGFP)基因小鼠(♀/♂),分别与野生型小鼠进行交配,收集受精后的胚胎于倒置荧光显微镜下观察,寻找EGFP基因在不同胚胎发育阶段时间节点表达的特征,作为直观判断母源基因向合子基因的转换时间起始点的生物标志。结果发现:从EGFP转基因母鼠获得的5枚卵母细胞/原核胚中表达了EGFP基因,在荧光显微镜下表现出绿色荧光;而从野生型母鼠获得的20枚胚胎到2-细胞(2-cell)期后开始表现出绿色荧光,随着胚胎的发育,出现荧光的胚胎数量逐渐增多,达到5枚。综上,EGFP基因可以作为小鼠胚胎发育过程中合子基因的标志物,小鼠胚胎发育过程中母源基因向合子基因转换的时机在胚胎发育的2-cell期。     

山羊合子基因组激活期基因差异表达的研究

本研究用mRNA差异显示技术对山羊体内发育和体外培养的8～16细胞期的胚胎基因差异表达进行研究。结果表明:8～16细胞期共检测到14条特异性表达的基因片段克隆测序,其中11条为体内发育胚胎特异性表达,3条为体外培养胚胎特异性表达。通过GenBank/Blast数据库同源性检索发现,3个基因片段在EST库中可以找到同源的表达标签,11个未见同源片段,是首次发现其在山羊植入前发育阶段表达。体内发育胚胎特异性表达的片段在合子型基因激活过程中起着重要作用,体外培养胚胎的这些基因不表达,是导致胚胎发育阻滞的原因。     

microRNA与胎盘发育关系的研究进展

microRNA (miRNA)是一类大小约22 nt的内源性非编码RNA,它们通过剪切靶基因的转录产物或抑制靶基因转录产物的翻译,在转录后起到调控靶基因表达的作用。大量研究结果表明,动物体内的miRNA参与了胚胎的早期发育、脑和神经发育、心脏发育、肌肉及骨骼发育等动物发育的各个方面。已有证据表明,一些miRNA在胎盘中特异表达,在胎盘的正常发育过程中起到了重要作用。作者对参与胎盘发育的miRNAs进行了综述。     

MLP在肉鸡、蛋鸡及其与鹌鹑属间杂交禽胚胎肌肉发育过程中的差异表达

本研究旨在探讨MLP基因在蛋种鸡(♂)×鹌鹑(♀)和肉种鸡(♂)×鹌鹑(♀)子代杂交禽胚胎肌肉发育过程中的表达规律,以及该基因在2种杂交禽中的差异表达情况。通过人工受精获得蛋鸡、肉鸡(♂)与鹌鹑(♀)杂交禽蛋,将4种受精蛋在相同条件下孵育。通过实时荧光定量PCR对7~17d胚胎胸肌组织中MLP基因的mRNA相对表达量进行测定,4种胚胎样品每天各测1次。结果显示,在胚胎肌肉发育的7~12d,4个物种的MLP mRNA表达水平很低,且在13d出现瞬时增高。其中,MLP mRNA的表达在鹌鹑胚胎发育14d达到高峰,在肉鸡胚胎发育的15d达到高峰。肉杂交禽在13~17d维持相对稳定的高表达水平,并在14,16d达到高峰。而蛋杂交禽在15d达到高峰后出现极显著性下降。上述结果表明,MLP mRNA的表达规律与肌管融合相一致,可能参与到肌管的融合过程,MLP可能在胚胎肌肉生长和发育过程中起调控作用。     

Iloprost对猪早期胚胎体外发育的影响

本研究旨在探讨PGI2类似物iloprost对猪胚胎体外发育的影响。试验以IVF胚胎为研究对象,分别在不同时期(0、24、48、72h)将不同浓度(0、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0μmol.L-1)iloprost加入到猪胚胎培养液中,于156h时记录囊胚发育率和囊胚细胞数,筛选获得最佳添加方案,检测胚胎脂肪代谢速度和代谢相关基因(cox2、creb、pparδ、pdk、cpt2)的表达水平,分析iloprost影响胚胎发育的机制。结果显示,最佳的添加方案为,在受精后48h加入2.0μmol.L-1 iloprost,胚胎囊胚发育率(28%)和囊胚细胞数(49.42)显著高于(P<0.05)对照组的囊胚发育率(16%)和囊胚细胞数(28.22);添加iloprost后,胚胎脂肪酸降解速度也显著加快(P<0.05),脂肪酸代谢相关基因cox2、creb、pparδ、cpt2的表达量上升,糖代谢相关基因pdk表达量无显著变化。结果表明,PGI2类似物iloprost可以促进胚胎降解脂肪酸,为胚胎发育提供能量,提高了胚胎体外发育能力。     

家畜的早期胚胎生理

“受精”还不能说就是“受胎”,因为从受精排卵到附植的过程中是十分复杂的。不少受精卵没有能发育成胎儿。为了提高受胎率,防止胚胎早期死亡,应该知道早期胚胎的生理。(一)早期胚胎的发育受精完成以后,当合子一旦开始发育,就称为早期胚胎。早期胚胎的发育,可分为以下三期: 1.桑椹期:第一次卵裂,合子分为二个分裂球之后,继续进行分裂,但分裂球并不同时     

骨形态发生蛋白基因mRNA在牛卵巢组织中的表达研究

骨形态发生蛋白(BMP15)基因主要在哺乳动物卵巢中表达,对卵泡的发育和分化起重要作用.研究根据其他物种BMP15基因的保守序列设计特异性引物,采用RT-PCR技术,从牛卵巢中提取总RNA,扩增出BMP15 cDNA序列;将此片段克隆到pGM-T载体中,经PCR鉴定和DNA序列测定分析验证,符合BMP家族基因结构特征,然后根据此序列构建cRNA探针,利用原位杂交技术检测牛卵巢BMP15基因 mRNA的表达情况.原位杂交结果显示,牛BMP15基因,在初级卵泡和次级卵泡早期表达,在初级和次级卵泡的颗粒细胞中也表达,在次级卵泡晚期也有表达,同时BMP15基因在透明带周围表达,这可能是透明带周围细胞中的BMP15基因渗透到透明带中.     

牛体外受精胚胎早期发育过程中基因差异表达的研究

本研究旨在筛选牛体外受精胚胎早期发育差异表达基因,并进行差异表达分析。选取牛卵母细胞、体外受精8细胞期和囊胚期胚胎为试验材料,进行mRNA差异表达研究。初步克隆出4个牛卵母细胞和早期胚胎发育不同阶段差异表达的基因,同源性分析显示,它们分别与高移动样蛋白盒结构域4基因(HMGXB4)、热休克蛋白40亚家族C成员8基因(Dnajc8)、突触膜胞吐调节2基因(RI MS2)和核糖体蛋白L31基因(RPL31)高度同源。RT-PCR检测验证,HMGXB4、Dnajc8、RI MS2和RPL31在牛卵母细胞和早期胚胎发育过程中mRNA表达量存在时间性差异,可能与其参与不同的生理活动有关。     

斑马鱼E3泛素连接酶基因的生物信息学分析和mRNA表达

目的对斑马鱼E3泛素连接酶基因进行生物信息学分析,并研究其mRNA表达情况。方法利用生物信息学方法分析斑马鱼E3泛素连接酶基因的cDNA序列、蛋白质二级结构、结构域、氨基酸序列同源性,并构建进化树;利用整胚原位杂交技术研究目的基因在斑马鱼体内的mRNA表达模式。结果在NCBI基因库中找出TRIM54、TRIM55a、TRIM55b、TRIM63a、TRIM63b和TRIM101 6个斑马鱼E3泛素连接酶基因。这些基因之间有较高的同源性,二级结构以α-螺旋和无规卷曲为主,编码的蛋白质均含有3个保守结构域：环锌指、B-box锌指和卷曲螺旋。进化树分析显示,所有基因聚为4组：各物种TRIM54基因聚为一组;各物种TRIM55基因聚为一组,但靠近于斑马鱼TRIM101基因分支;TRIM63基因分为一组。整胚原位杂交结果显示,这些TRIM基因的mRNA均在受精后24 h的斑马鱼的肌节中表达,且TRIM55a、TRIM63a和TRIM101基因表达量较高。这些TRIM基因在肌肉发育和肌肉功能中可能发挥作用。结论斑马鱼的6个E3泛素连接酶基因有较高的保守性,其mRNA特异性表达于肌节部位。结果对深入研究这些基因在鱼类肌肉中的作用和指导鱼类生产具有一定的意义。     

自噬调节因子Atg5和Beclin1在不同来源小鼠胚胎早期发育过程中的表达分析

旨在探究自噬调节因子Atg5和Beclin1在胚胎早期发育过程中的表达模式及胚胎的不同生产方式对两种因子表达的影响。本研究将6~8周龄雌性小鼠进行超数排卵,分为2组,一组收集小鼠卵母细胞,孤雌激活处理后进行体外培养;另一组超排小鼠与公鼠1：1合笼,第2天收集小鼠受精卵进行体外培养;分别在2细胞期、4~8细胞期、桑葚胚期和囊胚期收集不同阶段小鼠孤雌激活胚胎和自然受精胚胎。提取RNA和蛋白,通过实时荧光定量PCR、Western blot等方法检测自噬关键因子Atg5和Beclin1的表达,通过间接免疫荧光法检测Atg5和Beclin1在小鼠囊胚中的表达定位。结果显示,小鼠自然受精和孤雌激活胚胎在发育各时期均可表达Atg5和Beclin1,表达量在胚胎发育的早期呈现出较高的水平,其中二者的表达在小鼠自然受精胚胎中从2细胞期起逐渐降低,而在孤雌激活胚胎的4~8细胞阶段表达量最高,与同期自然受精胚胎差异极显著（P<0.01）;从4细胞期开始,各时期孤雌激活胚胎中Atg5和Beclin1蛋白表达水平均高于自然受精胚胎,差异极显著（P<0.01）;在囊胚中,滋养层细胞和内细胞团中均可检测到Atg5和Beclin1蛋白的荧光,但内细胞团中的荧光强度高于滋养层细胞,且Beclin1蛋白在孤雌激活胚胎囊胚内细胞团中荧光强度高于自然受精胚胎。自噬关键因子Atg5和Beclin1在不同来源小鼠胚胎早期发育各时期均有不同程度的表达,提示自噬对早期胚胎发育的调控作用与胚胎的生产方式存在一定关联,研究结果为进一步探索细胞自噬参与哺乳动物胚胎发育的生理调控提供理论依据。     

骨形态发生蛋白基因mRNA在牛卵巢组织中的表达研究

骨形态发生蛋白(BMP15)基因主要在哺乳动物卵巢中表达,对卵泡的发育和分化起重要作用。研究根据其他物种BMP15基因的保守序列设计特异性引物,采用RT-PCR技术,从牛卵巢中提取总RNA,扩增出BMP15cDNA序列;将此片段克隆到pGM-T载体中,经PCR鉴定和DNA序列测定分析验证;符合BMP家族基因结构特征,然后根据此序列构建cRNA探针,利用原位杂交技术检测牛卵巢BMP15基因mRNA的表达情况。原位杂交结果表明:牛BMP15基因,在初级卵泡和次级卵泡早期、初级和次级卵泡的颗粒细胞次级卵泡晚期都有表达,同时BMP15基因在透明带周围也表达,这可能是透明带周围细胞中的BMP15基因渗透到透明带中。     

哺乳动物胚胎基因组表达起始的调控

哺乳动物受精后 ,早期胚胎缺乏转录活性 ,早期发育由母源性的转录产物所调节。合子基因组激活的时期因物种而异。合子基因组激活可分为 2个时期 :起始阶段低水平的表达和第 2阶段爆发式的表达。在小鼠 1 细胞期胚 ,雌原核无转录活性 ,但雄原核出现基因转录。在 2 细胞早、中期之前 ,小鼠特异性基因的表达不需要增强子的作用 ,其启动子没有受到抑制 ,但由于基本转录因子的浓度较低 ,基因转录活性不高。基因高水平的转录发生在小鼠 2 细胞后期 ,此时转录抑制建立 ,特异性基因的转录依赖于增强子的作用。