发根农杆菌介导的花苜蓿毛状根转化体系的建立

为开发一种高效的花苜蓿（Medicago ruthenica）转化体系,本试验以‘中科1号’花苜蓿为材料,使用发根农杆菌作为介导进行毛状根转化,并分析毛状根发生率和转化率。试验表明：利用本研究开发的方法可使花苜蓿在一周左右产生毛状根,其发生率可达72%;经鉴定,毛状根中成功转入基因并超表达的占66.7%。花苜蓿毛状根转化体系的建立将为其功能基因研究提供有力的手段,进而为苜蓿育种奠定基础。     

阿拉尔野生一年生草木樨资源的生产性能和营养品质研究

为了发掘野生种质资源的优良性状，选育一年生草木樨（Melilotus）新品种，本试验以采自新疆阿拉尔市区稀有的野生一年生细齿草木樨（Melilotus dentatus Pers.）和野生一年生白花草木樨（M.albus Desr.）为材料，以‘牧科草木樨1号’（M.officinalis ‘Muke sweet clover No.1’）为对照，于2016-2017年在新疆阿拉尔市对其农艺性状和营养成分进行了测定和分析。结果表明，一年生细齿草木樨的初花期比‘牧科草木樨1号’晚39~41 d，干草产量为12 078.64 kg·hm^-2（2016年）和10 473.83 kg·hm^-2（2017年），比‘牧科草木樨1号’产量增加200.96%（2016年）和106.78%（2017年），等权关联度最高。一年生白花草木樨的初花期比‘牧科草木樨1号’晚6 d，干草产量为5 610.43 kg·hm^-2（2016年）和5 335.68 kg·hm^-2（2017年），比‘牧科草木樨1号’产量增加39.79%（2016年）和5.34%（2017年），粗蛋白、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量分别为18.33%，42.00%和35.23%，等权关联度排列第二。阿拉尔野生一年生细齿草木樨和野生一年生白花草木樨种质资源的产量较高，综合表现较好，是一年生草木樨新品种选育的重要基因资源和基础材料。     

衡阳紫色土丘陵坡地5种生态恢复模式的效果比较

为明确衡阳紫色土丘陵坡地适宜的生态恢复模式，本试验对比分析了衡阳紫色土地区草地（白花草木樨（Melilotus albus）-猪屎豆（Crotalaria pallid））、灌草（紫穗槐（Amorpha fruticosa）+白花草木樨）、灌丛（沙地柏（Sabina vulgaris）-马桑（Coriaria nepalensis））、乔灌（枫香（Liquidamdar formosana）+紫穗槐）与自然恢复模式下的土壤养分和植物群落结构。结果表明：恢复20年后，自然恢复、草地、灌草、灌丛与乔灌模式下出现的植物种类分别为8，17，16，20，13种，自然恢复模式以一年生草本植物为主，草地、灌草、灌丛与乔灌模式则以人工种植的植物为主，各恢复模式主要伴生种为狗牙根（Cynodon dactylon），马兰（Kalimeris indica），鬼针草（Bidens pilosa），狗肝菜（Disliptera chinensis），铁苋菜（Acalypha australis）以及酢浆草（Oxalis corniculata）等；灌草模式的Shannon多样性指数最高，Pielou均匀度指数最大，土壤全氮、有机质含量较高；基于土壤养分、pH值、物种多样性指数共11项指标的4个主成分变量（累计贡献率达90.5%）综合评价得出，灌草模式即紫穗槐（Amorpha fruticosa）+白花草木樨的恢复效果较好，具有较高推广价值。     

发根农杆菌介导的细茎柱花草毛状根转化体系的建立

细茎柱花草(Stylosanthes gracilis)是圭亚那柱花草(S.guianensis)的野生近缘种，具有茎秆直立、种子落粒性低、抗旱能力较强等特点。为开发一种高效的细茎柱花草毛状根转化体系，本研究以细茎柱花草子叶节为外植体及4个发根农杆菌为供试菌种，探索菌液浓度、侵染时间、共培养时间对毛状根转化效率的影响。结果表明MSU440为诱导毛状根发生的最优菌株，诱导率为88.3%。其中，该菌株诱导毛状根产生的最佳条件为菌液浓度OD600=0.3、侵染时间为15 min、共培养4 d,转化效率达34.72%。同时，获得的转基因材料通过聚合酶链式反应(PCR)和蛋白质免疫印迹(Western blot)分子鉴定方式，证实了外源基因已整合到细茎柱花草毛状根的基因组中。因此，本研究成功建立了一种细茎柱花草的毛状根转基因体系。     

发根农杆菌介导的箭筈豌豆毛状根遗传转化体系的建立

首次建立了箭筈豌豆的毛状根遗传转化体系,利用ARqua1和K599两种发根农杆菌成功诱导出阳性转基因毛状根,其中更适合诱导箭筈豌豆毛状根的是ARqua1菌株。在无菌和非无菌条件下,ARqua1菌株的阳性毛状根诱导效率分别为81.7%、35.4%,而K599菌株的阳性毛状根诱导效率分别为70.0%、33.3%。PCR检测和GUS染色结果表明,GUS基因在毛状根中稳定表达,毛状根遗传转化体系可应用于箭筈豌豆分子和蛋白水平的初步研究。     

紫花苜蓿花青苷合成的转录组分析

为探究紫花苜蓿（Medicago sativa）花色形成的分子机制，本试验以紫花苜蓿及其白花突变体为研究材料，进行转录组测序。结果表明：紫花和白花之间共有差异表达基因4 857个；代谢通路富集分析中，苯丙氨酸生物合成途径等6条代谢通路显著富集；研究还发现类黄酮合成通路中关键基因二氢黄酮醇4-还原酶（Dihydroflavonol 4-reductase，DFR）在白花突变体中的表达量显著下调，其启动子中存在MYB和bHLH等转录因子的结合位点；转录组以及荧光定量PCR的结果均表明：MYB，bHLH和WD40等基因的表达量都具有显著性差异。这些结果表明MYB转录因子或MBW复合物可能通过调控DFR的转录影响紫花苜蓿花色形成。本试验为探明紫花苜蓿花青苷合成的分子机制提供了理论基础。     

新疆大叶紫花苜蓿BADH基因转化体系的研究

以新疆大叶苜蓿（Medicago sativa ‘Xinjiang Daye’）叶片作为转化受体,利用农杆菌介导法将从梭梭（Haloxylon ammodendron）中获得的甜菜碱醛脱氢酶基因（BADH）转化紫花苜蓿,研究选择剂卡那霉素对愈伤组织分化的影响,并采用正交试验设计优化了影响紫花苜蓿转化的4个主要因子,建立了农杆菌介导的紫花苜蓿高效转化体系,获得了转基因植株。结果表明：卡那霉素在愈伤组织分化培养时的上限浓度以50 mg·L^-1为宜;转化过程中当浸染时间为5 min,菌液浓度OD₆₀₀为0.2,外植体预培养6 d,共培养后清洗外植体的头孢雷素（Cef）浓度为800 mg·L^-1是最佳转化方案,抗性芽分化率达到65.5%;4个因子中菌液浓度对转化率影响最大,清洗外植体的Cef浓度和浸染时间影响次之,外植体预培养时间的影响最小。经PCR和RT-PCR检测,初步证明了BADH基因已经整合到紫花苜蓿中,转化率为16.0%。     

紫花苜蓿MsCCD4基因克隆及耐盐功能鉴定

为验证紫花苜蓿(Medicago sativa L.)胡萝卜素裂解双加氧酶(Carotenoid cleavage dioxygenase，CCD)基因的耐盐功能，本试验克隆了紫花苜蓿MsCCD4的CDS全长序列，并以其叶片为试验材料，通过发根农杆菌介导的毛状根诱导法获得过表达MsCCD4的转基因毛状根，验证过表达MsCCD4对紫花苜蓿耐盐性的影响。结果表明：MsCCD4为稳定的酸性亲水蛋白质，二级结构以无规则卷曲为主，C-端含有RPE65保守结构域；MsCCD4启动子区含有光响应、激素应答和非生物胁迫响应结合元件；盐胁迫可诱导MsCCD4表达量升高；盐胁迫生理实验证明，过表达MsCCD4可以增强毛状根的耐盐性。本研究为紫花苜蓿耐盐遗传改良提供基因资源及耐盐基因快速鉴定方法。     

不同类型抗蒸腾剂对4种草本植物叶片水分利用效率的影响

为探究3种抗蒸腾剂叶片喷施对4种草本植物水分消耗和利用的影响规律,比较得出不同抗蒸腾剂的最佳使用浓度,为干旱荒漠区采煤迹地植被保育技术提供参考,本试验以蒙古冰草（Agropyron mongolicum Keng）、沙打旺（Astragalus adsurgens Pall.）、白花草木樨（Melilotus albus Medic.ex Desr.）、蜀葵（Althaea rosea （Linn.）Cavan.）4种草本植物为研究对象,每种草叶面分别喷施不同类型和浓度的抗蒸腾剂：旱地龙（Fulvic Acid,FA）浓度分别为1,2,3,4 g·L^-1;冠存（Guan Cun,GC）浓度分别为3,6,9,12 g·L^-1;高岭土（Kaolin,KL）浓度分别为20,40,60,80 g·L^-1,以喷施清水为对照,喷施3个月后测定其对4种草叶片蒸腾速率（Transpiration rate,Tr）、净光合速率（Net photosynthetic rate,Pn）、水分利用效率（Water use efficiency,WUE）和生物量的影响。结果表明：在试验浓度区间内,FA浓度越高,蒙古冰草、沙打旺、白花草木樨的Tr值越小、Pn值越小,WUE呈现先升高再降低的趋势;GC喷施浓度越高,蒙古冰草、沙打旺、白花草木樨叶片的Tr值越小、WUE值越大,Pn值较对照低但各浓度间未达到显著性差异;KL喷施浓度越高,蒙古冰草与蜀葵各浓度处理的Pn值越小、WUE值越小,Tr值较对照低但各浓度间未达到显著性差异。3种抗蒸腾剂对蒸腾速率的抑制程度均为GC和KL大于FA,对净光合速率的抑制程度均为KL和GC小于FA,对水分利用效率的提升程度均为KL和GC大于FA。综合3种抗蒸腾剂在植物叶面的喷施效果,GC和KL喷施效果较好,FA较差;蒙古冰草与沙打旺喷施12 g·L^-1的GC、白花草木樨与蜀葵喷施20 g·L^-1 KL的措施可用于干旱荒漠区采煤迹地的植被恢复。     

柱花草SgNramp1和SgNramp2基因克隆与表达分析

为了探究植物天然抗性相关巨噬蛋白（Nramp）在金属元素吸收、转运和分配等方面的重要作用，本研究以柱花草（Stylosanthes guianensis）为材料，采用PCR方法克隆了柱花草SgNramp1/2基因，并分析了该基因的表达模式。结果表明：SgNramp1和SgNramp2基因全长分别为1 654 bp和1 716 bp，且均含有12个跨膜结构域。基因表达分析发现，SgNramp1在柱花草根部的表达高于叶部，而SgNramp2则在叶中特异性表达；金属元素缺乏和过量胁迫对SgNramp1/2基因表达的影响有所差异，缺锰（-Mn）处理抑制了SgNramp1/2基因在根和叶中的表达，而缺铁（-Fe）处理则增强了SgNramp2基因在叶中的表达，但抑制了其在根中的表达，SgNramp1/2基因在根和叶中的表达至少受到一种元素过量胁迫的影响。此外，金属镉（Cd）处理均增强了SgNramp1/2基因在柱花草根中的表达，而铝（Al）和镧（La）处理抑制了SgNramp1基因的表达，但增强了SgNramp2基因的表达。本研究结果表明SgNramp1/2基因可能参金属离子的转运。     

紫花苜蓿毛状根转化体系的建立及应用

以紫花苜蓿品种WL-525HQ为材料,用发根农杆菌介导毛状根转化,分析毛状根分化率及转化率,筛选最优的转化方案,以快速获得紫花苜蓿转基因材料.结果 表明:当发根农杆菌侵染苜蓿叶片的菌液浓度OD600达0.5时,毛状根分化率可达72％;筛选培养基中添加5～8mg/L潮霉素时,毛状根的分化率及转化率都相对较高,分别为30....     

低磷胁迫对崖州硬皮豆生长及酸性磷酸酶活性的影响

本试验为探究硬皮豆（Macrotyloma uniflorum）对低磷胁迫的响应机制,以‘崖州硬皮豆’为材料,采用水培方法,分析了不同磷浓度（5 μM,100 μM和250 μM KH₂PO₄）处理对硬皮豆生长和生理特性的影响。结果表明：与100 μM和250 μM磷处理相比,5 μM低磷处理抑制了硬皮豆株高、复叶数、叶面积、总根长,根表面积和根体积以及植株干重。同时,5 μM磷处理显著降低了地上部和根部磷含量、降低了叶片和根系可溶性磷含量和细胞壁磷含量;与100 μM和250 μM磷处理相比,5 μM磷处理增加了叶片和根系总酸性磷酸酶（Acid phosphatase,ACP）活性和细胞壁ACP活性;5 μM磷处理下叶片和根系总ACP活性是250 μM磷条件下的1.5~1.6倍,而叶片和根系细胞壁ACP活性是250 μM磷条件下的1.2~1.3倍。因此,提高酸性磷酸酶活性可能是硬皮豆响应低磷胁迫的重要机制。     

瑞香狼毒根提取物对荞麦桃蚜的毒力及其作用机制

蚜虫是荞麦(Fagopyrum esculentumMoench)花期的主要害虫,对荞麦产量影响很大,本论文研究了不同浓度瑞香狼毒(Stellera chamaejasme L.)根提取物对荞麦桃蚜的杀虫活性以及对其体内2种靶标酶和3种解毒酶活性的影响。结果表明：瑞香狼毒根石油醚提取物对桃蚜有较强的毒杀作用,24 h对桃蚜的致死中浓度LC₅₀为1 243.7 mg·L^-1。桃蚜经提取物处理24 h后,其体内乙酰胆碱酯酶活性受到抑制,最高抑制率为21.7%;腺苷三磷酸酶活性升高,Na⁺-K⁺-ATPase和Ca²⁺-Mg²⁺-ATPase活性在提取物浓度为4 000 mg·L^-1时最大,显著高于未处理桃蚜两种酶活性,分别是未处理的12.0和1.8倍。瑞香狼毒根提取物提高了桃蚜体内解毒酶——谷胱甘肽-S-转移酶和细胞色素P₄₅₀的活性,降低了羧酸酯酶活性。综上,瑞香狼毒根石油醚提取物对桃蚜有很好的毒杀作用,提取物可影响桃蚜的靶标酶和解毒酶活性,干扰其正常生理生化活动。     

农杆菌介导的葡萄风信子愈伤组织遗传转化体系的优化

葡萄风信子(Muscari spp.)为百合科葡萄风信子属植物的总称，该属植物多具有稀少的正蓝色花色，是研究单子叶植物花青苷合成机理的模式材料。为开发一种高效的葡萄风信子遗传转化体系，本试验以葡萄风信子常见种亚美尼亚(M.armeniacum)、栽培品种‘黑眼睛’(M.aucheri‘Dark Eyes’)为材料，用叶片和花蕾分别诱导获得愈伤组织，对愈伤组织的潮霉素敏感性进行测试，对根癌农杆菌介导的愈伤组织遗传转化体系进行优化。试验结果表明：葡萄风信子亚美尼亚和‘黑眼睛’愈伤组织的潮霉素临界浓度分别为150 mg·L^-1和120 mg·L^-1。GUS染色结果显示不同基因型、不同农杆菌菌株及不同功率超声处理的愈伤组织瞬时转化效率差异不显著。而液体培养的花源愈伤组织能获得更高的瞬时转化效率，为葡萄风信子遗传转化的最优受体。其最高瞬时转化效率为98.73%。试验共获得了209块抗性愈伤组织，经PCR和RT-PCR检测，阳性率可达90%。本研究为在葡萄风信子中快速有效的开展基因功能研究奠定了技术基础。     

蒺藜苜蓿MtDWF1基因克隆、亚细胞定位及表达特征分析

Delta24-甾醇还原酶(Delta24-sterol reductase, DWF1)是油菜素内酯(Brassinosteroide, BR)合成途径中的关键酶，在植物生长发育中起着关键性的作用。为了研究DWF1基因在蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)中的功能，本试验从蒺藜苜蓿R108中克隆MtDWF1基因全长序列，该基因开放阅读框(ORF)1 704 bp,编码567个氨基酸，分子量65.911 kD,理论等电点为8.53。亚细胞定位显示，该蛋白定位于细胞质内。进化分析表明，蒺藜苜蓿MtDWF1蛋白与鹰嘴豆(Cicer arietinum)、红三叶(Trifolium pratense)及豌豆(Pisum sativum)亲缘关系较为接近。MtDWF1基因在蒺藜苜蓿根、茎、叶中均有表达，在茎和叶中的表达水平较高。外源激素脱落酸(Abscisic acid, ABA)能够明显提高MtDWF1表达，水杨酸(Salicylic acid, SA)能够显著降低MtDWF1表达水平。同时，经油菜素内酯诱导后，MtDWF1表达水平整体呈现增加趋势。本研究为进一步探索MtDWF...     

GsCRCK基因转化农菁1号苜蓿及其耐盐性分析

GsCRCK基因是参与胁迫早期应答的钙/钙调素调控的受体类蛋白激酶基因,研究发现GsCRCK正向调控拟南芥对NaCl和ABA胁迫的耐性,将耐盐蛋白激酶基因GsCRCK转化苜蓿,对于增强苜蓿的耐盐性具有重要的现实意义。本研究采用农杆菌介导法将其转入农菁1号苜蓿,获得大量抗性植株。经 PCR和RT-PCR检测证明GsCRCK基因已整合到农菁1号苜蓿基因组中并在转基因植株中转录表达。对获得的2个转基因株系进行耐盐性分析,在300 mmol/L NaCl条件下进行胁迫处理,测定处理0,3,6,9,12,15 d后的质膜透性、丙二醛(MDA)和叶绿素(Chl)含量,以及胁迫15 d时的SOD活性;并统计400 mmol/L NaCl处理15 d时各株系的死亡率。结果显示,300 mmol/L 高盐胁迫15 d后转基因苜蓿仍能正常生长,而野生型苜蓿则遭受盐害严重;转基因苜蓿的相对电导率极显著低于野生型,MDA含量也显著低于野生型,而Chl含量和SOD活性都显著高于野生型;在400 mmol/L NaCl处理下,2个转基因株系的死亡率分别为13.33%和10.00%,明显低于野生型植株(63.33%)。表明GsCRCK基因的导入提高了转基因苜蓿的耐盐性。     

过表达长穗偃麦草EeHKT1；4基因增强拟南芥抗旱耐盐性分析

植物高亲和性K⁺转运蛋白基因（HKT）编码K⁺、Na⁺转运或K⁺-Na⁺共转运质膜通道蛋白,在植物抗逆过程中发挥重要作用。为了研究长穗偃麦草EeHKT1;4（GenBank： KF956112.1）的功能作用,构建了EeHKT1;4过表达植物表达载体转化拟南芥,进行拟南芥转基因植株的抗旱耐盐性评价分析。结果显示,正常生长条件下野生型（WT）与转基因株系的主根长度无差异,NaCl与甘露醇处理下WT和转基因株系根的生长受到抑制,转基因株系根长度均大于同等胁迫条件下（WT）的根长;正常生长条件下WT与转基因株系表型无显著差异,但在NaCl与甘露醇处理下WT表现出叶片萎缩和植株枯黄,转基因株系仅部分植株表现出叶片萎缩,同一胁迫条件下转基因株系的植株存活率皆高于WT。硝基氮蓝四唑（NBT）与二氨基联苯胺（DAB）染色结果显示,正常生长条件下WT与转基因株系叶片染色相对较浅,随着NaCl与甘露醇浓度提高,所有叶片染色程度逐渐加深且同等胁迫下WT染色程度高于转基因株系。以正常生长条件下基因的表达量为对照,随着NaCl浓度的增加,AtSOS1基因在WT和转基因植株中逐渐上调且在转基因中的表达量高于WT;AtNHX1基因在NaCl处理下上调表达且转基因植株中表达量低于WT,除转基因株系L5外并未检测到WT和转基因株系自身因NaCl浓度的提高AtNHX1基因表达量发生改变;在甘露醇处理下,AtRD29B和AtP5CS1基因均上调表达且转基因植株中表达量高于WT。综上所述,EeHKT1;4过表达降低了逆境胁迫下拟南芥中超氧阴离子和H₂O₂的积累,诱导抗逆基因上调表达,增强拟南芥抗旱耐盐性。