噬菌体展示技术及其应用研究进展

噬菌体展示技术(Phage Display techniques,PDT)起源于1985年,是一种用于筛选和改造功能性多肽、蛋白质强有力的生物技术,广泛应用于研究蛋白质的结构与功能,蛋白质间的识别与作用,分离体内特异蛋白质与基因以及实验进化等多个分子生物学领域.目前噬菌体展示技术的研究进展非常迅速,在抗原决定簇的定位、蛋白质相互作用位点的确定、特异调节分子的分离和人工抗体和疫苗的制备、诊断技术、酶抑制剂的研究开发、多肽药物的研制等生物技术研究的不同领域得到了应用,并对这些领域产生了深远的影响.     

噬菌体展示技术及其应用研究进展

噬菌体展示技术（Phage Dlsplay techniques，PDT）起源于1985年，是一种用于筛选和改造功能性多肽、蛋白质强有力的生物技术，广泛应用于研究蛋白质的结构与功能，蛋白质间的识别与作用，分离体内特异蛋白质与基因以及实验进化等多个分子生物学领域。目前噬菌体展示技术的研究进展非常迅速，在抗原决定簇的定位、蛋白质相互作用位点的确定、特异调节分子的分离和人工抗体和疫苗的制备、诊断技术、酶抑制剂的研究开发、多肽药物的研制等生物技术研究的不同领域得到了应用，并对这些领域产生了深远的影响。     

噬菌体展示库技术的研究及应用进展

噬菌体展示肽库技术是将外源蛋白质或多肽的基因表达产物与噬菌体衣壳蛋白融合,并在其表面展示,进而通过筛选表达有特异肽或蛋白质的噬菌体,得到大量富集,从而获得目的多肽或蛋白质,在DNA序列分析后应用于实践中。本文叙述了噬菌体展示肽库技术的基本原理、主要构建途径、筛选方法及应用现状和展望。     

噬菌体展示肽库技术的研究及应用进展

噬菌体展示肽库技术是将外源蛋白质或多肽的基因表达产物与噬菌体衣壳蛋白融合,并在其表面展示,进而通过筛选表达有特异肽或蛋白质的噬菌体,得到大量富集,从而获得目的多肽或蛋白质,在DNA序列分析后应用于实践中。本文叙述了噬菌体展示肽库技术的基本原理、主要构建途径、筛选方法及应用现状和展望。     

基因药物对动物生长的影响

正一、基因药物基因药物也称DNA药物,是基因工程药物的一种。基因工程药物包括重组蛋白多肽药物、反义核酸药物、DNA药物和基因工程抗体等。它是将具有治疗意义的基因重组进真核表达载体,再直接转移到动物或人的细胞内,表达出具有治疗作用的多肽或蛋白质,从而达到预防疾病、治疗疾病、调节动物生长、生产性能等目的。它与传统的蛋白质工程药物不同,不需要在体外合成和表达蛋白质,也不需要在体外     

细胞因子IL-2和IL-12在基因免疫中的佐剂作用

基因免疫(Gene immunization)又称DNA免疫或核酸免疫,是指将编码某种抗原蛋白的外源基因(DNA或RNA)与质粒重组后,利用某种方法直接导入动物细胞内,使带有目的基因的表达载体转化到体内,通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白,诱导宿主产生针对该抗原的抗体并引起特异的免疫应答以     

杆状病毒表达系统在兽用亚单位疫苗领域应用的研究进展

杆状病毒表达系统是以杆状病毒为蛋白质表达载体,昆虫细胞或幼虫为受体的真核表达系统。与原核细胞相比,昆虫细胞可对外源蛋白进行翻译后修饰,如多肽折叠、糖基化、酰基化、磷酸化、二硫键形成及蛋白质水解等。因杆状病毒对畜禽无致病性,这使得杆状病毒表达系统成为一种安全有效的兽用亚单位疫苗生产平台。作者对杆状病毒表达系统在兽用亚单位疫苗领域中的应用作了简要综述。     

抗牛免疫球蛋白G_2单克隆抗体的产生及特征

Kohltr 和 Milstein(Nature 256:495,1975)把小鼠骨髓瘤细胞与免疫供体的脾细胞融合,得到了可产生抗特异免疫原抗体的杂交瘤细胞,使单个细胞克隆化并检测其对免疫原的特异性。筛选到的克隆在体外或鼠体内实验瘤中可以无限生长,并继续分泌单特异性抗体。本文的目的是讨论一种对牛 IgG_2特异的克隆的分离与繁殖。     

抗家禽Beta-连环蛋白多克隆抗体的制备及鉴定

本研究旨在制备能结合家禽Beta-连环蛋白(β-catenin)的特异性多克隆抗体并进行生物学鉴定。根据GenBank中公布的β-catenin序列,经生物软件比对分析筛选一段抗原性好的序列合成多肽,将多肽与KLH偶联免疫新西兰兔。免疫血清经多肽亲和层析后制得纯化的多克隆抗体,并利用Western blot、间接免疫荧光、免疫组化方法对多克隆抗体进行生物学鉴定。研究表明制备的抗家禽β-catenin多克隆抗体可有效检测家禽细胞中天然的β-catenin蛋白。     

含有Th细胞表位的合成PCV2 ORF2 Cap多肽抗原的表达及免疫原性分析

拟测定在PCV2ORF2Cap P1多肽抗原中添加从PCV2ORF1、ORF3中筛选的Th细胞表位多肽在促进其免疫原性中的作用,以及合成表达的PCV2ORF2Cap P1多肽抗原作为疫苗抗原的可行性。采用生物信息学及分子生物学方法,筛选获得1条泛宿主新型Th细胞表位多肽和3条PCV2特异的含有Th细胞抗原表位的多肽序列,然后将这4条Th细胞多肽氨基酸序列与筛选自ORF2Cap1上的1条B细胞表位多肽序列进行串联组合,密码子优化,插入酶切位点、终止密码子,然后进行密码子适应指数和分布频率分析,预测可以实现高效表达后再进行化学合成。合成的P1多肽抗原连接到pET-30a表达载体,并转化至BL21(DE3)pLysS感受态细胞中,构建表达工程菌BL21(DE3)pLysS-pET-30a-P1。经IPTG诱导表达后P1可实现高效表达,SDS-PAGE鉴定表达量,Western Blot鉴定其生物活性,然后分别免疫小鼠和猪,测定小鼠免疫后的抗体水平以及猪免疫后P1合成多肽抗原对外周血淋巴细胞的刺激增殖情况。结果表明,设计合成表达的PCV2P1多肽抗原序列,密码子适应性指数为0.89,能够实现高水平表达,目的片段大小约为28.29ku,具有良好的免疫原性;MTT试验结果表明,P1多肽抗原免疫后机体内IFN-γ和IL-4的表达量明显增加,且与对照组差异显著(P0.05)。这说明P1能够诱导机体产生细胞免疫和体液免疫反应,为其作为疫苗用抗原的进一步研究奠定了理论基础。     

副溶血弧菌T3SS1 VscF蛋白多肽抗体的制备与应用

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种世界范围内广泛存在的革兰氏阴性食源性致病菌,其vscF基因编码的T3SS1针状蛋白VscF,在侵袭宿主细胞过程中扮演重要角色。为深入研究VscF蛋白在T3SS1针状结构组装过程中的功能,并制备VscF特异性多肽抗体,利用OptimumAntigenTM抗原多肽设计软件,筛选最佳抗原目标肽段,然后将肽段与KLH载体蛋白偶联后免疫新西兰大白兔,收集兔血清制备多克隆抗体,并利用间接ELISA、Western Blot、间接免疫荧光检测方法,鉴定多抗效价和特异性。间接ELISA检测结果显示,该多肽抗体效价达1:512 000,显示出该多肽抗体的高敏感度;Western Blot与间接免疫荧光检测结果显示,该多抗能与原核表达的VscF蛋白发生特异性反应。结果表明,筛选的VscF短肽制备的多克隆抗体敏感度高,可作为VscF验证试验中具有特异性结合作用的抗体,能够为后续生物试剂机理研究奠定基础。     

噬菌体展示技术在动物病毒研究中的应用

噬菌体展示技术是20世纪80年代逐步建立并发展起来的一项分子生物学新技术。它以噬菌体或噬粒为载体,使外源肽或蛋白基因与噬菌体表面特定蛋白基因在其表面进行融合表达,进而通过亲和富集法筛选表达有特异肽或蛋白质的噬菌体。利用噬菌体表面展示技术可以构建抗体库、随机肤库、蛋白质突变体库和cDNA文库,从而广泛用于抗原表位、抗体、配体、细胞内信号转导以及药物筛选等研究,具有广阔的应用前景。本文跟踪了目前噬菌体展示技术在动物病毒检测领域的最新研究进展和发展前景。     

诱导多能干细胞过程中重编程因子导入方法研究进展

诱导多能干细胞是将重编程因子导入到各种细胞中,使其大量表达,从而诱导细胞进行重编程为具有与胚胎干细胞特征相似的多潜能性干细胞。最开始多能干细胞的产生主要通过包装逆转录病毒和慢病毒将外源重编程因子导入各种细胞内,但这两种病毒载体会使基因永久整合到宿主基因组上,从而使人们对其安全性产生了质疑。人们采用了非整合型病毒(如腺病毒和仙台病毒)来导入外源基因;但经过不断的研究人们发现在细胞内还是会残留一些病毒,所以又有报道不使用病毒而是利用直接转染、蛋白质介导、转座子等方法将重编程因子导入细胞内,或将小分子化合物添加到培养基中完成细胞的重编程。文章对近年来多能干细胞诱导过程中重编程因子的几种导入方法的来源和优缺点等进行综述。     

基因免疫及其在传染病学中的应用

基因免疫及其在传染病学中的应用沈正达（甘肃农业大学动物医学系,兰州７３００７０基因免疫（ｇｅｎｅｔｉｃｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）又称ＤＮＡ免疫或核酸免疫,是指利用各种方法将带有目的基因的表达载体转化到体内,诱导机体产生抗体并引起特异的免疫应答。基因免...     

蛋白质组学在动物营养中的应用

蛋白质组学是指从蛋白质序列、结构、相互作用、表达、定位以及修饰等方面对一种细胞或一种生物所表达的全部蛋白质进行研究.本文对蛋白质组学的主要研究内容、相关技术及其在动物营养中的应用进行了综述.     

猪肺脏气道上皮干细胞的特异抗体筛选与抗原表达研究

猪肺脏气道上皮主要由基底细胞,克拉拉细胞,纤毛细胞,杯状细胞等上皮细胞类型组成,筛选猪气道上皮干细胞的相关特异性抗体,观察其特异抗原的表达,将有助于对猪气道上皮干细胞的分离、鉴定和生物学特性的研究.试验中,制备远端气道上皮细胞的冰冻切片与细胞爬片,利用免疫荧光染色法,分析不同物种来源的抗体对猪气道上皮细胞的免疫染色反应;同时利用Oct3/4、Sox2、CD133和SSEA-1等10种上皮干细胞相关抗体分析猪气道上皮干细胞表面抗原表达情况.通过试验,筛选出在猪气道上皮干细胞相关抗体,并发现气道组织冰冻切片未检测到这10种抗体相关的阳性细胞,而在细胞爬片中观察到CD49f和CD117阳性细胞数量较多.免疫荧光共染发现这些CD49f和CD117阳性细胞同时也表达基底细胞表面标记Keratin 14.这可能是正常情况下猪气道上皮干细胞数量极为稀少,表面抗原表达量低而不易检测到,在肺脏气道上皮受到外环境刺激时(如消化),上皮干细胞开始增殖以完成损伤修复作用发生数量上的增殖.综上所述,利用Keratin 14和CD49f或CD117(c-kit)双标染色法可以鉴定猪肺脏气道上皮干细胞的候选亚群来用于其生物学特性与功能的研究.     

提高DNA疫苗免疫效果研究进展

<正>DNA疫苗本质上是质粒,包括真核表达载体和整合到载体上的表达特定基因的序列。DNA疫苗通过特定的递送方式进入宿主细胞核,载体携带的特定抗原基因发生转录,m RNA随即至细胞浆,翻译成抗原蛋白。不同于传统的蛋白或多肽疫苗,DNA疫苗免疫宿主后,所表达的抗原(蛋白或多肽)能够在基质细胞(如肌肉细胞)和树突状细胞中表达,这些抗原经过处理,激活B淋巴细胞,诱导产生抗体,发挥体液免疫应答效应;抗原     

家蚕核型多角体病毒多角体蛋白的多克隆抗体制备及应用试验

杆状病毒(baculovirus)多角体蛋白(polyhedrin)是晚期高水平表达的蛋白质,对于维持病毒粒子在自然环境下的稳定性和在宿主之间的传播至关重要。PCR扩增家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm NPV)多角体蛋白基因polh,亚克隆到原核表达载体p ET32,获得重组质粒p ET32-polh,并转化至大肠埃希菌(Escherichia coli)BL21(DE3)表达菌株进行原核表达,诱导表达的融合蛋白带His标签,经镍柱纯化后用于免疫新西兰大白兔,制备抗多角体蛋白的多克隆抗体。Western blot检测该多克隆抗体能够特异识别Bm NPV的多角体蛋白。利用该多克隆抗体进行免疫荧光和Western blot分析多角体蛋白的亚细胞定位及表达时相,结果显示多角体蛋白定位于细胞质,且在病毒感染后48 h才可以被检测到。该多克隆抗体可用于Bm NPV多角体蛋白的功能研究。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体间接ELISA检测方法的建立

猪感染猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)14 d后就可以产生针对非结构蛋白(Non-Structural Protein 7,Nsp7)的抗体,而且抗体水平很高,与N蛋白抗体水平相似,但比N蛋白抗体持续时间更长。另外,检测Nsp7抗体可用于区分PRRSVⅠ型和Ⅱ型的感染。本试验旨在建立一种快速、特异且敏感的检测血清中PRRSV抗体的方法。试验根据NCBI数据库录入的Nsp7蛋白序列(GenBank:EF536003)设计引物,利用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)扩增Nsp7基因,构建原核表达载体pET28a-Nsp7,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,并诱导重组蛋白表达。利用亲和层析纯化重组蛋白,Western Blot鉴定表达产物。将纯化后的重组蛋白按不同浓度包被酶标板,通过方阵滴定法确定最佳抗原包被浓度及血清稀释度,并对其条件进行优化,最终建立检测PRRSV Nsp7抗体的间接酶联免疫吸附测定(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)方法。结果表明,试验表达了重组Nsp7蛋白,重组的Nsp7蛋白能与PRRSV阳性血清发生特异性反应,建立了一种基于重组Nsp7蛋白的间接ELISA检测方法。建立的间接ELISA检测方法分别与商品化PRRSV抗体检测试剂盒检测结果相比,两者符合率为87.74%。试验表明,建立的间接ELISA方法可以用于PRRSV抗体的检测。     

在石蜡包埋组织切片中对产生抗轮状病毒抗体细胞的检测

轮状病毒是幼小动物和婴儿腹泻的普通病因。对轮状病毒免疫的研究主要是被动获得免疫球蛋白的作用。在检查这种反应中检测对轮状病毒产生抗体的细胞的方法,将是有用的。一些研究者已用免疫萤光夹心技术,用可溶性抗原或细菌Sonicates作为中间层来检测某特异抗原产