鸭甲型肝炎病毒1型3D基因克隆与表达

提取鸭甲型肝炎病毒1型（DHAV-1）RNA作为模板,进行RT-PCR扩增,得到714bp的3D基因,将纯化的3D基因片段与pMD18-T载体进行连接,构建DHAV-13D基因克隆重组质粒。然后定向插入到pET-32a（＋）表达载体,筛选获得原核表达载体pET-32a-3D。经ITPG诱导,SDS-PAGE分析表明,3D基因得到正确表达,融合蛋白分子量为71.4kDa。Western blotting结果表明纯化的融合蛋白与DHAV-1阳性血清具有反应性。     

绵羊Myostatin基因真核表达载体的构建及在其原代成纤维细胞中的瞬时表达

Myostatin(MSTN)基因是胚胎期肌肉形成和出生后骨骼肌生长的主要调控因子之一,通过抑制肌细胞的扩增和分化而调控肌肉的生长和发育。为了进一步揭示MSTN在绵羊成纤维细胞中的生物学功能,采用RT-PCR从绵羊肌肉组织中扩增MSTN基因,将其cDNA终止密码子TGA删除,采用定向克隆技术连接到带有水母绿色荧光蛋白(AcGFP)报告基因的真核表达载体pAcGFP-N1中,构建融合蛋白重组质粒,经XhoⅠ/SacⅡ双酶切、测序鉴定后,用脂质体介导质粒转染绵羊原代成纤维细胞,观测荧光表达及用RT-PCR和Western blotting方法检测基因转录、蛋白质表达情况。结果表明,成功克隆绵羊MSTN基因,通过PCR方法在MSTN阅读框两端引入了XhoⅠ和SacⅡ克隆位点,成功构建pAcGFP-MSTN融合蛋白真核表达载体,重组质粒转染绵羊成纤维细胞24 h后在荧光显微镜下观察到绿色荧光,通过RT-PCR扩增出1138 bp的转录产物,并用Western blotting检测到78 ku目的蛋白的表达。本试验为研究MSTN基因在成纤维细胞和脂肪分化调控中的具体机制奠定基础。     

大肠杆菌鞭毛蛋白不同结构域与F4菌毛主要结构亚单位FaeG嵌合基因的构建及其表达蛋白的功能研究

为探究大肠杆菌鞭毛蛋白不同结构域与其免疫佐剂活性的相关性,本研究通过重叠延伸PCR技术(SOE-PCR)分别构建了出血性大肠杆菌EDL933(O157:H7)鞭毛蛋白FliCH7基因的全长(aa1～aa585)、N端保守区(aa1～aa174)、N端加中间的高变区(aa1～aa496)与产肠毒素大肠杆菌F4ac~+国内标准株C83902(O8:K88:H19)主要亚单位FaeG串联表达的嵌合基因,即FliC-FaeG、FliCN-FaeG和FliCNV-FaeG,分别将其克隆至pET-28a(+)表达载体中经IPTG诱导表达;经SDS-PAGE和western blot分别对表达的融合蛋白进行鉴定。PCR结果显示3个嵌合基因分别约为2 600 bp、1 300 bp和2 300 bp;SDS-PAGE结果显示融合蛋白的大小分别约为:90 ku、48 ku和80 ku,均与预期大小一致。Western blot结果表明3种融合蛋白均能被抗FaeG的单克隆抗体识别;表明融合蛋白中FaeG仍维持其独立的结构和生物学活性。抗FliCH7的抗体可识别FliC-FaeG和FliCNV-FaeG融合蛋白,而FliCN-FaeG融合蛋白不含鞭毛蛋白高变区,所以不能被识别;TLR5受体活性检测结果表明,仅FliC-FaeG融合蛋白能激活TLR5受体,引起IL-8、TNF-α炎性因子的分泌,以上结果表明TLR5受体活性的激活需要完整的鞭毛蛋白结构,本研究以FaeG为模型抗原,构建了大肠杆菌鞭毛蛋白不同结构域与其相结合的融合蛋白,为进一步研究大肠杆菌鞭毛蛋白不同结构域免疫佐剂活性的差异性和深入研究鞭毛蛋白发挥其免疫佐剂活性的机理提供了参考依据。     

单增李斯特菌lmo0331基因的克隆、序列分析及原核表达

试验旨在对单增李斯特菌临床分离株（LM90SB2）的LPXTG基序表面蛋白lmo0331基因进行克隆、序列分析和原核表达。根据GenBank中lmo0331基因序列设计特异性引物,利用PCR方法扩增LM90SB2 lmo0331基因,将扩增产物克隆到pMD19-T载体,测序后进行核苷酸序列和蛋白结构域分析;构建表达质粒pET32a-0331,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导后,利用SDS-PAGE和Western blotting检测重组蛋白。结果显示,LM90SB2 lmo0331基因核苷酸序列与NTSN株、F2365株、LL195株及WSLC 1033株的同源性均为100.0%,与N2306株、02-1792株、H34株的同源性均为99.9%。LM90SB2 lmo0331基因全长1 956 bp,ORF全长为1 857 bp,共编码618个氨基酸;蛋白结构域预测结果显示,lmo0331蛋白具有NEL、LRR、IR、PulA、LPXTG结构域。SDS-PAGE结果可见约88 ku重组蛋白带,Western blotting表明该蛋白可与小鼠抗His标签单克隆抗体发生特异性结合。本研究成功构建了原核表达载体pET32a-0331,实现了lmo0331融合蛋白的表达,为进一步研究lmo0331基因的功能及单克隆抗体的制备奠定了基础。     

鸭疫里默氏菌OmpA与鸭IL-2融合基因的克隆与原核表达

以鸭疫里默氏菌吉林分离株JL-RA1OmpA基因(登录号HQ707077)和鸭DuIL-2成熟片段基因(登录号AY193713)为模板,分别设计带有linker的特异性引物,PCR扩增出序列大小为1182bp的OmpA-linker基因和序列大小为381bp的linkerDuIL-2成熟蛋白基因。利用SOE-PCR技术,成功构建OmpA-DuIL-2融合基因,片段大小为1551bp。将其转入大肠杆菌表达载体pET-28a中,构建pET-OmpA-DuIL-2融合表达载体,转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)中,IPTG诱导表达,经SDS-PAGE分析得到分子量大小约为61 kDa的融合蛋白,经Western-blot分析该融合基因同时具OmpA和DuIL-2的反应原性。     

单增李斯特菌lmo0331基因的克隆、序列分析及原核表达

试验旨在对单增李斯特菌临床分离株(LM90SB2)的LPXTG基序表面蛋白lmo0331基因进行克隆、序列分析和原核表达。根据GenBank中lmo0331基因序列设计特异性引物,利用PCR方法扩增LM90SB2 lmo0331基因,将扩增产物克隆到pMD19-T载体,测序后进行核苷酸序列和蛋白结构域分析;构建表达质粒pET32a-0331,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后,利用SDS-PAGE和Western blotting检测重组蛋白。结果显示,LM90SB2 lmo0331基因核苷酸序列与NTSN株、F2365株、LL195株及WSLC 1033株的同源性均为100.0%,与N2306株、02-1792株、H34株的同源性均为99.9%。LM90SB2 lmo0331基因全长1 956bp,ORF全长为1 857bp,共编码618个氨基酸;蛋白结构域预测结果显示,lmo0331蛋白具有NEL、LRR、IR、PulA、LPXTG结构域。SDS-PAGE结果可见约88ku重组蛋白带,Western blotting表明该蛋白可与小鼠抗His标签单克隆抗体发生特异性结合。本研究成功构建了原核表达载体pET32a-0331,实现了lmo0331融合蛋白的表达,为进一步研究lmo0331基因的功能及单克隆抗体的制备奠定了基础。     

牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛辅助蛋白AP1、AP2主要抗原域串联表达及其免疫活性鉴定

利用DNAStar Protean功能筛选AP1和AP2主要抗原结构域,引入15位柔性多肽,通过重叠延伸PCR技术串联融合AP1、AP2主要抗原域基因,PCR扩增串联体基因片段,将其克隆至pET-30a(+)载体,转化BL21(DM3)细胞,进行高效表达,目的蛋白经亲和层析纯化后进行Western blot鉴定。PCR扩增出320bp的AP1和759bp的AP2主要抗原域,经重叠延伸PCR获得了1 065bp的AP1、AP2串联体基因片段,DNA测序结果表明,无碱基的缺失、突变和移码。构建的重组表达载体经诱导能够可溶性表达,目的蛋白相对分子质量大小约46 000,纯化后重组蛋白的纯度96%,Western blot分析重组融合蛋白结果表明,能够被兔源抗无乳链球菌阳性血清所识别。重叠延伸PCR获得了AP1、AP2主要抗原域串联体,构建了pET-30a(+)/AP1+AP2重组表达载体,诱导目的蛋白呈可溶性表达,表达产物具有良好的免疫反应原性,为进一步研究基于AP1、AP2蛋白的致病机制,检测制剂及疫苗奠定了试验基础。     

大骨鸡胚胎肌生成抑制素基因(MSTN)cDNA的克隆、测序及原核表达

提取大骨鸡胚胎腿肌RNA,对肌生成抑制素基因(MSTN)RT-PCR扩增、TA克隆和测序.结果表明,大骨鸡胚胎腿肌中存在2种不同大小的MSTN cDNA,一种MSTN cDNA由1 128 bp组成,我们将该序列称为chM-STN-1,与已报道的鸡MSTN cDNA(gi:38349516)序列同源性为100%;另外一种MSTN cDNA由985 bp组成,与chMSTN-1相比.缺失了374～517处的143个碱基,并且在51,234,324 bp处也发生碱基变化,这可能是一种新的MSTN cDNA,我们将该序列命名为chMSTN-2.另外,分别对上述2种MSTN cDNA进行双酶切、亚克隆,成功构建重组表达载体pGEX-KG-chMSTN-1与pGEX-KG-chMSTN-2,转染大肠杆菌并诱导表达.检测结果表明,chM-STN-1和chMSTN-2均能在大肠杆菌中表达,重组蛋白以包涵体形式存在,大小分别约为66 000和55 000.     

猪EP1基因的克隆与原核表达

为进一步体外研究EP1基因的生物学功能,本试验对EP1基因进行了组织分布分析。以猪骨髓cDNA为模板克隆了猪EP1基因的开放阅读框,对克隆的基因序列进行了序列分析,用非酶连接技术将此基因克隆至丙酸诱导型原核表达载体pBbB3a-His6-MBP-LIC中。用菌液PCR进行阳性克隆鉴定并测序,将测序鉴定正确的克隆菌液提取质粒,转化至E.coli BL21(DE3)中。丙酸钠诱导表达His6-MBP-EP1融合蛋白,并用Western blot进行鉴定。结果显示:本试验成功克隆了猪EP1基因,长度为651bp,猪EP1基因在骨髓中的表达量很高;构建了EP1丙酸诱导型原核表达载体pBbB3a-His6-MBP-EP1;His6-MBP-EP1融合蛋白在裂解菌液的上清中表达,相对分子质量为65560。结果表明,运用大肠杆菌表达系统成功表达EP1基因融合蛋白,为进一步在体外开展猪EP1基因生物学功能的研究提供基础。     

阿拉善双峰驼MSTN基因序列生物信息学分析

为了研究阿拉善双峰驼肌肉生长抑制素(MSTN)基因,进一步探讨阿拉善双峰驼MSTN基因的结构及功能,试验采用5对引物对阿拉善双峰驼MSTN基因进行PCR扩增,所得产物进行序列拼接,利用生物信息学方法对阿拉善双峰驼MSTN基因的结构、理化性质及其编码蛋白信号肽、跨膜位置、亚细胞定位等进行分析,并讨论了阿拉善双峰驼与其他物种MSTN氨基酸序列的进化关系。结果表明:阿拉善双峰驼MSTN基因长7.3 kb,1~581 bp为第一外显子区,2 384~2 757 bp为第二外显子区,4 800~6 737 bp为第三外显子区。阿拉善双峰驼MSTN蛋白属于疏水性不稳定蛋白,18~19位氨基酸是最有可能的剪切位点,作为信号肽的可能性很大;二级结构中α-螺旋占22.40%,延伸链占26.67%,β-转角占7.73%,无规则卷曲占43.20%;阿拉善双峰驼MSTN蛋白有1个跨膜结构区域,其功能域可能位于278~375位氨基酸处。阿拉善双峰驼MSTN基因与哺乳类及灵长类动物的亲缘关系较近,与猪的亲缘关系最近(相似性高达99.2%)。说明阿拉善双峰驼MSTN基因编码的蛋白符合一般TGF-β超家族的结构特征,并符合已知MSTN蛋白的结构特征,与猪、灵长类及反刍类动物的分子进化距离较近。     

拟南芥高亲和性K+载体蛋白基因cDNA克隆及其序列特征分析

以NaCl胁迫处理的拟南芥幼苗叶片为材料,用RNA提取试剂盒抽提总RNA,通过RT-PCR技术和DNA序列测定分析,证实获得了拟南芥高亲和性K⁺载体蛋白基因(AtHKT1)的cDNA序列。该cDNA全长1521 bp,包括506个氨基酸和1个终止密码子序列,且与原序列(accession number AF237672)同源性为99.34%,但与其他科植物HKT1基因同源性较低,注册该基因到GenBank中,注册号为AY685182。利用生物信息学相关软件分析预测AtHKT1基因蛋白质功能和结构,结果发现,该蛋白分子量为57.45 kD,理论等电点为9.33;氨基酸序列中第1～40个氨基酸属信号肽序列;第152～500个氨基酸属Trk H阳离子转运体蛋白保守结构域,并存在蛋白激酶C,酪氨酸蛋白激酶,依赖cAMP/cGMP蛋白激酶磷酸化,糖基化和豆蔻酰化等功能位点;该基因编码的蛋白有10个跨膜结构,N末端、C末端及中部等多个跨膜区具疏水性,符合载体类运输蛋白特点。表明本研究获得了拟南芥AtHKT1基因。     

OE-PCR法扩增获得犬瘟热病毒缺失疏水区的融合蛋白基因片段

根据犬瘟热病毒（CDV）Onderstepoort株的核苷酸序列，设计合成引物，通过RT-PCR．从CDV Onderstepoort株RNA中扩增出2197bp的CDV全长融合蛋白（F）基因。将其与pGEM-T easy载体连接．通过软件分析其序列中的疏水区后，以pGEM-T／F为模板．PCR扩增出约254bp和1017bp的F蛋白疏水区外编码序列。以2个扩增产物为模板，以OE-PCR（overlap extension-PCR）扩增出约1271bp的缺失疏水区的F基因（dF）．测序结果表明．dF的序列除在疏水区以4个甘氨酸序列替代外，其余部分与F基因的同源性为99.2％。这表明，OE-PCR扩增法已成功地使CDVF基因疏水区缺失。     

Design and Activity Identification of Hybrid Peptide Based on Cecropin A and Mastoparan

In order to further improve mastoparan's antibacterial and antitumor activities and reduce its cytotoxicity,the molecular modification was carried out by molecular hybridization,and the biological activity of the designed peptide was identified.A novel hybrid peptide KL-21 was obtained by using the N-terminal 1-8 sequences fragment of cecropin A and the conserved sequence of mastoparan.The physicochemical parameters and structures of KL-21 were analyzed by bioinformatics method.The antibacterial activity of KL-21 was studied with MP-L as reference.In addition,the hemolysis rate of the two peptides and the activity of anti-tumor cell A549 were measured.The results showed that KL-21 could quickly kill bacteria in a shorter time.The minimum inhibitory concentration (MIC) of KL-21 to Gram-positive bacteria (S.aureus) and Gram-negative bacteria (E.coli) was 4-8 μg/mL,and the minimum bactericidal concentration (MBC) was 8-16 μg/mL.The MIC and MBC of KL-21 to fungus (C.albicans) were 32 and 64 μg/mL,respectively.The hemolytic activity of KL-21 was only 20% at 128 μg/mL,which was lower than that of MP-L.KL-21 could inhibit lung cancer cell A549 with inhibition rate in vitro about 86% at 16 μg/mL.These results indicated that KL-21 had higher antibacterial and antitumor activity and lower cytotoxicity than MP-L,which could be used as a leading peptide for further research and development.     

基于天蚕素A和胡蜂毒素的杂合肽设计及活性鉴定

为了进一步改善胡蜂毒素（mastoparan,MP）的抗菌、抗肿瘤活性并减少细胞毒性,本研究通过分子杂合方法对其进行改造,并初步鉴定设计的杂合多肽的生物活性。以天蚕素A的N-端1-8序列片段和胡蜂毒素的保守序列为模板进行杂合设计,获得一条新型杂合肽KL-21。以胡蜂毒素MP-L作为参照,采用生物信息学方法、微量倍比稀释法、杀菌动力学方法、溶血试验、CCK-8法分别对KL-21和MP-L进行理化参数分析、结构预测、最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）测定、杀菌动力学研究、溶血活性测定及肿瘤细胞毒性试验。结果表明,KL-21可以在短时间内迅速杀灭细菌,对革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌）和阴性菌（大肠杆菌）的MIC均为4~8 μg/mL,MBC均为8~16 μg/mL;KL-21对真菌（白色念珠菌）的最小MIC为32 μg/mL,MBC为64 μg/mL。兔红细胞溶血试验表明,KL-21在128 μg/mL时溶血活性仅为20%,较MP-L的溶血活性明显降低。细胞毒性试验表明,KL-21对肺癌细胞A549具有良好的抑制作用,16 μg/mL的体外抑制率达86%。研究表明,新型杂合肽KL-21较MP-L的抗菌和抗肿瘤活性有较大提高,细胞毒性显著降低,可以作为先导肽进一步研究和开发。     

鸭RIG-1基因的PCR扩增及其序列分析

维甲酸诱导基因1(RIG-1)是细胞质中侦测病原相关分子模式的识别受体。论文旨在扩增北京鸭RIG-1编码基因,并对其进行序列分析。通过PCR方法,从北京鸭脾脏中扩增得到RIG-1基因cDNA,并使用LaserGene分子生物学分析软件进行序列分析。结果发现北京鸭的RIG-1基因cDNA开放阅读框全长2 802bp,编码933个氨基酸。结构预测发现鸭RIG-1结构与哺乳动物类似,N端有两个串联CARD区,中间为DExD/H解旋酶区,C端为抑制区,各功能区起重要作用的氨基酸较为保守。同源性及进化树分析发现鸭RIG-1与鹅和斑马鱼的同源性最高分别为93.7%、78.4%,与哺乳动物同源性高于50%,与其他鱼类的同源性低于50%。成功扩增出北京鸭RIG-1基因cDNA编码序列,为鸭RIG-1的深入研究奠定了基础。     

禽流感病毒M2蛋白跨膜区基因的缺失

根据禽流感病毒 (AIV ) A/ Chicken/ Korea/ MS96 / 96 (H9N2 )株的核苷酸序列 ,设计并合成引物 ,通过 RT- PCR,从AIV H9N1株感染的 MDCK细胞总 RNA中扩增出 2 94 bp的 AIV全长的 M2基因。通过软件分析其序列中的跨膜区后 ,将其与p GEM- T easy载体连接产物 p GEM- T/ M2为模板 ,通过 PCR扩增出约 90 bp左右 M2的膜外区编码序列和约 16 0 bp左右 M2的胞内区编码序列。将两个扩增产物同时作为模板 ,以 OE- PCR(overlap extension- PCR)扩增出约 2 5 0 bp的缺失跨膜区的 M2基因M2 d。测序结果表明 ,M2 d的序列除在跨膜区以 4个甘氨酸序列替代外 ,其余部分与 M2完全一致 ,由此说明 OE- PCR扩增法成功地将禽流感病毒 M2基因跨膜区缺失     

鸭DCN基因编码区扩增、序列分析及其在大肠杆菌中的表达、蛋白纯化

采用RT-PCR方法从鸭腿肌总RNA中扩增了鸭核心蛋白聚糖基因编码区序列,进行序列分析,并将编码鸭核心蛋白聚糖成熟蛋白的核酸片段连入原核表达载体pET-32a(+)中,加入IPTG诱导其表达后,亲和层析纯化表达的蛋白。采用SDS-PAGE检测,用质谱方法对表达的蛋白进行鉴定。研究成功克隆出鸭核心蛋白聚糖基因编码区序列,序列分析表明,鸭DCN编码区序列由1074个碱基组成,编码357个氨基酸,其中信号肽有16个氨基酸。将鸭DCN蛋白划分为9个结构域(LRR1-9),结合人DCN序列进行序列分析推测结构域中LRR4、5与TGF-β可能存在一定关系。SDS-PAGE检测和质谱鉴定结果表明获得了分子量为54.7ku的鸭DCN融合蛋白。     

水貂PRLR基因的克隆及生物信息学分析

本研究旨在从水貂卵巢组织中克隆催乳素受体(prolactin receptor,PRLR)基因编码区全长序列,并进行生物学信息分析,为研究其结构和功能奠定基础。根据GenBank中登录的犬PRLR基因的mRNA预测序列(登录号:XM_025436332.1)设计1对引物,采集性成熟的健康水貂卵巢组织样本,提取RNA并反转录合成cDNA,以cDNA为模板PCR扩增PRLR基因,将其插入pEASY-Blunt Simple Vector中,筛选阳性克隆测序后进行生物信息学分析。结果显示,水貂PRLR基因编码区序列全长为1 878bp,编码了625个氨基酸,水貂PRLR基因核苷酸序列与海獭同源性最高,为97.7%。系统进化树分析也显示其和海獭亲缘关系最近。对水貂卵巢PRLR基因编码蛋白进行生物信息学分析表明,PRLR蛋白含有1个信号肽,1个细胞外区域,1个跨膜区和1个膜内区;水貂PRLR蛋白为单次跨膜蛋白,其N端的D1部分含有2对保守的二硫键(Cys36—Cys46和Cys75—Cys86),D2部分含有保守的WS-基序(WS-E-WS)。水貂PRLR蛋白具有和其他PRLR蛋白相似的膜外和膜内结构。本试验结果为进一步研究和揭示水貂PRLR蛋白的结构及功能奠定了基础。     

13个物种BPI基因编码区生物信息学分析

本研究采用生物信息学的方法比较不同物种BPI基因编码区CDS序列,分析人、小家鼠、褐家鼠、牛、白颊长臂猿、原鸡、家兔、野猪、猕猴、家马、非洲爪蟾、毛猩猩、犬 13个物种BPI基因编码区的遗传多样性,且对BPI氨基酸序列组成、信号肽、疏水性/亲水性、跨膜结构、二级结构及保守结构域进行预测分析。结果表明,在13个物种的29条BPI基因CDS序列中,共检测到532个多态位点,生成了15种单倍型,BPI基因在种群间及种群内均存在较大的遗传变异,BPI基因具有较强的密码子偏爱性。BPI蛋白理论等电点均大于7,呈碱性,N端大都有信号肽,肽链表现为亲水性,基本属于跨膜蛋白和分泌蛋白。BPI蛋白主要二级结构元件为α螺旋、β折叠和无规则卷曲,有2个保守结构域BPI1和BPI2。