不同ELISA试剂盒检测ALV-A的效果比较

为了比较3种ALV p27抗原ELISA试剂盒对外源性ALV检测效果的差异,本研究将1株滴度为4.64×10~4TCID_(50)/mL的ALV-A毒株GD-13分别以10~0、10~(-1)、10~(-2)、10~(-3)进行倍比稀释(每个稀释度病毒接种含量分别为2.32×10~3TCID_(50)、2.32×10~2TCID_(50)、2.32×10~1TCID_(50)、2.32TCID_(50))接种于24孔板的含10%FBS DF-1细胞悬液中,待细胞长满后换为1%FBS维持液,从更换维持液后第3天开始至第9天每天取细胞上清分别同时用3种不同的ELISA试剂盒(A、B、C)进行检测。结果显示,当病毒接种含量为2.32×10~3TCID_(50)时,A、B试剂盒最早可在换液后第3天检出病毒p27抗原阳性,C试剂盒最早在第4天才可以检出病毒阳性,检测阳性率均为100%(5/5)。当病毒接种含量为2.32×10~2TCID_(50)时,使用A试剂盒在接种后第6天能够检出,检测阳性率为80%(4/5);使用B试剂盒最早在接种后第5天可检测出,检测阳性率为20%(1/5);使用C试剂盒直到第9天才能检测出病毒,而且检测阳性率为20%(1/5)。当病毒接种含量为2.32×10~1TCID_(50)和2.32TCID_(50)时,使用A、B和C试剂盒均检测不出病毒。本研究结果表明,对于ALV-A的检测,无论是在检出时间还是检出率上B试剂盒都优于A、C试剂盒,提示不同商品化试剂盒的灵敏度存在一定的差异。本研究可为禽白血病病原学和净化检测提供参考。     

不同猪瘟病毒株在ST细胞上的增殖研究

在做荧光抗体检测病毒中和试验时,用不同毒株检测同一份血清样品经常出现不一样的效果。通过开展猪瘟病毒(兔化弱毒株)和猪瘟病毒(法国Thiveral株)在ST细胞上的增殖研究,掌握猪瘟活疫苗收获抗原的最佳时间,选择更好的毒株进行荧光抗体检测病毒中和试验。结果表明:猪瘟病毒(兔化弱毒株)增值效果差,猪瘟病毒(法国Thiveral株)繁殖速度很快,在接种后30 h就能达到10~(5.4)TCID_(50)/mL,55 h达到最高峰10~(6.0)TCID_(50)/mL,72 h后呈平稳状态。     

膜分离法纯化浓缩的猪细小病毒灭活疫苗效果研究

为了研究纯化浓缩的猪细小病毒灭活疫苗的免疫效果,应用微滤/超滤管式陶瓷膜分离系统对猪细小病毒细胞收获液进行纯化浓缩,使浓缩液病毒平均含量由10~(4.7)TCID_(50)/mL提高到10~(6.5)TCID_(50)/mL;将纯化浓缩的病毒液经检验合格后,进行甲醛灭活,与注射用矿物白油佐剂制成油包水灭活疫苗;按照猪细小病毒灭活疫苗的质量标准,对制备的灭活疫苗进行检验与免疫效果试验。结果显示:纯化浓缩的猪细小病毒液杂蛋白去除率平均达到71.6%左右;制备的三组灭活疫苗检验均合格;免疫至63 d时,免疫猪体内抗猪细小病毒抗体(HI)水平分别为:纯化浓缩的灭活疫苗平均高达9.62 log_2稀释倍数,常规疫苗平均为8.78log_2稀释倍数,差异显著(P0.05)。试验表明:疫苗病毒细胞收获液进行膜纯化技术处理后,免疫效果显著优于未经纯化的常规灭活疫苗。     

泽库县牦牛病毒性腹泻／粘膜病病毒分离报告

从泽库县多禾茂乡“拉稀”病牛的血浆中分得2株致细胞病变的牛病毒性腹泻病毒(BVDV),其第4代、5代培养物对新生犊牛睾丸细胞的TCID_(50)为10~(3.4-3.7)/0.1ml(Oregon C_(24)V的TCID_(50)为10~(4.9)/0.1ml);与猪瘟酶标抗体有染色反应;与BVDV荧光抗体有特异反应,荧光强度“卅”;用标准BVDV阳性血清作中和试验,有明显的中和作用,阴性血清不能中和分离物的细胞病变,其组间毒价对数差为3.6—3.7;经电镜观察,病毒颗粒形态为圆形或近圓形,其大小为50—60nm,与Oregon C_(24)基本一致。     

鸭坦布苏病毒病灭活疫苗生产工艺的研究

本研究对鸭坦布苏病毒灭活疫苗HB株生产工艺进行了筛选,通过不同接毒量和不同收获时间等相关试验,优化了规模化生产工艺,即鸭胚成纤维细胞按体积分数0.5%接种DTMUV HB株毒种,接毒后84h收获病毒液,收获毒液病毒含量达10~(7.1)TCID_(50)/0.1ml。     

貂源伪狂犬病毒DL14/08株免疫原性及其保护效果的研究

为研制貂源伪狂犬病(PR)灭活疫苗,本实验室从疑似患PR的水貂脑组织中分离到一株PR病毒(PRV)DL14/08株(10~(7.10)TCID_(50)/m L),采用甲醛灭活以铝胶为佐剂制备了水貂源PR灭活疫苗。采用水貂和家兔对疫苗进行安全性检验和最小免疫剂量测定,结果显示水貂和家兔的最小免疫剂量均为5×10~(5.6)TCID_(50)/m L;采用研制的PR灭活疫苗和商品化猪用PR灭活疫苗免疫水貂,免疫21 d后平均中和抗体分别为1∶516和1∶348,用相当于100倍半数致死量毒力的分离株病毒攻毒,自制灭活疫苗组保护率为100%,商品化疫苗组保护率为80%。实验结果表明,制备的水貂源PR灭活疫苗抗体水平及攻毒后保护率明显高于商品化疫苗,能够有效保护强毒株对水貂的攻击,可以作为水貂伪PRV预防和控制的候选疫苗株。     

伪狂犬病病毒云南变异毒株的分离鉴定及gE、gD、gC、TK基因序列分析

2013-2016年期间,从云南陆良、富源、寻甸及西双版纳规模猪场经Bartha-K61疫苗免疫猪群中发生流产的胎儿内脏组织病料中成功分离获得4株伪狂犬病病毒流行毒株,分别命名为FY-YN-2014、LL-YN-2014、XSBN-YN-2015和XD-YN-2014株。经TCID_(50)测定、动物致病性试验、免疫保护试验及gE、gD、gC、TK基因序列分析,结果显示TCID_(50)分别为10~(-6.083)/100μL、10~(-5.75)/100μL、10~(-6.583)/100μL、10~(-6.5)/100μL。采用Bartha-K61疫苗免疫过的经产母猪血清样品对XSBN-YN-2015分离毒株进行微量病毒中和试验,其结果显示gB抗体阳性、gE抗体阴性的血清样品的中和效价在1∶16～1∶32之间,用gB、gE抗体均为阳性的血清样品时,其中和效价在1∶64～1∶128之间。4株分离毒株接种昆明小白鼠、家兔2～5 d后,均出现奇痒的典型伪狂犬病临床症状。对健康非免疫断奶仔猪进行攻毒,同样出现伪狂犬病的典型发病症状,且能从脑及内脏组织中扩增出伪狂犬病病毒gE基因并成功回收分离到病毒株。在昆明小白鼠上的LD_(50)分别是10~(2.625) TCID_(50)、10~(2.875) TCID_(50)、10~(2.625) TCID_(50)、10~(2.5) TCID_(50)。XSBN-YN-2015株在非免疫断奶仔猪(伪狂犬病病毒gE、gB抗体阴性)测得的LD_(50)=10~(5.33) TCID_(50)。XSBN分离毒株对免疫2次Bartha-K61疫苗的断奶仔猪的攻击试验结果显示,被攻击仔猪均出现高热、精神萎顿、厌食等临床表现,但1周后均能耐过并逐渐康复,提示Bartha-K61疫苗株免疫猪只对当前流行的伪狂犬病病毒云南变异毒株的攻击基本能够提供100%保护。4株伪狂犬病病毒云南流行毒株与近年来国内报道的TJ、HeN1、NH1201等变异毒株的gE、gC、gD及TK基因核苷酸及氨基酸序列均高度一致,同源性高达99%～100%,均分属于同一进化树分支,不过与早期的国内毒株SC、GDSH株,国外毒株Becker、Nia-1、CL15、Kaplan、Kolchis、Hercules、NIA3及疫苗株Bartha相比,均存在一定程度的变异,也未分属于同一进化分支,因此,4株伪狂犬病病毒云南流行毒株也属于变异毒株。     

蚀斑法分离纯化BHV-1和BPIV-3混合病毒

利用蚀斑试验方法对牛疱疹病毒1型(BHV-1)和牛副流感病毒3型(BPIV-3)的混合病毒进行分离纯化及鉴定,为BHV-1、BPIV-3感染的诊断提供科学依据。将不同稀释度的BHV-1和BPIV-3混合病毒接种至牛肾原代细胞,加营养琼脂培养,产生蚀斑后扩增并RT-PCR鉴定。将纯化后毒液分别进行二次蚀斑纯化及鉴定。结果 BHV-1和BPIV-3混合病毒第6~7 d可产生明显蚀斑。鉴定阳性的BHV-1和BPIV-3进行二次蚀斑,鉴定结果均为阳性,且分离的两种病毒TCID_(50)测定结果为10~(-8.5)/0.1 m L、10~(-6.5)/0.1 m L。首次通过蚀斑试验,成功分离并得到了两株毒力较高且纯化的BHV-1和BPIV-3病毒株。     

EHV-1-XJ2015株在不同细胞系中增殖规律研究

为了研究马疱疹病毒1型(Equine herpesvirus 1,EHV-1)在不同细胞系中的增殖规律,试验将该病毒分别接种至Vero细胞、BHK-21细胞和MDBK细胞中进行连续传代培养,观察细胞病变(CPE)情况;对第3代收获的病毒gE基因进行PCR检测及同源性比对;按照Reed-Meunch方法分别测量3种细胞7个时间点的TCID_(50),并绘制一步生长曲线。结果表明:EHV-1对3种细胞有很好的亲嗜性,产生明显CPE;3种细胞都扩增出大小为438 bp的片段,与所选的参考株同源性在99.99%以上;EHV-1在感染3种细胞后0～12 h进入静止期,12～48 h进入快速增长期;感染BHK-21细胞后在36小时时达到最高病毒毒价,TCID_(50)为1×10~(-8.40)/0.1 mL,感染MDBK细胞及Vero细胞后在48小时时达到最高病毒毒价,TCID_(50)分别为1×10~(-7.35)/0.1 mL和1×10~(-5.80)/0.1 mL。说明BHK-21细胞适合作为EHV-1-XJ2015株体外研究的细胞系。     

ELISA检测猪瘟疫苗病毒含量方法的建立

用IDEXX猪瘟抗原ELISA试剂盒检测猪瘟病毒液,建立了猪瘟病毒的滴度与OD值之间线性回归关系的标准曲线,其中R~20.99,其检测范围在10~(5.023)TCID_(50)/mL~10~(6.319)TCID_(50)/mL之间。经验证,该方法检测的CV10%,回收率在98%~101%之间,表明该方法重复性好,准确度和精密度高,能够稳定、快速、简单地用于测定猪瘟疫苗中的病毒含量,为疫苗产品的质量控制和养殖场猪瘟疫苗的筛选提供了一种参考方法。     

一株H9N2亚型禽流感病毒鸡胚培养工艺研究

为了探讨H9N2亚型禽流感病毒在鸡胚上最佳培养工艺,试验采用H9N2亚型禽流感病毒分离株以不同稀释倍数接种不同鸡胚(SPF及普通鸡胚)、不同日龄鸡胚及不同培养时间收获鸡胚尿囊液,比较不同培养条件下制备出的鸡胚尿囊液的产量及病毒效价。结果表明:H9N2亚型禽流感病毒接种无禽流感病毒(H9亚型)HI母源抗体鸡胚的最佳病毒稀释倍数为1×10~(4 )～1×10~5倍,接种带有禽流感病毒(H9亚型)HI母源抗体鸡胚的最佳病毒稀释倍数为1×10~3～1×10~4倍,最佳接种日龄为10日龄,最佳培养时间为96～120 h。说明采用优化的鸡胚培养方法生产H9N2亚型禽流感病毒可以得到高质量、高产量的病毒液。     

猪流行性腹泻病毒(PEDV)XJ-DB2株对25日龄仔猪毒力试验

用生理盐水将猪流行性腹泻病毒细胞分离毒株XJ-DB2株稀释成含10~4、10~5和10~6 TCID_(50)(病毒半数细胞感染量)3个剂量组。将16头25日龄健康易感仔猪随机分成4组,每组4头。前3组分别口服1 mL含有10~4、10~5 TCID_(50)和10~6TCID_(50)PEDV XJ-DB2株病毒液作为攻毒组,最后1组作为阴性对照口服同等量的生理盐水。相同条件下隔离饲喂,连续观察7 d,攻毒组全部出现猪流行性腹泻临床症状,对照组则无任何临床症状。第7天全部剖杀,观察肠组织病理变化。剖检结果显示:10~4TCID_(50)剂量组中有3头猪肠组织均有明显病变(肠壁变薄、臌气,肠内充满黄色液体)而另外1头猪肠组织无明显病变;10~5 TCID_(50)和10~6 TCID_(50)两个剂量组8头仔猪肠组织均出现明显病变;阴性对照组4头仔,猪肠组织均无病变。由此判断XJ-DB2株为PEDV强毒株,以10~4 TCID_(50)剂量口服可以致25日龄仔猪发病。     

新城疫、禽流感病毒同胚培养制备二联灭活疫苗工艺研究

基于新城疫病毒(NDV)LaSota株、禽流感病毒(AIV)SS株均可通过鸡胚接种增殖的特点,将2种病毒按一定比例稀释后混合接种鸡胚尿囊腔,一定条件下进行2种病毒的同胚培养。试验通过检测红细胞凝集试验(HA)、半数感染量(EID_(50))以及血清抗体效价检测等对培养产物进行评价。结果表明,2种病毒均可在鸡胚内增殖,最终选用10 000倍稀释的SS株与200倍稀释的LaSota株混合后,以0.1 mL/个接种于10日胚龄鸡胚,37℃培养96 h后收获。经半数致死量检测得LaSota株的EID_(50)为10~(7.5)/0.1 mL,SS株的EID_(50)为10~(7.63)/0.1 mL略低于单独接种的EID_(50)。结果表明,试验使用SS株与LaSota株按10 000:200稀释条件可以实现同胚培养,证明SS株对La Sota株的增殖具有干扰作用,但在一定条件下可以实现同胚培养。本研究为同胚接种制备二联疫苗提供科学依据。     

猪伪狂犬病活疫苗(Bartha-K61株,传代细胞源)最小免疫剂量的研究

为了确定猪伪狂犬病活疫苗(Bartha-K61株,传代细胞源)的最小免疫剂量,本研究将3批猪伪狂犬病活疫苗(Bartha-K61株,传代细胞源)分别稀释成10TCID_(50)/mL、102.0TCID_(50)/mL、103.0TCID_(50)/mL,每批疫苗各个稀释度分别免疫仔猪1.0 mL/头,并设攻毒对照组和阴性对照组。免后10 d连同攻毒对照组用伪狂犬病病毒GD1株进行攻毒保护试验,阴性对照组不攻毒。结果表明,10TCID_(50)/头和102.0TCID_(50)/头的免疫剂量在免疫后10 d依然无法提供完全的免疫保护,保护率为20%～80%(1/5～4/5);103.0TCID_(50)/头的免疫剂量能够保护仔猪抵抗PRV强毒的攻击,保护率为100%(5/5);攻毒对照组发病率为100%(5/5),死亡率为80%(4/5);阴性对照组全部健活。由此确定猪伪狂犬病活疫苗(Bartha-K61株,传代细胞源)最小免疫剂量为103.0TCID_(50)/头。     

猫杯状病毒CH-JL2分离株对猫的致病性研究

为研究猫杯状病毒(FCV)CH-JL2分离株对猫的致病性,本研究采用滴鼻方式分别以10~(8.97)TCID_(50)/mL、10~(7.97)TCID_(50)/mL与10~(6.97)TCID_(50)/mL的病毒液(0.5mL/只)感染6~11周龄健康未免疫中华田园猫,通过对临床症状、体温、排毒情况、组织病理变化以及组织中病毒分布情况的观察与监测,评价其致病性。结果显示,不同滴度的FCV CH-JL2分离株感染猫均可发病,发病率依次为100%、50%与25%,FCV感染5d后,感染猫开始排毒,出现体温升高、鼻眼分泌物增多、口腔溃疡等典型临床症状,但在感染猫的肺脏、心脏、脾脏、气管等全身组织脏器中均未检测到FCV的分布。结果表明CH-JL2分离株不同于FCV VSD株,感染猫后仅可引起上呼吸道感染,不能造成全身感染。本研究为FCV的防制奠定了基础。     

猪伪狂犬病毒gB抗原侧向层析快速检测试纸条的研制

为建立一种简便、快速、特异的猪伪狂犬病毒(PRV)gB抗原检测方法,利用单克隆抗体技术和侧向层析(LFA)技术,采用柠檬酸三钠还原法,制备颗粒大小为31.5 nm胶体金,再用胶体金标记纯化的抗PRV gB单克隆抗体10D4,在硝酸纤维素膜的质控带和检测带处,分别包被羊抗鼠IgG二抗和单克隆抗体6E9,组装成LFA方法通用胶体金层析试纸条。经测试,该试纸条最低能检测出1:640倍稀释的,TCID_(50)为1×10~(8.6)/0.1 mL的灭活PRV抗原,并与古典猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)均无交叉反应,特异性良好;室温干燥密闭的条件下,该试纸条至少可保存10个月。结果表明,本研究建立的试纸条方法操作简单、快速、敏感、特异,易于判定,适合基层PRV的大面积普查和现场检测。     

血清中和试验中一个值得注意的问题

在进出境动物检疫中,血清中和试验(SN)是常用方法之一。许多检疫条款都规定用血清中和试验检测血清中病原抗体来判断动物是否可以进出境。大家都知道SN试验必须有对照板,有回归试验。回归试验的目的就是要检查实验所用工作毒是否合适。如果1TCID_(50)孔中半数出现CPE,而10TCID_(50)全部出现CPE,0.1TCID_(50)均无病变,则     

鸡新城疫病毒LaSota株在BHK-21细胞上增殖条件的优化

本研究旨在对鸡新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)LaSota株在BHK-21细胞上的增殖条件进行优化,为实现应用细胞系生产NDV提供参考。在确定BHK-21细胞TPCK-胰酶耐受浓度的基础上,在培养基中添加不同浓度的TPCK-胰酶、新生牛血清及调节不同pH,通过对细胞培养液细胞半数感染量(TCID_(50))的测定,确定最适胰酶浓度、血清浓度及pH;通过固定接毒量而添加不同数量细胞或固定细胞数量而接种不同量的病毒,确定最适细胞量及接毒量;将BHK-21细胞接种NDV LaSota株后,通过测定不同时间细胞上清液TCID_(50)绘制增殖曲线,确定最佳收毒时间;应用转瓶对该病毒进行扩大培养,并进行TCID_(50)、鸡胚半数感染量(EID_(50))与血清凝集价(HA)的测定。结果显示,NDV LaSota株在BHK-21细胞上增殖的最适TPCK-胰酶浓度为3μg/mL,最适接毒量为10~(6.375) EID_(50),细胞数量为1×10~6个,培养基pH为7.2,且可用无血清培养基进行培养,BHK-21细胞接种NDV LaSota株后最佳收毒时间为34～36 h。应用BHK-21细胞采用转瓶培养的方式对NDV LaSota株进行增殖,结果显示,细胞培养液TCID_(50)值为10~(7.0)/0.1 mL,EID_(50)为10~(7.5)/0.1 mL,HA效价为1∶256。因此,应用以上条件增殖培养NDV LaSota株,完全适用于该病毒的规模化生产,且符合现行的兽医生物制品与检验制造规程。     

猪伪狂犬病病毒变异株(Fujian-LY)人工感染小鼠动物模型的建立

为建立猪伪狂犬病病毒(PRV)变异株人工感染小鼠动物模型,将本实验室分离鉴定的猪PRV变异株(Fujian-LY)进行连续10倍稀释后,对6周龄SPF级BALB/c小鼠进行腹股沟皮下接种攻毒,每个稀释度接种5只小鼠,测定其LD_(50),观测小鼠感染、致病的多项指标,试验期为7 d。结果显示,该毒株对小鼠的LD_(50)为3.7×10~3 TCID_(50)/0.1 mL,在不同的感染剂量下各攻毒组小鼠的临床症状、死亡率等各项指标差异明显,其中以2.3×10~5 TCID_(50)的攻毒剂量接种后小鼠未发生急性死亡,且能表现出以神经症状为主的典型伪狂犬病症状;病理剖检可见发病小鼠脑膜充血,肺脏出血,胸腺、脾脏严重萎缩等病理变化;病理组织学检查结果显示该毒株对攻毒小鼠全身多个重要组织器官均造成了严重的病理损伤,同时采用PCR及免疫组化的方法在这些组织内均能检测到PRV抗原。结果表明,本研究已成功建立了PRV变异株感染小鼠动物模型。     

抗低温消毒剂“抗冻消-30”对非洲猪瘟病毒的杀灭效果

为评估抗低温消毒剂"抗冻消-30"对非洲猪瘟病毒(ASFV)的杀灭效果,本研究通过观察不同稀释度的"抗冻消-30"对细胞形态的影响,并计算相应细胞的活性确定该消毒剂对细胞的安全浓度。结果显示,"抗冻消-30"对细胞的安全浓度为≤1 g/L,细胞存活率高于95%,且形态正常。将不同浓度的ASFV报告病毒(rASFV-HLJ/2018-EGFP株)与不同浓度"抗冻消-30"在不同温度下作用30 min后,分别感染HEK293T细胞,通过倒置荧光显微镜观察,评估在不同温度下"抗冻消-30"对ASFV报告病毒的杀灭效果;将不同浓度的ASFV亲本病毒(HLJ/2018株)与不同浓度"抗冻消-30"在-30℃作用30 min后,分别感染猪肺泡巨噬细胞(PAMs),一定时间后加入猪红细胞,利用倒置显微镜观察红细胞吸附现象,评估-30℃条件下,"抗冻消-30"对ASFV亲本病毒的杀灭效果。结果显示,常温和4℃时,400 g/L、160 g/L、80 g/L、40 g/L、8 g/L的"抗冻消-30"可完全杀灭10~6TCID_(50)及以下浓度、10~5TCID_(50)及以下浓度、110~4TCID_(50)及以下浓度、10~4TCID_(50)及以下浓度、10~3TCID_(50)及以下浓度的ASFV报告病毒;-20℃时,上述浓度的"抗冻消-30"可完全杀灭10~5TCID_(50)及以下浓度、110~4TCID_(50)及以下浓度、10~3TCID_(50)及以下浓度、10~3TCID_(50)及以下浓度、10~2TCID_(50) ASFV报告病毒;-30℃和-40℃时,上述浓度的"抗冻消-30"可完全杀灭110~4TCID_(50)及以下浓度、10~3TCID_(50)及以下浓度、10~3TCID_(50)及以下浓度、10~2TCID_(50)及以下浓度、10~2TCID_(50) ASFV报告病毒。-30℃时,400 g/L、160 g/L、80 g/L、40 g/L的"抗冻消-30"可完全杀灭110~4TCID_(50)及以下浓度、10~3TCID_(50)及以下浓度、10~3TCID_(50)及以下浓度、10~2TCID_(50)及以下浓度的ASFV亲本病毒。本研究在细胞水平上系统评价了该消毒剂对ASFV报告病毒和亲本病毒的杀灭情况,表明"抗冻消-30"在常温和低温条件下对ASFV均具有良好的杀灭效果,可以作为防控ASF的有效消毒剂。