茨城病毒VP7蛋白基因的克隆表达及间接ELISA方法的建立

采用RT-PCR方法扩增出了茨城病毒（IBAV）No．2株编码VP7蛋白的S7全长基因，并克隆入原核表达载体pET-28a（＋）中，在E．coli BI.21中表达。经Western-blot检测，表达的重组VP7蛋白具有良好的反应原性。以纯化的重组蛋白作为包被抗原，初步建立了检测IBAV血清抗体的间接ELISA方法。     

蓝舌病病毒重组VP7蛋白单克隆抗体制备及竞争ELISA检测方法的建立

为了建立蓝舌病(BT)的血清学诊断方法,本研究利用原核表达的蓝舌病病毒(BTV)血清型12型VP7纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,制备2株单克隆抗体(MAb),分别命名为BTV-2D10和BTV-4H7。IFA试验表明,2株MAb均能与BTV 24个血清型发生特异性反应,而与茨城病病毒(IBAV)、中山病病毒(CV)、赤羽病病毒(AKAV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛轮状病毒(BRV)、牛肠道病毒(BEV)、牛呼肠孤病毒(RV)及口蹄疫病毒(FMDV)无交叉反应,表明2株MAb均为BTV群特异性抗体。采用重组表达的VP7蛋白作为包被抗原建立的竞争ELISA方法证明,BTV-4H7 MAb对不同血清型BTV阳性血清具有良好的阻断效果,而对AKAV、IBAV、BRV和FMDV阳性血清无阻断作用。本研究建立的竞争ELISA方法与IDEXX公司的试剂盒检测包括65份已知背景血清和322份采自广西省的山羊血清样品,检测结果符合率分别达100%和98%。该竞争ELISA方法的建立为BTV抗体的监测提供了安全、快速、准确的技术手段。     

14型蓝舌病病毒VP7蛋白原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立蓝舌病(bluetongue,BT)的血清学诊断方法,本研究通过得到14型蓝舌病病毒(bluetongue virus,BTV)的s7基因,并在大肠杆菌表达系统中进行表达,原核表达得到VP7蛋白,并对表达的包涵体VP7蛋白进行纯化,Western blot分析表明,纯化的VP7蛋白具有良好的抗原性。以纯化的VP7蛋白作为包被抗原,建立间接ELISA检测方法。该方法与羊痘阳性血清,羊口蹄疫阳性血清和羊的小反刍兽疫阳性血清均无交叉反应,与中和试验比较,两者符合率为90%,ELISA批内和批间重复性试验显示,D值的变异系数小于10%。说明本方法具有良好的特异性和重复性。本研究在国内首次建立了14型BTV抗体间接ELISA方法,可用于BTV感染的流行病学调查以及疫苗接种动物的抗体水平监测,为以后相关BTV ELISA检测试剂盒研发提供技术平台。     

牛轮状病毒重组VP7蛋白抗原间接ELISA诊断方法的建立

以纯化的原核表达的牛轮状病毒VP7蛋白为包被抗原,建立了检测牛轮状病毒抗体的间接ELISA诊断方法。特异性试验表明,该抗原与其他5种常见牛病病毒(IBRV、BCV、BRSV、ETEC、Cj)的阳性血清无交叉反应,板内和板间重复性试验的变异系数均小于10%;对来自不同牛场的血清样本检测结果显示,该检测方法与病毒中和试验检测结果符合率达87.2%。本试验建立的ELISA诊断方法具有良好的重复性、敏感性和特异性,为BRV的快速诊断、免疫牛群血清抗体监测及轮状病毒流行病学调查提供了一种快速、简便的血清学诊断方法。     

PEDV流行株重组截短N蛋白间接ELISA检测方法的建立

为了建立猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)抗体检测的间接ELISA方法,本研究以纯化的原核表达的PEDV截短N蛋白作为包被抗原,建立了PEDV抗体检测的间接ELISA方法,将该方法命名为rnPED-ELISA。该抗原不与其他常见的7种猪病的阳性血清发生交叉反应,批内和批间重复性试验的变异系数均小于13%;rnPED-ELISA相对于血清中和试验(SN)试验的敏感性为93.33%,特异性为90.00%;rnPED-ELISA与TSZ全病毒抗体检测试剂盒的符合率达91.67%。采用rnPED-ELISA方法检测200份临床样品,PEDV抗体阳性检出率为69.5%。本试验建立的rnPED-ELISA方法具有良好的敏感性和特异性,可为免疫猪群抗体监测和猪流行性腹泻流行病学调查提供一种快速、简便的血清学诊断方法。     

传染性法氏囊病病毒VP2结构蛋白抗体ELISA检测方法的建立

为建立敏感、特异、稳定的传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2结构蛋白抗体ELISA检测方法,本试验以杆状病毒表达系统表达的重组IBDV-VP2结构蛋白为抗原,通过包被VP2单克隆抗体捕捉VP2结构蛋白的形式,建立鸡血清VP2结构蛋白抗体ELISA检测方法(VP2-ELISA)。条件优化结果显示:单克隆抗体最适包被质量浓度为3mg/L,VP2最佳稀释度为1∶20,夹心ELISA效价1∶12.8,被捡血清的稀释度为1∶400。该方法与禽流感、鸡新城疫、鸡马立克氏病、鸡传染性喉气管炎病毒及杆状病毒阳性血清无交叉反应,对琼扩效价为1∶32的IBDV阳性血清的最低检出量为1∶12 800,ROC曲线确定的D450nm临界值为0.236,组内、组间重复性试验变异系数均小于10%。用本试验建立的VP2-ELISA方法与进口IBDV-ELISA抗体试剂盒平行检测100份背景已知的临床鸡血清样品,总符合率VP2-ELISA(97%)高于进口ELISA试剂盒(96%)。本试验为进一步研制鸡传染性法氏囊病病毒VP2结构蛋白抗体ELISA检测试剂盒奠定基础。     

牛口蹄疫病毒VP2结构蛋白抗体间接ELISA方法的建立

为建立牛口蹄疫(FMD)抗体的检测方法,本研究将口蹄疫病毒(FMDV)的VP2基因,通过pPROEXTM HTb表达载体在大肠杆菌DH5α中表达,获得大小为35ku的重组VP2蛋白(rVP2),western blot证实rVP2可与FMDV5种血清型的牛阳性血清发生特异性反应。以纯化复性的rVP2为抗原建立了FMDVrVP2间接ELISA方法。重复性试验证实批内、批间变异系数均小于10%。特异性交叉试验表明,该抗原不与常见的其他7种牛病阳性血清发生交叉反应。检测非免疫无口蹄疫国家牛阴性血清的特异性为100%;检测感染血清敏感性为97.3%;检测O-AsiaⅠ的二价苗免疫牛血清,与4种商品化试剂盒比较,其符合率分别为69.0%、95.0%、90.4%和86.8%。实验结果表明建立的ELISA方法可以用于口蹄疫感染和免疫抗体检测。     

猪传染性胃肠炎病毒N蛋白原核表达和间接ELISA检测方法的建立

试验构建了pET28a-TGEV-N重组表达质粒,完成TGEV N蛋白的表达和纯化,通过SDS-PAGE和Western blotting分析,表明表达产物N蛋白可被猪TGEV阳性血清识别。用TGEV N蛋白作为诊断抗原,建立了检测TGEV血清抗体的间接ELISA检测方法,该方法批内、批间重复试验变异系数均小于5%;检测血清的特异性为100%,假阳性率为0,假阴性率为5%,与7种常见猪病血清无交叉反应。针对临床血清,用该方法检测结果与中和试验结果相比,符合率为100%。该方法能够快速、有效地检出TGEV抗体,重复性和特异性好,为标准化诊断试剂盒的开发奠定了基础。     

禽脑脊髓炎病毒Van Roekel株衣壳蛋白基因原核表达及其ELISA检测研究

利用RT PCR方法扩增了禽脑脊髓炎病毒VP0、VP3和VP1基因 ,分别插入pGEX 4T 1原核表达载体 ,转化到E .coliER2 566表达菌内 ,经IPTG诱导表达后 ,SDS PAGE分析表达产物。结果表明 ,表达的VP0、VP3、VP1融合蛋白分子量分别为 53 ,53 ,56ku。以电洗脱法纯化VP0、VP3、VP1表达蛋白抗原并分别建立了间接ELISA方法 ,用阳性血清和阴性血清进行检测。结果显示 ,表达VP1蛋白反应活性相对高于VP0、VP3蛋白反应活性 ,最后再将自制VP1板用自配试剂检测其活性 ,同时用美国试剂盒检测VP1活性 ,美国ELISA试剂盒、琼脂扩散试验检测同样 1 0份血清作比较 ,三组ELISA检测结果 ,其中有 8份被检血清为阳性 ;2份被检血清为阴性。这一结果与琼脂扩散试验检测结果一致。说明VP1表达蛋白活性达到预期要求 ,可以用做AE的ELISA诊断     

基于截短MOMP蛋白的绵羊流产衣原体抗体间接ELISA方法的建立

为了建立检测绵羊流产衣原体MOMP(main outer membrane protein)蛋白抗体的间接ELISA方法,试验将编码MOMP蛋白的基因序列经密码子优化后进行基因合成,并克隆和原核表达截短蛋白,以该蛋白为抗原建立绵羊流产衣原体抗体的间接ELISA方法,优化该方法的反应条件,同时验证其特异性、敏感性和重复性,最后用该方法对临床待检羊血清进行检测,并与间接血凝试验试剂盒的检测结果进行比较。结果表明：截短蛋白MOMP_201～390的表达、纯化效果最好。经探索,优化后的间接ELISA方法最优反应条件：抗原包被浓度为1 mg/L,37℃包被2 h,待检血清最佳稀释度为1∶100,血清和酶标二抗的最佳作用时间分别为45 min、60 min。建立的间接ELISA方法的敏感性较高,特异性和重复性较好,使用该方法从209份临床待检羊血清样本中检出47份阳性血清,与间接血凝试验试剂盒分别检测临床待检羊血清样本86份,总符合率为80.23%。说明基于截短蛋白MOMP_201～390建立的绵羊流产衣原体抗体间接ELISA方法可用于绵羊流产衣原体临床血清...