家蚕正反交组合F1代的基因表达系列分析(SAGE)文库构建

家蚕杂交组合存在普遍的正反交遗传表型差异现象,为探讨引起正反交组合遗传差异的分子机制,构建家蚕品种75新×7532正交F1代雌雄个体和7532×75新反交F1代雌雄个体共4个基因表达系列分析(SAGE)文库。通过正反交组合同性别子代样本间的比较,显示低表达的标签在种类上占大多数,而高表达的标签在数量上占绝对优势。以错误检测率(FDR)≤0.001且拷贝数倍数差异在2倍以上作为比较样本筛选差异表达基因(DEGs)的条件,在7532×75新的雄性样本里面有298个上调基因和46个下调基因,而在雌性样本里有453个上调基因和240个下调基因。进一步对差异表达基因进行GO和KEGG路径功能分析,筛选出在显著性富集路径中的差异表达基因,其中参与新陈代谢途径、氧化磷酸化途径以及信号传导途径的差异基因在反交组合的子代中表达明显上调。     

桑叶育和人工饲料育家蚕蛹期转录组的差异分析

用人工饲料饲养的家蚕存在生长发育状况差、产丝量低、造卵数少、活力弱等问题.为解析造成这些问题的分子机制,采用高通量测序的方法,比较桑叶育和人工饲料育家蚕化蛹第3天雌雄蛹的转录组差异.结果显示,与人工饲料育家蚕相比,桑叶育家蚕雌蛹中共鉴定出61个差异表达基因,其中45个基因上调表达,16个基因下调表达;雄蛹中共鉴定出227个差异表达基因,其中134个基因上调表达,93个基因下调表达.结合GO分析和KEGG通路分析,发现雌蛹中差异表达基因显著富集在细胞色素P450对外源物质代谢的通路,而雄蛹中差异表达基因主要富集在糖胺聚糖降解、糖酵解和糖异生等途径.人工饲料喂养组中雌蛹的谷胱甘肽-S-转移酶基因表达显著下调,可能影响雌蚕体内激素的合成,从而影响生殖;而雄蛹中丙酮酸激酶基因的表达显著下调,可能影响正常的能量代谢,从而导致雄蛾活力不高.     

基于RNA-Seq绒山羊皮肤两种毛囊差异表达基因的分析

为了研究绒山羊皮肤初级毛囊和次级毛囊之间的表达基因模式的差异,筛选影响毛囊发育的重要基因,对6只内蒙古绒山羊阿尔巴斯型个体进行RNA-seq测序,利用生物信息学方法对转录组数据进行分析,在测序结果质量控制后的基础上,对差异表达基因进行筛选、功能注释和富集分析。共筛选到617个在初级毛囊和次级毛囊中差异表达的基因,其中,上调表达基因297个,下调表达基因320个。GO功能注释结果显示,上调表达基因主要行使电子传递链、呼吸链电子传递、线粒体电子传递、基因表达等生物学功能;下调表达基因主要行使细胞吞噬、蛋白质复性、中性粒细胞聚集、细菌真菌防御反应等生物学功能。利用KEGG数据库作为参考,这些基因主要参与半胱氨酸和蛋氨酸代谢、RNA聚合、RNA可变剪切、底物磷酸化等通路。PPP2R2A和CDK2AP1基因可能在皮肤毛囊发育中发挥重要作用,以上结果为今后深入研究皮肤毛囊发育相关基因及功能提供了依据。     

太行鸡脾脏SRBC免疫应答基因的筛选与分析

为筛选太行鸡脾脏组织中绵羊红细胞(sheep red blood cell,SRBC)免疫应答的关键基因和信号通路,本研究采用高通量测序技术,构建了太行鸡SRBC免疫组和对照组脾脏组织的数字基因表达谱,对差异表达的基因进行筛选与注释、GO分析和通路的功能显著性富集以及差异基因编码蛋白的互作网络分析。结果表明:太行鸡在免疫6 d后的SRBC抗体滴度平均值为7.653;与对照组相比,差异倍数在2倍以上的共有1 108个基因,其中496个上调表达,612个下调表达,412个上调基因只在免疫组表达,537个下调基因仅在对照组表达;上调基因主要涉及T细胞激活、淋巴细胞增殖和单核细胞增殖等生物学过程,下调基因主要参与免疫效应、防御效应、炎性效应、先天性免疫效应生物学过程;在分子注释系统数据库中注释到的免疫相关的显著调控通路有12条,包括抗原的加工递呈、Toll样受体信号通路、沙门氏菌感染、HTLV-Ⅰ感染和单纯疱疹病毒感染等;56个差异基因编码的蛋白产物存在相互作用,其中16个基因位于网络中心节点,部分差异基因与SRBC相关QTL重叠。初步认为抗原加工与递呈的MHCⅡ类分子途径、T细胞激活等调控通路及RAG2、FOS、MHC B-LBⅢ、HSP90AA1、CXCR4和HSPA8等基因可能是参与调控太行鸡SRBC免疫应答的重要信号通路和基因,但其功能和影响还有待于深入研究。     

不同被毛密度獭兔的皮肤组织差异表达基因研究

为了筛选出不同被毛密度獭兔皮肤组织中差异表达的基因,本研究采用Agilent公司家兔全基因表达谱芯片对不同被毛密度獭兔皮肤组织总RNA进行了芯片杂交,通过实时定量PCR对部分差异表达基因进行了验证,并对基因表达谱进行了分析.结果表明,芯片试验共检测到2 657个差异表达的基因,其中包含1 106个已知功能的基因,表达上调的基因687个,表达下调的基因419个.GO分析表明,参与细胞增殖、分化、凋亡,信号传导及离子转运等生命过程的多种基因的表达水平发生了明显改变.实时定量PCR所得结果与基因芯片结果基本吻合.结果说明不同被毛密度獭兔皮肤组织的基因表达谱存在差别,这些基因的异常表达,可能参与皮肤毛囊的形成或分化过程,最终导致獭兔被毛密度的差异.这些基因的发现为进一步寻找与被毛密度相关的分子标记,并最终实现獭兔生产中的早期选育提供了研究方向.     

家蚕黄血近等基因系SSH文库的构建及部分EST的序列分析

以家蚕黄血品系KY和白血品系HB构建家蚕黄血近等基因系。用回交18代的家蚕黄血基因(Y)近等基因系群体中的黄血个体和白血个体中肠为材料,构建了家蚕黄血近等基因系抑制消减杂交(SSH)cDNA文库。从该抑制消减杂交cDNA文库随机挑选出46个阳性克隆进行测序,并用CAP3软件聚类拼接,得到4个假定基因(contig)和9个已知功能基因(unigenes)。通过BLAST比对和对所得表达序列标签(EST)的同源分析表明,这些基因主要涉及能量代谢因子、RNA分子水平相关调节因子、酶类、结构蛋白等,由此初步探明了参与黄血基因(Y)协同作用的相关基因表达蛋白的种类和数量,可为进一步研究蚕茧着色的分子机制及通过遗传选择培育天然有色茧品种提供基础信息。     

捻转血矛线虫阿苯达唑耐药株给药前后比较转录组学分析

为探明捻转血矛线虫阿苯达唑耐药株给药前后在转录组水平上的差异,本研究采用Illumina Hiseq4000对给药前后的捻转血矛线虫进行转录组测序,筛选得到差异表达基因并通过GO和KEGG数据库对其进行功能注释及富集性分析,并利用荧光定量PCR验证部分差异表达基因。结果显示,共筛选获得851个显著差异表达基因,其中包括584个上调基因和267个下调基因。通过GO功能富集分析显示,有458、418和367个基因分别注释到生物学过程、分子功能和细胞组分三大类;对差异表达基因进行KEGG富集分析显示,有173个差异表达基因参与到75条KEGG通路中,显著富集在核糖体合成、细胞凋亡、过氧化物酶增殖体激活受体(PPAR)等信号通路。本试验初步筛选了阿苯达唑耐药株给药前后的差异表达基因,为深入探索捻转血矛线虫耐药性分子机制、筛选对耐药性检测的分子标记及耐药性早期鉴别诊断方法的建立提供重要数据。     

应用基因表达系列分析(SAGE)技术研究高温处理前后家蚕的基因表达差异

高温对家蚕的生理和免疫能力有明显影响。为从分子水平上探究家蚕抗高温机制,应用基因表达系列分析(SAGE)技术获得家蚕5龄雌蚕高温处理前后中肠、丝腺和脂肪体组织的基因表达谱,构建高温组(34℃)和常温组(26℃)2个家蚕SAGE文库。2个家蚕SAGE文库分别包含3555107和3580976个原始标签,其中的标签种类分别为113684和131 296个,清洁标签的种类分别为45972和49467。比较2个文库清洁标签获得65 535种差异标签,共注释4249个基因,其中有1 062个差异表达的基因(P<0.05,错误检测率FDR≤0.001并且拷贝数的差异在2倍以上)。经GO分析发现2个文库中基因的分布极其相似,表明这些基因在不同的环境温度下有类似的生物学功能并参与类似的生理代谢过程。KEGG pathway分析显示有732个基因涉及176个KEGG路径,其中有40个为差异表达基因显著富集的路径(P<0.05),超过一半的路径与代谢、生物合成和信号传导有关。上述结果有助于对家蚕抗高温基因的鉴定以及探究基因调控的网络关系。     

家蚕胰岛素受体类似基因挖掘及在限食模型中的表达特征

家蚕素是家蚕胰岛素相关肽,与其受体(IR)结合激活胰岛素信号转导(IIS)途径。利用生物信息学方法,挖掘出具有胰岛素受体类似结构域的家蚕基因Ir-lp,其ORF长2 658 bp,编码885个氨基酸残基,蛋白质分子质量100.3 kD,pI为6.93,与果蝇等昆虫的同源蛋白保守区域高度一致,NJ法分子进化分析显示家蚕IR-LP与昆虫胰岛素受体相关蛋白同源,但是家蚕Ir-lp编码蛋白缺少胰岛素受体酪氨酸激酶催化结构域,基因表达特征也与已知的家蚕Ir有显著差异。建立家蚕限食模型,调查限食后家蚕8个组织中Ir-lp与Ir表达变化的差异,探讨Ir-lp基因与IIS途径的关系,结果显示长期限食使得Ir-lp与Ir在脂肪体、性腺和表皮中上调表达,在马氏管中下调表达,其中Ir-lp的表达量变化幅度较大。综合分析,IR-LP可能在家蚕胚胎期、蛹期、蛾期等特定发育时期通过与IR竞争结合家蚕素来有效调控能量利用效率。     

利用DGE筛选早期雌性鸡与鹌鹑属间杂交种性分化相关基因

已有研究表明鸡与鹌鹑属间杂交种胚胎早期死亡与性别分化存在关联性,本试验通过高通量测序构建数字基因表达谱(DGE)筛选雌性鸡与鹌鹑杂交种早期(3d)性别分化的相关基因,有助于揭示胚胎性腺分化时期相关基因与其早期死亡间的作用,利用实时荧光定量PCR技术对筛选出与相关表达差异基因进行验证。结果表明,构建雌雄鸡、雌雄杂交种3d胚胎DGE文库,雌鸡与雄鸡之间差异表达基因中有25个上调,41个下调;雌杂交种与雌鸡之间差异表达基因中有55个上调,175个下调;雌杂交禽和雄杂交禽之间差异表达基因中有36个上调,36个下调;这些差异基因大都与胚胎生长发育、细胞分化繁殖相关基因为代表。GO功能富集分析表明,差异表达基因主要定位在参与细胞增殖、分化、胚胎发育等行使催化、促进生物学过程的功能;Pathway分析得出,雌雄鸡、雌鸡与雌杂交种、雌雄杂交种的差异基因分别富集在12、13、15条pathway中。分析推测得出可能由于这些差异基因在体内紊乱表达,导致调控胚胎发育、分化相关信号通路异常是雌杂交种早期死亡原因之一,筛选出的差异基因将为后续的雌性杂交种早期发育、死亡研究提供依据。     

家蚕第2白卵近等基因系差异表达基因的筛选

为了解与家蚕第2白卵(w-2)性状形成相关的差异表达基因信息,以家蚕正常型黑卵及其第2白卵近等基因系的转色期蚕卵为材料,构建抑制消减杂交(SSH)文库,筛选差异表达基因。对SSH文库中部分克隆的测序分析表明,该文库对差异表达基因的富集性较好。随机挑选SSH文库中的300个克隆制作家蚕cDNA芯片,对家蚕正常型黑卵及第2白卵近等基因系转色期蚕卵进行检测,获得11个差异表达基因。对这11个差异表达基因进行实时荧光定量RT-PCR验证分析,其结果与芯片数据分析结果趋势一致,在正常型黑卵与第2白卵近等基因系之间,这些基因的表达差异为0.1倍至数千倍。     

家蚕近等基因系感染浓核病毒(BmDNV-Z)前后中肠组织蛋白的差异表达分析

家蚕浓核病毒(BmDNV)是危害家蚕的主要病毒之一。为鉴定与家蚕抗病毒相关的蛋白质,以对BmDNV完全不感染的家蚕品种兰10(L10)为供体亲本,将其抗性基因导入家蚕敏感品种菁松(JS)中,构建抗性近等基因系NIL(BC6F2)。对JS及其近等基因系NIL分别用家蚕浓核病毒镇江株(BmDNV-Z)添毒,二者分别表现为高度敏感和完全不感染。对JS和NIL在病毒感染前后中肠组织蛋白双向电泳(2D-PAGE)图谱中的差异蛋白点进行串联质谱(MALDI-TOF-TOF)分析,共鉴定了41个差异表达的蛋白点,其中有35个蛋白点可能与病毒的诱导相关,有6个蛋白点可能与家蚕的组成抗性相关。鉴定的差异表达蛋白包括糖酵解酶类、能量代谢酶类、参与基因表达的蛋白质以及参与其它细胞功能的蛋白质等。选取10个差异表达蛋白点进行基因表达定量PCR分析,进一步确证了这些蛋白质在JS及其近等基因系NIL之间以及在病毒诱导前后的差异表达。例如:精氨酸激酶在NIL和JS中均可被诱导表达;V-ATP合成酶及热激蛋白HSP70只在NIL中被特异性诱导表达;烯醇化酶在NIL中的表达水平显著高于JS,且不能被病毒感染所诱导,是一个典型的组成抗性相关蛋白。鉴定出的41个差异表达蛋白点有可能参与了家蚕对BmDNV-Z的抗性。     

一种适用于蚕卵mRNA差异显示的方法

采用自行配制的试剂取代GenHunterCorporationRNAimageTM Kit,并改用银染法代替放射自显影 ,建立了一种适用于蚕卵mRNA差异显示的方法。该方法具有成本低、安全、高效、量多质优等特点。运用该方法对不同温湿度催青处理后的夏sch蚕卵进行mRNA差异显示 ,展示不同处理差异表达产生的RNA分子 ,回收了 1条差异带 ,并对差异进行了验证     

基于瘤胃转录组探究双峰驼沙漠适应性分子机制

旨在比较胚胎期和成年期双峰驼瘤胃在组织形态、编码基因表达上的变化,挖掘影响双峰驼瘤胃发育的关键基因和通路,从消化系统探究双峰驼的沙漠适应性机制。本研究选取3峰10~12岁健康状况良好的成年期阿拉善双峰驼,以及3峰9~10月龄健康状况良好的胚胎期阿拉善双峰驼,采集瘤胃组织样品,制作石蜡组织切片,观察成年期与胚胎期双峰驼瘤胃,比较其组织结构之间的差异。分别提取成年期和胚胎期双峰驼的瘤胃组织总RNA,利用Illumination Hiseq 2000测序平台分别进行转录组测序,对转录组数据进行质控、比对、差异基因筛选、GO、KEGG富集分析。随机选择6个差异表达基因进行荧光定量试验,关联转录组数据与荧光定量试验的表达趋势。结果表明,胚胎期瘤胃组织中上皮细胞和肌纤维细胞清晰可见,分布密集,在成年期的瘤胃组织中,可见明显的肌纤维,肌纤维直径较宽,肌纤维间的空隙较大。转录组测序结果显示,每个样本获得至少10G的数据量,各样本的质控率都在90%以上,Q30数据都在88%以上。对测序数据进行分析,以胚胎期为对照组,成年期为试验组,筛选到1 207个差异表达基因,其中上调基因456个,下调基因751个;对差异表达基因进行层次聚类分析,结果显示,成年期的3个个体（M1、M2、M3）表达模式接近,胚胎期的3个个体（T1、T2、T3）表达模式接近。对差异表达基因进行GO和KEGG富集分析,结果显示,上调差异表达基因显著富集到62条显著的GO条目,下调差异表达基因显著富集到366条显著的GO条目,73条显著的KEGG通路。差异表达基因主要富集在代谢过程的负调控、RNA生物合成过程的负调控、基因表达的负调控等GO条目中,KEGG主要富集到MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号、胰岛素信号通路、醛固酮的合成与分泌等通路中。同时筛选到MAPK12、MAPK13、FABP5、PPARγ、CaMK1等与双峰驼沙漠适应性相关的基因。荧光定量结果显示,差异基因在成年期和胚胎期瘤胃组织中的表达模式与RNA-Seq的结果一致。上述结果表明,双峰驼的瘤胃组织可能与脂肪细胞分化有关。在沙漠环境中,双峰驼可能降低瘤胃组织代谢效率、通过胰岛素抵抗作用提高血糖耐受性以及促进醛固酮的合成与分泌以调节血压平衡,以更好地在沙漠干燥缺水的环境中生存。     

家蚕防御素基因的序列特征与表达模式分析及原核表达试验

家蚕防御素(defensin)是家蚕抗菌肽家族的主要成员之一,为家蚕先天性免疫的重要效应因子。采用生物信息学方法分析家蚕防御素基因BmdefA、BmdefB的序列中各有2个外显子,2个基因分别定位于家蚕第4号和第13号染色体上;等电点预测BmdefA带有负电荷,属于罕见的阴离子型抗菌肽,而BmdefB带有正电荷,属于常见的阳离子型抗菌肽;预测2个基因编码的成熟肽分子质量均在4 kD左右。用RT-PCR方法检测BmdefA在家蚕整个发育过程中有表达,且在检测的幼虫和成虫各组织中均有表达;BmdefB从幼虫5龄第3天到成虫期表达,雄性表达量高于雌性,且在5龄第3天幼虫的生殖腺、脂肪体和血细胞中高水平表达。家蚕防御素BmdefA、BmdefB具有不同的分子特性和表达特征,暗示它们在家蚕先天免疫过程中可能行使不同的功能,甚至可能具有不同的抗菌机理。构建融合GST标签的家蚕防御素基因原核表达载体,通过在大肠杆菌细胞内诱导表达,获得可溶性的目的蛋白,使用GST亲和层析柱初步纯化表达的融合蛋白并进行Western blotting鉴定,为进一步研究BmdefA、BmdefB的体外活性和抑菌机制奠定基础。     

幼龄和成年太行山羊附睾头差异竞争性内源RNAs机制分析

旨在筛选出幼龄和成年太行山羊附睾头中差异表达的长链非编码RNAs（lncRNAs）、微小RNAs（miRNAs）和mRNAs,构建太行山羊附睾头中免疫相关基因调控的竞争性内源RNAs（ceRNAs）网络。本研究选取健康状况良好、体重相近的幼龄（2月龄）和成年太行山羊（2周岁）公羊各3只,去势采集其附睾头组织进行全转录组测序,用DESeq2软件筛选出幼龄和成年太行山羊附睾头差异mRNAs、lncRNAs和miRNAs。利用miRanda软件和R-package（reshape2、dplyr、tidyr）,基于ceRNA-score原理分析得到差异ceRNAs表达谱,对预测所得具有ceRNAs关系的mRNAs进行GO和KEGG富集分析,并绘制得到太行山羊附睾头免疫相关ceRNAs网络。最后,各随机挑选8个mRNAs、miRNAs和lncRNAs,并通过qRT-PCR验证全转录组测序结果的准确性。根据分析结果,以幼龄太行山羊附睾头为对照,成年山羊附睾头差异表达mRNAs有6 461个,其中上调2 997个、下调3 464个;差异表达lncRNAs共有1 147个,其中703个上调、444个下调;差异表达miRNAs共有182个,其中81个上调、101个下调。共得到具有ceRNAs调控关系的lncRNAs 366个,其中上调213个,下调153个;mRNAs有3 131个,其中1 253个上调,1 878个下调;miRNAs有140个,其中48个上调,92个下调。分析具有ceRNAs机制的基因发现,表达量显著上调的与免疫相关的mRNAs：淋巴细胞抗原6复合位点蛋白G5B（LY6G5B）、脂质运载蛋白9（LCN9）、解整合素金属蛋白酶28（ADAM28）和粘蛋白15（MUC15）基因在成年太行山羊附睾头表达量高,且极显著高于幼龄太行山羊（P<0.01）。GO和KEGG富集分析表明,具有ceRNAs机制的差异表达基因富集在内质网蛋白加工通路、蛋白质输出通路、粘蛋白型O-聚糖生物合成通路、细胞外基质受体相互作用通路等。qRT-PCR验证结果表明,除chi-miR-320-3p外,其余差异表达的mRNAs、lncRNAs和miRNAs表达趋势与全转录组测序结果一致。附睾头免疫相关ceRNAs网络分析表明,lncRNA-MSTRG.22929.11、lncRNA-MSTRG.57822.5、lncRNA-MSTRG.26758.1、lncRNA-MSTRG.12113.3、lncRNA-MSTRG.59930.2等lncRNAs作为ceRNAs可以调控附睾头免疫相关基因表达。本研究筛选出了幼龄和成年太行山羊附睾头差异ceRNAs,挖掘并绘制了免疫相关的关键ceRNAs网络,这些lncRNAs作为ceRNAs可为太行山羊附睾头免疫调控机制研究提供参考依据。     

家蚕类胰凝乳蛋白酶基因的发掘与表达特征分析

类胰凝乳蛋白酶(CTLP)是鳞翅目昆虫幼虫中肠中的主要蛋白酶。基于构建的家蚕中肠等组织差异表达基因的SSH文库,发掘和克隆了一条新的家蚕类胰凝乳蛋白酶基因Ctlp(GenBank登录号:JQ081296)。该基因定位于18号染色体nscaf2901,靠近端粒,有5个外显子和4个内含子,全长cDNA序列976 bp,ORF为840 bp,编码279个氨基酸残基,信号肽序列1～18 aa(分值0.985),1～20 aa和50～100 aa区域为2个由内到外的跨膜螺旋,推测蛋白质相对分子质量为29 780.10,pI为8.75,蛋白质功能域(保守区)和分子进化分析显示其为丝氨酸蛋白酶家族的类胰凝乳蛋白酶。家蚕Ctlp基因具有在5龄幼虫中肠特异性高表达和伴随进食量增加而上调表达的特征,同时也具有性别差异性和熟蚕期特异性上调表达的现象,暗示CTLP可能具有促进消化以外的功能。构建pET32a-ctlp重组表达载体,SDS-PAGE分析和Western blot鉴定结果显示,重组蛋白在原核表达系统中的表达量较低。