不同代次羊驼皮肤黑素细胞TYR基因表达变化的研究

为了探讨TYR基因在体外培养的羊驼皮肤黑素细胞不同代次间表达变化差异,根据Gen Bank中已发现的序列(EU293064)设计引物和探针,以羊驼皮肤黑素细胞的RNA为模板,采用QRT-PCR Taq Man探针法研究羊驼酪氨酸酶基因在不同代次间羊驼皮肤黑素细胞中m RNA表达量.结果表明,经过内参基因校正后,第10代羊驼黑素细胞中TYR基因的相对表达量是第3代细胞相对表达量的25倍(P0.01),第10代细胞与第5代细胞表达差异不明显(P0.05)。表明TYR基因表达量的差异与羊驼皮肤黑素细胞传代可能存在一定的相关性。     

水貂酪氨酸酶基因外显子1的鉴定及序列变异分析

根据GenBank中公布的雪貂(登录号:EF405957)、大熊猫(登录号:XM_002930310)、家犬(登录号:CFU42219)及猫(登录号:AY959314)的酪氨酸酶(tyrosinase, TYR)基因DNA序列保守区域,设计1对特异性引物,利用PCR及克隆技术测定了短毛黑水貂、红眼白水貂和米黄色水貂的TYR基因外显子1部分序列,并对该序列进行了BLAST鉴定及变异位点分析,基于该基因编码氨基酸序列构建了16个物种的系统进化树。结果表明,测定的3种毛色水貂TYR基因序列长度均为796 bp,包括795 bp的外显子1和1 bp 5'UTR,共检测到5个单一突变位点:g.A34G、g.T138A、g.T248C、g.A545G和g.C765A,包含4个错义突变:g.A34G(p.Ser12Gly)、g.T248C(p.Val83Ala)、g.A545G(p.Tyr182Cys)和g.C765A(p.His255Gln),1个移码突变分别出现在短毛黑水貂和红眼白水貂个体间:g.T138A(p.Cys46*),获得TYR基因GenBank登录号分别为:短毛黑水貂(KJ198847)、红眼白水貂(KJ658343)和米黄色水貂(KJ152769)。水貂与雪貂、大熊猫、家犬、猫、家兔、猪、羊驼、山羊、绵羊、牛、人、猕猴、黑猩猩、原鸡和日本鹌鹑的TYR基因核苷酸序列同源性为72.8%～98.6%,相应氨基酸序列同源性为75.0%～98.1%。TYR基因分子进化树显示水貂与雪貂遗传关系最近,分化时间约为1000万年前,且与原鸡和日本鹌鹑亲缘关系最远。该结果为进一步开展TYR基因多态性与水貂毛色表型的相关性研究奠定了生物信息学基础。     

中国羊驼KAP1．3基因的克隆及序列分析

毛纤维中的角蛋白（keratin）和角蛋白关联蛋白（keratin-associatedproteins）的数量遗传性状位点（quantitativetraitloci）已有学者在绵羊等一些动物身上找到，其中KAP1．1、KAP1.2、KAP1．3等基因作为候选基因来间接选择羊毛细度性状。而羊驼相关候选基因的研究还未见报道，本研究提取成年羊驼的新鲜血液中基因组DNA，并以此为模板采用PCIL技术扩增KAP1．3基因进行序列分析，测序后在NCBI工作平台中进行BLASTn同源性比较，得出结论：结果表明多个物种间KAP1．3基因编码区的序列相似性在73%以上。借助DNAstar分子生物学分析软件绘制了相关动物的遗传进化图．并对羊驼的种属地位进行了进一步验证。通过羊驼与绵羊在KAP1．3的氨基酸序列上的比较只有十五处残基的差异。证实KAP1．3基因与羊驼毛细度性状相关。     

羊驼酪氨酸酶基因家族在不同毛色个体中的基因表达水平

黑色素对动物毛色的形成起重要作用,酪氨酸酶基因家族成员参与了黑色素的合成。为了探索羊驼酪氨酸酶基因家族的基因表达与其毛色之间的相关性,本研究利用实时荧光定量PCR技术分析了不同毛色羊驼酪氨酸酶基因家族成员TYR、TRP1和TRP2的相对基因表达量。研究结果显示：棕色羊驼中的TYR、TRP1和TRP2的mRNA相对表达量经内参基因校正后分别是白色羊驼中的13.669倍、3.417倍和8.593倍。结论表明棕色羊驼中酪氨酸酶基因家族3种成员的基因表达水平均高于白色羊驼,揭示了羊驼TYR基因家族成员的基因表达量与其毛色表型具有相关性。     

羊驼核糖体蛋白S5(RPS5)基因与绒毛生长发育的研究

利用southern blotting技术从羊驼皮肤cDNA文库中筛选出核糖体蛋白S5(RPS5)基因,对该基因进行测序,通过对羊驼RPS5基因的序列结构特点及编码氨基酸与其它哺乳动物的进行比较分析,从而发现羊驼RPS5基因的特性;并对序列进行生物信息学分析,确定基因发挥功能的特殊结构域,进而对羊驼RPS5基因的功能进行分析研究,为以后的相关研究奠定基础。     

皖西白鹅BMP4基因部分cDNA序列的克隆及序列分析

根据GenBank中鸡BMP4基因序列设计1对特异性引物,从12胚龄皖西白鹅背部皮肤中提取总RNA作为模板,采用RT-PCR技术首次扩增出鹅BMP4基因的部分cDNA序列。将其克隆进pGEM-T easy vector中,经限制酶酶切鉴定后进行测序。将测序结果与鸡、大鼠、小鼠、人和黑猩猩的BMP4核苷酸序列进行比对,发现多处突变。转换成氨基酸序列后发现鹅BMP4的氨基酸序列与其他物种也有多处不同。分析这些突变可能是导致禽类羽毛和哺乳动物毛发之间形态学差异的原因之一。     

羊驼皮肤中核糖体蛋白L41的表达

为了研究羊驼皮肤中核糖体蛋白L41(RPL41)基因的序列结构特点及功能,用Southern blot技术从羊驼皮肤cDNA文库中筛选出RPL41基因,测序后通过生物信息学方法对该基因进行了相关分析。经分析发现羊驼RPL41基因序列中存在CCGG位点,推测羊驼RPL41基因在此位点发生甲基化。表明RPL41基因可能参与皮肤细胞凋亡及毛生长周期的调节。     

羊驼Bclaf1基因cDNA部分序列的克隆及组织表达特征分析

为了获得羊驼Bclaf1基因cDNA序列,研究该基因在羊驼皮肤中的表达特征.本研究对已构建的羊驼皮肤cDNA文库进行筛选和ESTs分析,并运用免疫组化技术对Bclaf1在羊驼皮肤中的表达进行组织定位.结果,羊驼Bclaf1基因与褐鼠、小鼠、狗、人和黑猩猩Bclaf1基因相应cDNA序列的相似性分别为100%,92.9%、86.0%、81.1%和77.9%.Bclaf1在幼年羊驼毛囊中没有阳性细胞,在成年羊驼、白色和棕色羊驼毛囊的外根鞘处集中表达;根据光密度值分析得Belaf1在不同毛色羊驼毛囊中的表达差异显著.结果表明,Betaf1基因在羊驼皮肤中的表达和定位随年龄和毛色而变化.     

猪TYR基因外显子1的克隆测序及序列分析

本研究对荣昌猪和内江猪的TYR基因外显子1进行了克隆测序及序列分析，结果发现3个新的突变位点：319C→T，537C的插入，551A→G。部分突变序列已被GenBank收录，登录号为：AY236997。将突变序列翻译成氨基酸序列后发现，319C→T和551A→G是同义交变。537C的插入是移码突变，其是否会对猪的毛色造成影响，还有待进一步研究。     

CDK5对羊驼皮肤黑色素细胞TYR和MITF mRNA表达的调节

为了证实CDK5是否参与羊驼毛色的形成,本研究主要对CDK5在羊驼黑色素细胞中调节TYR和MI TF的表达进行了研究.本研究首先采用免疫组织化学方法检测CDK5在羊驼皮肤黑色素细胞中的定位,再通过脂质体将CDK5转染于羊驼皮肤黑色素细胞,之后通过Western blot和qRT-PCR的方法检测转染后黑色素细胞中CDK5蛋白、TYR和MITF mRNA的表达.免疫组化结果显示CDK5位于黑色素细胞的胞质和细胞核内;Western blot结果显示转染组黑色素细胞中CDK5蛋白表达量明显高于对照组;qRT-PCR结果显示CDK5可下调MITF的表达,同时上调TYR的表达,转染组黑色素细胞中MITF和TYR mRNA的表达水平分别是对照组细胞的0.264 9和3.931 3倍.结果揭示CDK5可能通过调节黑色素细胞核中TYR和MITF mRNA的表达,从而参与调控羊驼毛色形成.     

Detection of bovine viral diarrhea virus by spot hybridization with probes prepared from cloned cDNA sequences

A cytopathic strain of bovine viral diarrhea virus (BVDV) was purified from infected cell culture fluids by isopycnic density-gradient centrifugation. Genomic RNA was extracted and tailed with adenine residues at the 3' end with poly-A polymerase. Double-stranded complementary DNA (cDNA) was synthesized, using the poly-A-tailed RNA as a template and oligo-dT as a primer, and then cloned into the pUC9 plasmid. Virus-specific cDNA sequences, varying in length from 0.5 to 2.5 kilobases (kb), were obtained. One BVDV-specific sequence of cloned cDNA, 1.1 kb in length and with an internal Pst I restriction endonuclease cleavage site, was selected for use as a probe. The cloned cDNA insert was removed from the plasmid either with or without flanking plasmid sequences and labeled with 32P-nucleotides by nick translation for use as hybridization probes for BVDV. The performance of probes of smaller fragments of the insert was compared to that of the intact sequence in hybridization assays. In addition, 2 methods of specimen preparation were compared to establish optimum parameters for hybridization. The hybridization assay was 10-100 times more sensitive than infectivity assays for BVDV in infected cell cultures. Freezing of specimens reduced by 10-fold the sensitivity of hybridization for BVDV target sequences. The probes prepared from the cloned cDNA hybridized with all cytopathic and noncytopathic BVDV strains tested but not with uninfected cell cultures, cellular ribosomal RNA, bovine coronavirus, bluetongue virus, or bovine adenovirus 3. Probes prepared with native plasmid DNA did not hybridize with BVDV or uninfected cell cultures.(ABSTRACT TRUNCATED AT 250 WORDS)     

狂犬病病毒3aG株核蛋白基因cDNA的克隆、序列分析及在COS细胞中的暂态表达

从狂犬病病毒 ３ａ Ｇ 株感染的 Ｂ Ｈ Ｋ 细胞裂解上清液中快速提取病毒 Ｒ Ｎ Ａ,用 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ 得到编码核蛋白完整结构基因的 ｃ Ｄ Ｎ Ａ。进一步将此基因克隆入 ｐ Ｕ Ｃ １８中,进行核苷酸序列分析,并与国外狂犬病病毒 Ｐ Ｖ、 Ｃ Ｖ Ｓ、 Ｓ Ａ Ｄ Ｂ１ ９ 株以及国内另一狂犬病病毒 ５ａ Ｇ 株的 Ｎ 基因序列进行了同源性比较。然后将 Ｎ 基因正向插入真核表达质粒中,转染 Ｃ Ｏ Ｓ７ 细胞,用免疫组化方法证明所克隆基因可在细胞中正确表达出 Ｎ 蛋白。     

鸭肝炎病毒A66株部分cDNA文库的构建与序列分析

本研究根据已发表的小核糖核酸病毒（picornavirus）核苷酸序列设计4对引物。以RNAiso Reagent试剂抽提含DHV A₆₆鸡胚尿囊液总RNA ，用TakaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver3.0试剂盒进行RT-PCR扩增，将所得PCR产物回收并克隆于pMD18-T 载体、转化感受态细菌DH5а，利用氨苄青霉素筛选阳性克隆子, 经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切鉴定重组质粒。取重组阳性质粒进行测序，测序结果与近期GenBank登录的3株Ⅰ型DHV核苷酸序列比对，结果显示与03D株、H株、5886株鸭肝炎病毒的核酸序列同源性分别为96.8%、96.3%、96.2%，表明成功构建了DHV A₆₆ 株部分cDNA文库。     

四种禽类Sox8基因部分cDNA序列的克隆及其序列分析

应用RT—PCR法扩增了鸭、孔雀、榛鸡和鹧鸪的Sox8基因的部分cDNA序列并测序，计算机模拟预测了其氨基酸序列，并将所得的序列与GenBank上发表的家鸡的相应序列进行同源性比较。结果表明：5个物种的核苷酸序列同源性可达96％以上。。     

蒙古绵羊Bcl-2基因3’端 cDNA的克隆及序列分析

为扩增蒙古绵羊Bcl-2基因3’端,根据GenBank上已公布的牛的序列,设计了2条引物。从蒙古绵羊脾中提取总RNA ,采用RT-PCR 技术扩增出Bcl-2的cDNA ,并重组到PMD18-T 载体,经限制性内切酶谱分析和DNA 序列测定, 证实所克隆的cDNA 为Bcl-2,因为该cDNA 包含由261个碱基组成的开放读码框(ORF) ,该ORF 编码83个氨基酸。经比对,与牛的核苷酸序列的同源性为95.8%。     

家蝇溶菌酶1基因的克隆、序列分析及原核表达

采用cDNA末端快速扩增技术（RACE）,对鸡致病性大肠杆菌诱导家蝇幼虫抑制性消减文库（SSH）中筛选得到家蝇溶菌酶1基因（（Musca domestica lysozyme-1,MdL-1）进行扩增,测序分析得到一个全长为537bp的cDNA片段,其开放阅读框（ORF）432bp,与Genbank中登录号为AY344589．1基因同源性为96％。构建重组表达质粒pET-32a-MdL-1,转化大肠杆菌BL21（DE3）,异丙基-β—D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导表达,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）分析显示。表达产物大小约为34kD,与预期蛋白大小一致。结果表明,利用RACE技术克隆得到MdL-1全长基因并在大肠杆菌中获得了表达,为进一步研究该蛋白的生物学及免疫学活性奠定了基础。     

The use of biotin-labeled cDNA probes for the detection of infectious bursal disease viruses

A cDNA library was prepared from the double-stranded RNA genome of the infectious bursal disease virus (IBDV) strain ST-C. The cDNA molecules were annealed into the plasmid pUC9 and used to transform Escherichia coli strain JM107. A cDNA clone that contained IBDV-specific nucleotide sequences was selected and designated STC-1. Radiolabeled probes were prepared from STC-1 and hybridized to genome segment A of ST-C in a northern blot hybridization assay. The STC-1 cDNA was 448 base pairs in length, and its nucleotide sequence indicated that it is located near the VP-2/VP-4 junction in IBDV genome segment A. Biotin-labeled probes were prepared from STC-1 and used in a dot-blot hybridization assay to detect IBDV. Under relatively low stringency conditions of hybridization, the biotinylated probes detected four subtypes of IBDV serotype 1 and a serotype 2 IBDV isolate.     

猪IL-15 cDNA真核表达载体的构建、表达及其免疫佐剂效应

参考GenBank发表猪IL-15mRNA序列设计引物,用RT-PCR方法扩增猪IL-15cDNA,并克隆到pMD18-T载体中,通过PCR、酶切和测序验证克隆正确,再亚克隆到真核表达载体pcDNA-3.1（＋）上,得到重组质粒pcD-NA-pIL-15。在脂质体介导下,重组质粒pcDNA-pIL-15转染AD-293细胞。以鼠抗猪IL-15为一抗,用间接免疫荧光分析表明猪IL-15基因均在AD-293细胞中成功进行了瞬时表达。小鼠免疫试验表明,pcDNA-pIL-15作为免疫佐剂,能够有效提高小鼠的脾T细胞增殖,加强pcDNA-ORF2（PCV2）质粒免疫过程中的特异性中和抗体的产生,为进一步研制猪IL-15基因佐剂疫苗及进行临床实验奠定基础。