马铃薯WRKY6基因的克隆、序列分析与原核表达研究

在高等植物中WRKY转录因子家族成员众多,它广泛参与植物对生物胁迫、非生物胁迫、生长发育和代谢过程的调控。本研究采用同源序列克隆的方法获得马铃薯WRKY6基因,序列分析表明该蛋白属于WRKY家族第3组成员,锌指结构为C-X7-C-X23-H-X-C。构建系统发育树结果表明它与拟南芥WRKY70亲缘关系较近,相似性达58%。然后将其完整编码区构建到大肠杆菌表达载体。在培养温度18℃条件下添加0.2 mmol/L IPTG(异丙基硫代半乳糖苷),诱导培养8 h可获得高表达融合蛋白。进一步实验获得特异性和纯度非常高的纯化蛋白。本研究为进一步确定该蛋白的体外活性及生物学功能奠定了坚实基础。     

盐胁迫应答基因GmWRKY6的克隆及转基因百脉根的抗盐分析

根据大豆盐胁迫RNA-Seq数据,筛选并克隆得到1个大豆WRKY类转录因子GmWRKY6基因。序列分析表明,该基因含有1 个1674 bp的开放阅读框,编码557 个AA,编码蛋白属于IIb 类WRKY 家族成员,含有1个WRKY 保守结构域和1个C₂H₂锌指结构基序。基因表达模式分析表明,GmWRKY6基因在大豆根中表达量较高,并且该基因受盐胁迫诱导表达。构建GmWRKY6基因的植物超表达载体,获得7株T₀代阳性转GmWRKY6基因百脉根。进一步对T₁代转基因株系进行抗盐分析发现,在200 mmol·L^-1 NaCl 处理14 d后转基因株系生长状态良好,而野生型对照生长矮小,叶片干枯。此外,对相关生理指标的测定发现,转基因株系叶片中脯氨酸和叶绿素含量显著高于野生型对照,而丙二醛含量和相对质膜透性显著低于野生型对照。此外,盐胁迫下转基因百脉根叶片中钠离子含量显著低于对照,而钾离子含量显著高于对照。以上结果表明大豆GmWRKY6基因的超表达能够显著增强百脉根的抗盐能力。     

油莎豆CeWRKY转录因子响应非生物胁迫的功能表征

油莎豆亦称油莎草,地上部分是优质牧草,地下块茎可积累大量油脂,抗逆性强、适应性广,是一种新型饲草和油料作物。WRKY是一类数量庞大的转录因子超家族,广泛参与调控植物生长发育、物质代谢和胁迫应答等生理过程。然而,有关于油莎豆WRKY家族成员及其功能知之甚少。本研究基于转录组分析,鉴定出67条油莎豆WRKY转录因子。系统发育树结果显示,油莎豆CeWRKY与拟南芥AtWRKY类似,分为I、Ⅱ、Ⅲ3个亚家族。CeWRKYs均具有典型的WRKY结构域和锌指结构域,其中7条蛋白序列的WRKY结构域存在变异,可能与WRKY成员功能歧化相关。油莎豆CeWRKY蛋白的序列长度、相对分子量、等电点等存在较大差异,均为亲水性蛋白,不含跨膜结构,亚细胞定位预测均位于细胞核。CeWRKY基因在块茎发育时期的表达模式具有时空特异性。不同CeWRKY基因参与不同逆境胁迫响应,其中CeWRKY8基因分别在干旱、盐、碱胁迫处理的油莎豆幼苗中表达谱变化显著,可能是参与油莎豆逆境胁迫响应调控的一个主效转录因子。本研究为深入解析油莎豆CeWRKY转录因子的多样性生物学功能以及介导逆境胁迫应答的分子机制奠定了基础,亦为优质高抗...     

野生大豆盐胁迫响应基因GsPIP的克隆及其序列分析

盐胁迫是影响植物生长、发育以至产量的重要因素,野生大豆是优良的非生物胁迫抗性材料,是天然的优质抗性基因库。本研究以耐盐东北野生大豆为试材,利用东北农业大学植物生物工程研究室已获得的基因芯片杂交结果,对植物生物工程研究室构建的野生大豆盐胁迫EST数据库中各EST在胁迫下的表达情况进行了分析,从中选出了1个在高盐、低温、干旱胁迫早期均上调表达的3′-EST,序列分析表明该EST编码质膜结合蛋白(plasma membrane intrinsic protein, PIP),属于主嵌入蛋白(major intrinsic protein, MIP)家族;通过电子克隆和改进的5′-RACE获得了基因完整的编码区;其翻译产物与含羞草质膜结合蛋白的相似性为90%,将该基因命名为GsPIP。GsPIP基因的翻译产物具有主嵌入蛋白家族特征性的跨膜结构域,无信号肽,与已发现的植物PIP蛋白一致。本研究获得的基因具有自主知识产权,通过进一步的功能分析,可为耐渗透胁迫基因工程研究提供基因资源,并为植物耐渗透胁迫机理研究提供依据。     

野生大豆盐胁迫响应基因GsPIP的克隆及其序列分析

盐胁迫是影响植物生长、发育以至产量的重要因素,野生大豆是优良的非生物胁迫抗性材料,是天然的优质抗性基因库.本研究以耐盐东北野生大豆为试材.利用东北农业大学植物生物工程研究室已获得的基因芯片杂交结果,对植物生物工程研究室构建的野生大豆盐胁迫EST数据库中各EST在胁迫下的表达情况进行了分析,从中选出了1个在高盐、低温、干旱胁迫早期均上调表达的3'-EST,序列分析表明该EST编码质膜结合蛋白(plasma membrane intrinsic protein,PIP),属于主嵌入蛋白(major intrinsic protein,MIP)家族;通过电子克隆和改进的5‘-RACE获得了基因完整的编码区;其翻译产物与含羞草质膜结合蛋白的相似性为90%,将该基因命名为GsPIP.GsPIP基因的翻译产物具有主嵌入蛋白家族特征性的跨膜结构域,无信号肽,与已发现的植物PIP蛋白一致.本研究获得的基因具有自主知识产权,通过进一步的功能分析,可为耐渗透胁迫基因工程研究提供基因资源,并为植物耐渗透胁迫机理研究提供依据.     

过量表达紫花苜蓿MsHB7基因对拟南芥耐旱性的影响

同源异型域-亮氨酸拉链蛋白（HD-Zip）第I类亚家族在植物非生物胁迫调控过程中起着重要作用,已在多个物种中进行了克隆鉴定,但关于紫花苜蓿该家族基因的研究还鲜有报道。本研究旨在研究紫花苜蓿HD-Zip第I类亚家族基因MsHB7对拟南芥抗旱性的调控功能。通过克隆得到大小为738 bp、编码245个氨基酸的MsHB7基因的开放阅读框。多重序列比对和系统进化树分析结果显示,MsHB7蛋白属于HD-Zip I亚家族,且与拟南芥中ATHB7和ATHB12亲缘关系较近。实时荧光定量分析表明,MsHB7基因受干旱诱导。将MsHB7基因转化拟南芥并获得了阳性植株。干旱处理后,转基因拟南芥比野生型拟南芥萎蔫程度更明显,转基因植株相对含水量显著低于野生型拟南芥,并积累了更多的脯氨酸和丙二醛。qRT-PCR检测发现处理之后逆境胁迫指示基因ATCAT1、 ATDREB2A和ATRD29A在转基因拟南芥中的表达量显著升高,而ATLEA3的表达量显著下降。上述结果表明MsHB7基因的过表达可降低转基因拟南芥的耐旱性,为进一步开发利用该基因提供理论依据。     

紫花苜蓿MsWRKY33转录因子的分离及遗传转化研究

WRKY转录因子是植物特有的转录因子,广泛参与植物对多种逆境胁迫的反应。但是对紫花苜蓿中WRKY转录因子的研究还较少。本研究从紫花苜蓿中克隆了一个WRKY I类转录因子MsWRKY33。该基因CDS全长1536 bp,编码512个氨基酸,结构分析显示MsWRKY33包括两个WRKY结构域和一个C2H2锌指结构(C-X4-C-X23-H-X-H),表明其属于WRKY I 族WRKY转录因子。亚细胞定位预测MsWRKY33蛋白定位在细胞核。MsWRKY33基因受盐、干旱和冷胁迫诱导,暗示基因可能参与了这些逆境胁迫的调控。构建原核表达载体pET-MsWRKY33, SDS-PAGE分析表明在大肠杆菌中表达了MsWRKY33蛋白。扩增MsWRKY33编码区cDNA,以pBI121为基础载体,构建植物超表达载体pBI121-MsWRKY33。采用农杆菌介导的愈伤组织培养法转化紫花苜蓿。利用nptⅡ基因引物和载体特异引物检测抗性苗呈阳性,表明目的基因已成功导入紫花苜蓿基因组中。qRT-PCR检测发现,MsWRKY33基因在转基因株系中得到增强表达。本研究为进一步探索WRKY转录因子基因在紫花苜蓿抗逆性调控中的作用奠定了基础。     

中间锦鸡儿WRKY15基因克隆及其生物信息学分析

WRKY家族是高等植物中最大的转录因子家族之一,参与多种生物与非生物胁迫过程的调节。本研究采用PCR技术从中间锦鸡儿(Caragana intermedia)中克隆了CiWRKY15基因。结合生物信息学方法对CiWRKY15基因编码的蛋白质进行理化性质、亚细胞定位、蛋白结构以及系统进化等进行预测分析。结果显示:CiWRKY15基因序列包含1005bp开放阅读框,编码335个氨基酸,含有一个典型的WRKY结构域,属于Group IId亚族。预测蛋白分子量为47.39KD,等电点为8.59,它的亚细胞定位于细胞核内。该研究结果为进一步挖掘与非生物胁迫相关的WRKY15转录因子的功能,以及为改进植物抗生物和非生物逆境的特性提供了理论依据。     

WRKY转录因子家族在植物响应逆境胁迫中的功能及应用

WRKY转录因子家族是植物体内最大的转录因子超家族之一,广泛分布在多种植物中.WRKY转录因子家族因具有高度保守的WRKY结构域而得名,它可以结合靶基因启动子W-box顺式作用元件,从而调控多种类型靶基因的表达,在植物响应生物及非生物胁迫(盐胁迫、干旱胁迫、氧化胁迫等)过程中起到重要的调控作用.本文介绍了WRKY转录因子家族的分子结构特征及作用机制,分析了其在植物响应生物和非生物胁迫过程中的生物学功能及分子调控机理,总结了WRKY转录因子家族在牧草中的研究进展,指出深入研究野生植物体内WRKY转录因子的调控机理,可能会为我们探索WRKY转录因子调控功能提供新的视角.本文为深入研究WRKY转录因子家族的调控机理,及其在牧草中发挥的生物学功能奠定理论基础和提供研究思路.     

WRKY转录因子家族在植物响应逆境胁迫中的功能及应用

WRKY转录因子家族是植物体内最大的转录因子超家族之一,广泛分布在多种植物中。WRKY转录因子家族因具有高度保守的WRKY结构域而得名,它可以结合靶基因启动子W-box顺式作用元件,从而调控多种类型靶基因的表达,在植物响应生物及非生物胁迫(盐胁迫、干旱胁迫、氧化胁迫等)过程中起到重要的调控作用。本文介绍了WRKY转录因子家族的分子结构特征及作用机制,分析了其在植物响应生物和非生物胁迫过程中的生物学功能及分子调控机理,总结了WRKY转录因子家族在牧草中的研究进展,指出深入研究野生植物体内WRKY转录因子的调控机理,可能会为我们探索WRKY转录因子调控功能提供新的视角。本文为深入研究WRKY转录因子家族的调控机理,及其在牧草中发挥的生物学功能奠定理论基础和提供研究思路。     

苜蓿全基因组WRKY转录因子基因的分析

蒺藜苜蓿的基因组较小,遗传转化相对容易,是国际上广泛用于研究豆科植物的模式植物,其全基因组测序已经完成。WRKY转录因子是近年来在植物中发现的N-端含有WRKYGQK高度保守氨基酸序列的新型转录调控因子, 调节启动子中含W-box元件的调节基因和(/或)功能基因的表达, 从而参与植物的各种防卫反应。本研究以苜蓿基因组序列(Mt2.0)为材料,利用生物信息学方法分析苜蓿全基因组WRKY转录因子基因的数目、种类、系统发生学、保守基序,结果表明,苜蓿中共有28个WRKY基因,其中5个基因含有2个WRKY结构域,共含有33个WRKY结构域,根据其结构域特点可以分为3个大类,同时与水稻WRKY基因进行了比较研究,发现基因数目远少于拟南芥和水稻,同时研究证实苜蓿与水稻WRKY基因的起源和进化关系存在较大差异,显示出苜蓿WRKY进化有其独特的特点,此外分析苜蓿WRKY基因的保守motif共有46个,筛选得到WRKY结构域的5个保守motif。该研究对苜蓿WRKY基因功能的研究及进化具有重要的意义。     

紫花苜蓿MsMBF 1c基因在拟南芥中 表达提高转基因植株的耐热性

高温能危害植物的生长发育,是限制紫花苜蓿在南方地区推广的主要非生物胁迫因素之一。从“中苜1号”紫花苜蓿品种克隆获得紫花苜蓿多桥蛋白1c(Medicago sativa Multi protein Bridging Factors 1c, MsMBF1c)全长编码序列,发现紫花苜蓿MsMBF1c蛋白与拟南芥AtMBF1c蛋白同源相似性高达72%。分析MsMBF1c在根、茎、叶、花和果实等不同组织中,以及在高温、干旱以及高温和干旱组合胁迫条件下的表达模式,发现该基因在不同组织中的表达强度依次为花>根>叶>茎>果实;MsMBF1c显著受高温、干旱以及高温和干旱组合诱导,分别被上调4.21、2.15和4.59倍。构建pBI121-35S: MsMBF1c过量表达载体并转入模式植物拟南芥(wild type, WT),在T₃代获得卡那抗性不分离的过量表达株系(over expression, OE);利用OE与Atmbf1c突变体(mutant, MUT)杂交的方法获得互补株系(complementary, COM),并通过PCR与qRT-PCR的方法进行分子和表达验证。平行比较OE、COM、MUT以及WT等不同拟南芥株系在高温胁迫后的种子发芽率和幼苗存活率,在正常情况下,OE、COM、MUT以及WT拟南芥株系种子的发芽率没有显著差异(97.6%~100.0%),高温胁迫后,WT发芽率下降到71.7%,MUT发芽率下降到66.0%,显著低于WT(P<0.05);而COM与3个独立的OE株系的发芽率达79.3%~87.0%,显著高于WT(P<0.05)。在幼苗耐热试验中,OE、COM、MUT以及WT株系的存活率在正常条件下差异不显著,高温胁迫后,WT幼苗存活率下降到16.7%,MUT下降到10.0%,显著低于WT(P<0.05);而COM与3个独立的OE株系存活率下降到40.0%~76.7%,显著高于WT(P<0.05)。利用real-time PCR方法,分析HSFA1a、HSFA2、HSFA3、HSFB1、WRKY25、WRKY18、DREB2a等耐热调节关键基因在OE、MUT和WT拟南芥株系的相对表达情况,在正常条件下,HSFA2、WRKY18与DREB2a在MUT株系中的表达显著低于WT(0.33~0.47)。而在OE株系中,除HSFA1a外,HSFA2、HSFA3、HSFB1、WRKY25、WRKY18、DREB2a的表达相对WT株系都有不同程度上调,幅度为1.74~3.80。高温胁迫后,与WT相比,HSFA2、HSFA3、HSFB1、WRKY18与DREB2a在MUT株系中的表达中被显著下调,在OE株系中,只有WRKY18显著高于WT外,其余基因的表达在OE与WT株系中差异不显著。综合分析,MsMBF1c是一个功能比较保守的耐热调节基因,过量表达MsMBF1c能够互补拟南芥mbf1c突变体耐热缺失表型,并能够增强拟南芥在种子萌发与幼苗生长阶段的耐热性。MsMBF1c可能与AtMBF1c一样,与其他耐热调节关键基因互作调节植物耐热性。     

藜麦WRKY基因的进化与多胁迫条件下的转录应答

WRKY转录因子参与调控植物生长发育和多种胁迫应答,是一类非常重要的植物转录因子。为解析藜麦WRKY基因的进化特征及挖掘响应胁迫的WRKY基因,本研究利用系统的生物信息学方法在全基因组水平对WRKY基因进行了鉴定,并对其染色体定位、分组、系统进化、共线性分析以及多胁迫条件下的表达模式进行了分析。藜麦基因组中鉴定得到90个WRKY基因;划分为3组：Ⅰ组（18个）、Ⅱ组（46个）和Ⅲ组（12个）,其中Ⅱ组成员进一步被划分为5个亚组：Ⅱ-a（9个）,Ⅱ-b（4个）,Ⅱ-c（13个）,Ⅱ-d（10个）和Ⅱ-e（10个）。另外,14个WRKY成员因为WRKYGQK短肽的缺失,以及锌指结构变异较大而未划分到任何分组。本研究分组与藜麦WRKY基因进化树中家族成员的聚类结果完全一致,进一步支持了成员分组的可靠性。此外,不同分组的WRKY成员的蛋白序列呈现出小组特异的氨基酸保守域组成。藜麦和祖先二倍体苍白茎藜、瑞典藜的同源基因组模块分析表明,藜麦WRKY基因数目的增加主要来自全基因组倍增。在干旱、高温、盐、低磷胁迫和花生褪绿扇形斑病毒（GCFSV）侵染下,大量WRKY基因的表达水平被显著性诱导或抑制,说明这些WRKY基因很可能参与了调控藜麦的逆境应答反应。研究结果可为藜麦的抗逆研究提供优良的候选WRKY基因,为藜麦的抗逆研究提供参考依据。     

全基因组水平蒺藜苜蓿CPP基因家族的鉴定及表达模式分析

CPP （cysteine-rich polycomb-like protein）基因家族是一类小转录因子，广泛存在于除酵母与原核生物外的各种生物体中，在植物生长发育及响应胁迫过程中具有重要作用。截至目前，CPP基因家族已在多个物种中被鉴定和研究，但在豆科模式植物蒺藜苜蓿中还未见报道。本研究采用生物信息学的方法，在蒺藜苜蓿中共鉴定出9个CPP基因。通过与3个物种CPP基因的蛋白序列构建系统发育树，将CPP基因分为3类，MtCPP成员与大豆的亲缘关系更接近。保守结构域分析表明MtCPP转录因子都具有1~2个CXC保守结构域。染色体定位分析得出，9个CPP基因分布在6条染色体上，并鉴定出2对旁系同源基因，均来源于片段重复事件。通过基因芯片技术检测MtCPP基因的表达模式结果显示，MtCPP基因的表达具有一定的时空特异性。MtCPP基因启动子中含有大量与激素以及胁迫相关的顺式作用元件，并且MtCPP2、MtCPP5、MtCPP6和MtCPP7基因具有响应干旱的表达特征，MtCPP2和MtCPP8基因具有响应盐胁迫的功能。该研究可为后期深入解析MtCPP基因家族功能和筛选参与苜蓿抗逆的MtCPP基因奠定基础。     

植物miR156及靶基因SPL家族的研究进展

SPL(SQUAMOSA promoter binding protein-like)是绿色植物所特有的一类转录因子,其部分家族成员含有miR156结合位点,在转录水平上受miR156负调控.在拟南芥(Arabidopsis thaliana)、水稻(Oryza sativa)等模式植物中,miR156-SPL不仅参与植物的开花调控,同时具有介导植物生育阶段转变、调节植物次生代谢、参与植物光信号转导和胁迫响应等作用.随着生物技术的发展,关于植物中miR156-SPL的研究越来越多,本研究重点阐述miR156-SPL模块在调控植物开花、株型结构、果实发育、胁迫响应等方面的作用及其机制,为进一步探索miR156-SPL模块在草类植物中的功能奠定基础.     

白羊草NAC转录因子家族生物信息学分析

NAC转录因子家族是植物特有的一类重要转录因子,广泛参与植物生长、发育以及器官的建成、逆境胁迫应答等过程。为进一步研究白羊草（Bothriochloa ischaemum） NAC转录因子家族,本研究利用生物信息学方法对白羊草NAC基因所编码的蛋白理化性质、二级结构、保守基序、亚细胞定位、潜在磷酸化位点及系统进化关系进行了分析。结果显示,具有NAC结构域的21条白羊草氨基酸序列共分为10个亚家族,蛋白二级结构以无规则卷曲为主要组成部分,含有5个保守基序,大多数NAC蛋白定位于细胞核,均含有潜在的丝氨酸（Ser）、苏氨酸（Thr）、和酪氨酸（Tyr）磷酸化位点。本研究将为白羊草NAC基因家族的进一步功能分析奠定重要的研究基础。