基于RNA-Seq分析褪黑激素对绒山羊皮肤基因表达的影响

为了研究褪黑激素（melatonin,MT）对绒山羊皮肤毛囊基因表达的影响,筛选与皮肤毛囊发育相关的重要基因．选取处于皮肤毛囊发育生长起始点（5月）的内蒙古绒山羊罕山型个体6只,分别作为埋植组（皮下埋植MT,n=3）和对照组（不埋植MT,n=3）,以绒山羊个体皮肤组织为试验材料,对其进行RNA—Seq测序,利用生物信息学方法对转录组数据进行分析．在测序数据质量控制的基础上,对差异表达基因进行筛选、功能注释和富集分析。结果表明,共筛选获得了462个在埋植组与对照组中差异表达的基因,其中,上调表达208个,下调表达254个;KEGG富集性分析表明差异表达基因主要参与：代谢途径、不饱和脂肪酸生物合成、脂肪酸代谢、癌症信号通路、鳞状细胞癌信号通路、黑色素合成、Wnt信号通路以及补体和凝血级联反应等,Wnt信号可能在褪黑激素调控皮肤毛囊发育中发挥重要作用．、研究结果为进一步阐明褪黑激素影响毛囊生长的分子机理提供了依据。     

外源褪黑激素（MT）对内蒙古绒山羊皮肤中BMP2基因表达的影响

研究旨在检测骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein2,BMP2）基因在内蒙古绒山羊皮肤毛囊发育一个完整周期内的表达规律及体内埋植褪黑激素（Melatonin,MT）后对其表达的影响。选取背景相同的内蒙古绒山羊成年母羊8只,随机分为4组,其中1～3组为埋植MT的试验组,第4组为不埋植MT的对照组,采集12个月的体侧部皮肤样品,通过实时定量PCR法检测BMP2基因在发育毛囊周期内的表达量。结果表明,在毛囊发育兴盛期和休止期,BMP2基因的表达量呈缓慢增加。且休止期的表达量高于生长期的表达量;埋植MT后降低了该基因在休止期的表达量,且在整个生长周期内表达量差异不显著。内蒙古绒山羊皮肤中BMP2基因的表达量与毛囊周期性生长密切相关,埋植MT后改变了BMP2基因在毛囊生长周期过程中的表达模式,推测该基因参与调节内蒙古绒山羊皮肤毛囊生长发育。     

Wnt10b参与外源褪黑激素促进绒山羊绒毛生长的研究

本实验旨在研究Wnt10b在内蒙古成年绒山羊皮肤中的表达变化规律和褪黑激素(MT)对其表达量的影响。每隔1个月按照2 mg/kg BW的剂量在受试内蒙古成年绒山羊耳后皮下埋植MT。连续采集12个月(从2009年8月到2010年7月)的肩胛部皮肤样品,应用实时荧光定量PCR技术检测Wnt10b的表达量。结果表明:Wnt10b在内蒙古成年绒山羊皮肤组织中毛囊生长中期和休止前期高表达;埋植MT提高了Wnt10b在内蒙古成年绒山羊皮肤组织中毛囊休止期和退行期的表达量。结果提示,Wnt10b参与内蒙古绒山羊毛囊生长的信号传递过程,并在退行期和休止期转变过程中发挥作用;Wnt10b参与了外源MT促绒毛生长的毛囊周期性变化过程。     

外源褪黑激素对罕山白绒山羊皮肤绒毛周期性变化规律的影响

试验旨在分析外源褪黑激素(Melatonin,MT)对绒山羊绒毛生长特性与皮肤毛囊组织周期性变化规律的影响。选择10只体重和产绒量相当的罕山白绒山羊周岁母羊为试验动物,分为两组,每隔1个月按照2 mg·kg~(-1) BW的剂量在埋植组绒山羊耳后皮下埋植MT。连续采集13个月(从2014年12月到2015年12月)的肩胛部皮肤和绒毛样品,每月测定其绒毛长度,并制作皮肤毛囊组织切片。结果表明,埋植MT使绒山羊体表常年有绒毛覆盖,春季和秋季出现脱绒现象,之后快速长出新绒毛,绒毛脱落时次级毛囊活性降低。表皮的角质层厚度在毛囊生长前期随着绒毛的生长逐渐变薄,而在毛囊生长后期逐渐变厚,毛囊进入休止期时其厚度达最高点;与表皮其它三层的变化趋势正好相反。研究结果提示,12月开始持续埋植MT将缩短绒毛生长周期,其表皮及次级毛囊活性也会随之出现周期性变化。     

外源褪黑激素促进绒山羊皮肤毛囊相关基因表达差异的研究

旨在通过对非长绒期阿尔巴斯型绒山羊进行褪黑激素埋植,研究褪黑激素对羊绒周期性生长的调控,以期借此延长绒山羊毛囊的兴盛期,提高羊绒产量。将试验羊随机分成两组:埋植褪黑激素的试验组(T)和对照组(C),每组3只(试验组(TI、T2和T3)和对照组(C1、C2和C3)),采集绒山羊的皮肤组织进行组织切片,染色观察埋植褪黑激素对毛囊生长诱导作用。分别抽提两组样本总RNA,逆转录合成相应被标记的cDNA探针,采用Agilent绵羊的8×15K规格全基因组表达谱芯片进行杂交,筛选差异表达基因。利用实时荧光定量PCR技术进行验证。结果表明,从组织学分析可观察到埋植褪黑激素对毛囊生长具有明显的促进作用;芯片数据显示,筛选出差异表达的基因95个,其中61个表达上调、34个下调。GO分析基因数量分布情况:参与分子功能的基因占47.78%,参与生物学过程的基因占33.89%,组成细胞成分的基因占18.33%。与对照组的样本相比,埋植褪黑激素后相关基因的差异性表达涉及毛囊生长及周围皮肤附属物形态发生等生物学过程。这些差异性表达的基因为绒山羊毛囊生长及周期性调控的基因功能研究提供极有价值的参考。     

褪黑激素对内蒙古绒山羊皮肤中let-7家族及其靶基因的影响

旨在探索褪黑激素(melatonin, MT)对let-7家族成员及其靶基因在内蒙古绒山羊皮肤周期性表达的影响。本研究选取内蒙古绒山羊罕山型个体6只,分为埋植组(皮下埋植MT,n=3)和对照组(不埋植MT,n=3),连续12个月采集绒山羊个体皮肤组织为试验材料,利用qRT-PCR技术检测皮肤组织中11个let-7家族成员的表达变化,结合RNA-Seq技术分析let-7家族靶基因的表达变化。结果表明:1)在整个皮肤毛囊周期内,MT上调let-7b、let-7e、let-7a-3p的表达,下调let-7f、let-7g、let-7c、let-7a-5p、let-7d、miR-98的表达。2)在4月份,MT上调"let-7g、let-7i、miR-98"的表达,下调PTGS2、PLCG1等靶基因的表达;下调"let-7a-5p、let-7b、let-7c"的表达,上调TGIF2、RBL1等靶基因的表达。3)在6月份,MT下调"let-7g、let-7i、miR-98"的表达,上调PTGS2、PLCG1、SRC等靶基因的表达;上调"let-7a-5p、let-7b、let-7c"的表达,下调GDF5、TGIF2、RBL1等靶基因的表达。4)let-7家族成员的靶基因主要参与VEGF、TGF-β、Oxytocin和NF-kappa B信号通路,在细胞过程、激素调节和转录因子调控方面发挥重要作用。综上表明,MT可能通过改变let-7家族重要成员的表达水平,影响相应靶基因的表达,进而在皮肤毛囊的周期性生长过程中发挥重要作用,研究结果为进一步揭示MT介导miRNAs影响羊绒生长的分子机理提供了理论依据。     

持续埋植褪黑激素对SOX21基因表达影响研究

试验通过对内蒙古绒山羊采用持续埋植两年褪黑激素和提取皮肤总RNA后,进行Real-time PCR扩增,并研究了褪黑激素(melatonin,MT)对绒相关基因SOX21在皮肤中表达的影响。以GAPDH基因为看家基因对荧光定量获得的相对定量的数据进行校正,数据经2-△△Ct法分析,结果发现:①SOX21基因在不同个体中的表达趋势是相对稳定的,不受个体差异的影响。②褪黑激素对一年中SOX21基因在内蒙古白绒山羊皮肤中表达的影响除3、4、5月份外其他月份均有显著的影响。③持续埋植两年稳定了褪黑激素对SOX21基因在绒山羊皮肤中表达的影响,降低了绒山羊对褪黑激素的应激反应。④SOX21基因在毛囊休止期表达明显下调,可能与脱绒相关。     

催乳素受体基因mRNA表达与山羊绒毛生长关系的研究

为探讨绒山羊皮肤组织中催乳素受体(prolactin receptor,PRLR)基因mRNA表达水平与绒山羊绒毛生长的关系,通过埋植褪黑激素(me-latonin,MT)刺激绒毛提前生长,利用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)技术检测绒山羊从绒毛开始萌发到绒毛快速生长期间皮肤组织中PRLR基因mRNA表达量的变化。结果显示:在内蒙古白绒山羊皮肤中总的催乳素受体(T-PRLR)基因mRNA表达量从6至11月逐渐降低,而MT埋植组的短型催乳素受体(S-PRLR)mRNA表达水平在绒毛快速生长的7、8、9月份显著高于对照组(P<0.05)。结果表明,山羊绒毛生长可能与S-PRLR mRNA表达水平升高有直接的关系。     

皮下埋植褪黑激素对陇东绒山羊皮肤毛囊生长发育的影响

休绒期及绒生长期对陇东绒山羊母羊皮下埋植褪黑激素（MT）颗粒埋植剂,分别在缓释期内的每月中旬切取皮肤样品,实验室制作切片、观测研究。结果表明：毛囊直径、毛囊深度、毛囊密度、S/P与对照组差异均不显著（P〉0.05）;毛囊活率试验组高于对照组（P〈0.05）,高水平MT组略高于低水平组（P〉0.05）。外源MT可提高绒山羊产绒量是因为提前并持续激活次级毛囊生长发育,延长了绒生长期,增加了羊绒长度与数量。     

绒山羊次级毛囊生长调控基因的筛选

旨在筛选绒山羊次级毛囊生长调控基因。本研究以遗传背景相似,有次级毛囊的绒山羊和无次级毛囊的奶山羊为试验动物,利用Illumina Hiseq2000对4只绒山羊与4只奶山羊3、6、9、12月的32个皮肤样品进行RNASeq测序。测序共获得38G数据,共筛选出20 780个基因。差异表达基因分析表明,绒山羊与奶山羊之间在不同时期共有2 409个差异表达基因,其中上调差异表达基因1 175个,下调差异表达基因1 234个,绒山羊之间在不同生长时期差异表达基因共550个,其中上调差异表达基因302个,下调差异表达基因248个。GO功能注释分类显示,差异表达基因主要在细胞与细胞部分、细胞器部分、结合、催化、生物调控、细胞过程、代谢过程等功能富集。KEGG pathway分析发现,42个差异表达基因富集在与毛囊生长相关的WNT、SHH、TGFβ、TNF、MAPK和Notch信号通路中,由此推测其可能为次级毛囊生长相关基因。本研究为深入开展次级毛囊生长相关基因功能验证提供丰富的资源,为揭示次级毛囊生长调控机制提供重要基础,为绒毛产量及品质的提升提供理论依据。     

Genome-wide Selection Signals Reveal Candidate Genes Associated with the Cashmere Traits of Cashmere Goats

The purpose of this study was to screen the genome-wide selection signals of Liaoning cashmere goat and Inner Mongolia cashmere goat. Based on the Illumina Caprine 50K SNP chip, Liaoning cashmere goat, Inner Mongolia cashmere goat and Huanghuai goat were genotyped, and the common 50 010 SNPs were obtained after quality control. Using population differentiation coefficients Fst and XP-EHH, Huanghuai goats were used as reference populations to detect selection signals for Inner Mongolia cashmere goats and Liaoning cashmere goats. The top 5% of Fst and XP-EHH values was used as the threshold. The result showed that 501 candidate genes were selected by Fst and 145 candidate genes were selected by XP-EHH in cashmere goats. Based on these SNPs, we detected 12 SNPs under strong selection by Fst and XP-EHH. After gene annotation, 21 candidate genes were identified, such as EXOC4, ASIC2, PCDH9, RHBDD1, IRS1 and PDE10A. These genes were found to be mainly enriched in PI3K-Akt signaling pathway, protein digestion and absorption and relaxin signaling pathways. The study indicated that genes associated with cashmere traits were subjected to strong artificial selection pressure during domestication of the cashmere goats. These findings also help us better understand the selection progress of cashmere goats and provide a new theoretical basis for the protection and utilization of germplasm resources of Chinese cashmere goat breeds.     

全基因组选择信号揭示绒山羊绒毛性状相关的候选基因

旨在对辽宁绒山羊和内蒙古绒山羊的基因组选择信号进行筛选。本研究利用Illumina 50K的山羊芯片，对内蒙古绒山羊、辽宁绒山羊和黄淮山羊进行基因型检测，质控后获得50 010个共同SNPs位点。通过群体分化系数Fst和XP-EHH，以黄淮山羊为参考群体分别对内蒙古绒山羊和辽宁绒山羊进行选择信号检测，Fst和XP-EHH值的top 5%作为阈值。结果，利用Fst在绒山羊基因组中筛选到501个候选基因，利用XP-EHH在绒山羊基因组中筛选到145个候选基因。其中有12个SNPs在绒山羊基因组中受到较强选择。通过基因注释筛选到21个候选基因，包括EXOC4、ASIC2、PCDH9、RHBDD1、IRS1和PDE10A等。这些基因主要富集在PI3K-Akt信号通路、蛋白质消化吸收和松弛素信号通路等。研究结果发现，绒山羊在驯化过程中其基因组很多与毛囊相关的基因受到了强烈的选择。这些发现也有助于更好地了解绒山羊的选择进展，为中国绒山羊品种的种质资源保护和利用提供重要参考。     

阿尔巴斯绒山羊产绒量性状相关基因挖掘的研究

绒山羊产绒量主要由遗传决定,产绒量低是制约绒山羊产业化发展的瓶颈。在同一群体中选择高产绒量(>1 000 g)和低产绒量(<480 g)的山羊母羊各3只,其年龄均为3周岁,体重约34 kg;每只实验羊全基因组测序深度为30×,每个样本大约测得8×10⁶ SNP。对比高产组和低产组,利用选择性消除区域基因分析方法筛选出18个基因组区域可能与产绒量相关,从这些区域中筛选出选择信号较强的4个羊绒产量性状相关候选基因,分别是CUL1、FBXL3、YY1、EZH2,这些基因参与昼夜节律信号通路、Wnt/β-catenin信号通路和TGF-β信号通路,而这3个信号通路正是参与绒山羊次级毛囊发育的重要信号通路。研究结果表明,以上4个基因和相应的SNP可以作为高产绒量绒山羊的基因组辅助育种标记,有助于缩短高产绒量绒山羊品种选育进程。     

饲喂PRL抑制剂对燕山绒山羊毛囊发育的影响

旨在研究绒山羊毛囊生长期饲喂催乳素（PRL）抑制剂对毛囊发育的影响。本研究选择3月龄体重相近（（23.01±4.82） kg）、健康良好的燕山绒山羊公羊20只,随机分为两组,每组10只,分别为对照组和试验组,试验组饲喂PRL抑制剂（0.06 mg·kg^-1）,试验期90 d。试验结束时采集羊绒纤维、血液和皮肤样品,分析饲喂PRL抑制剂对山羊绒长度、细度、血液指标、毛囊性状及皮肤组织PRL、MTNR1a和RORα mRNA表达水平的影响。结果表明,饲喂PRL抑制剂显著提高了绒山羊初级毛囊数量、次级毛囊数量和S/P值（P<0.05）,并显著提高了活性初级毛囊占比和活性次级毛囊占比（P<0.05）,对山羊绒伸直长度和细度无显著影响（P>0.05）。饲喂PRL抑制剂3个月对绒山羊血清中PRL、MT、IGF-1、COR、GH、T₄和T₃均无显著影响（P>0.05）,但显著降低了皮肤中PRL和MTNR1a mRNA表达水平（P<0.05）,对RORα mRNA表达量无显著影响（P>0.05）。综上,在绒山羊毛囊生长期抑制PRL分泌可能是通过降低皮肤中PRL和MTNR1a基因的表达来促进毛囊发育。     

绒山羊皮肤毛囊兴盛前期组织形态、chi-miR-107-3p与RHBDF2基因表达分析

为了探究chi-miR-107-3p和菱形家族蛋白2（rhomboid family member 2,RHBDF2）基因在不同品种（系）和光控增绒绒山羊兴盛前期（5~7月份）皮肤毛囊重建时的表达差异,本试验在7月份采集内蒙古阿拉善型绒山羊、敏盖绒山羊和光控增绒技术处理的阿尔巴斯型绒山羊体侧皮肤毛囊组织,采用组织切片技术对组织形态比较分析,实时荧光定量PCR法检测chi-miR-107-3p和RHBDF2基因的表达量。结果显示,在皮肤毛囊兴盛前期,阿拉善型绒山羊次级毛囊正处于重建阶段,敏盖绒山羊和阿尔巴斯型绒山羊（光控增绒）次级毛囊重建已基本完成;在阿拉善型绒山羊皮肤组织中chi-miR-107-3p表达量极显著高于敏盖绒山羊和阿尔巴斯型绒山羊（光控增绒）（P<0.01）,而RHBDF2基因表达量极显著低于其他两品种（系）（P<0.01）,且RHBDF2基因表达量在敏盖绒山羊皮肤组织中显著低于阿尔巴斯型绒山羊（P<0.05）。不同品种（系）和光控增绒绒山羊皮肤毛囊兴盛前期组织显微结构与chi-miR-107-3p、RHBDF2基因在皮肤组织中的表达差异分析结果相一致,次级毛囊重建初期chi-miR-107-3p表达量较高,而RHBDF2基因表达量极低,随着次级毛囊重建完成,chi-miR-107-3p表达量明显降低,RHBDF2基因表达量逐渐增高,且在不同品种（系）内蒙古绒山羊绒毛生长发育过程中的表达机制基本相同。因此,chi-miR-107-3p和RHBDF2基因是绒山羊皮肤毛囊生长发育的重要调控因子。     

绒山羊次级毛囊基因表达滞后性的转录组分析

毛囊是具有高度的自我更新能力、独特的可再生器官,其周期性变化是一个动态过程,为了研究毛囊差异基因表达变化情况,文章以内蒙古绒山羊生长期毛囊为研究对象,利用Illumina高通量测序技术方法,检测6~10月皮肤毛囊差异基因表达变化情况,寻找对绒毛生长及质量具有调控作用的特异表达基因。试验发现,多数差异基因分别在初级毛囊（PF）的7、8月份和次级毛囊的（SF）8、9月份表达;在绒毛生长期的相邻月份中,发现FAM83C、LOC102185501、FYCO1、CTTNBP2NL、C6orf132、KRTAP29-1 和 CRYBG3 7个共同差异表达基因呈现相同的表达趋势,且在次级毛囊上的表达变化均比初级毛囊滞后1个月。综上所述,次级毛囊在基因表达调控中存在一定的滞后性,这将为绒毛周期生长发育和分子育种提供重要的理论基础。     

光周期对于绒山羊毛囊干细胞激活的影响

为了延长绒山羊毛囊兴盛期,提高羊绒产量,本试验通过人工缩短内蒙古阿尔巴斯型绒山羊的日照时间,利用组织切片技术对比人工短光照和自然光照周期下绒山羊皮肤组织形态变化,利用免疫组织化学方法研究毛囊细胞增殖及相关信号通路重要蛋白的表达。结果显示,人工短光照周期下绒山羊毛囊细胞增殖强烈,干细胞标记角蛋白15（cytokeratin 15,K15）阳性信号大量分布于外根鞘,β-catenin信号活跃表达于毛母质及根鞘,毛囊提前进入兴盛期;而自然光照周期下绒山羊毛囊仍停留在休止期,相应蛋白信号表达较弱。综上表明,短日照对毛囊生长具有明显的促进作用,人工短光照周期可以提前激活毛囊干细胞,使其提前进入兴盛期,引起多种毛囊生长相关蛋白的表达。     

Effects of Photoperiod on Stem Cells Activation in Cashmere Goat Hair Follicles

In order to extend the anagen of cashmere goat hair follicles and increase the production of cashmere,this study was performed with artificially shorten the daylight time among Arbas White cashmere goats. Skin tissue sections from cashmere goats were collected to compare the morphologic changes between artificial daylight and natural daylight,and immunohistochemical method was used to study the hair follicle cell proliferation and important protein expression in related signaling pathways. The results showed that strong cell proliferation occurred in cashmere goat hair follicle cells during artificial daylight,plenty of cytokeratin 15 (K15) positive signals were distributed in the outer root sheath,β-catenin protein was actively expressed in hair matrix and root sheath, indicating that the hair follicles were in the anagen growth phase;Meanwhile,cashmere goat hair follicles under natural daylight were in telogen with weak signals. Above all prove that short photoperiod played an important role in promoting hair follicle growth,the artificial short photoperiod could change hair follicle growth cycle and make hair follicles earlier enter to the anagen growth phase,causing a variety of typical gene expressions during hair follicle growth.