MSTN基因敲低绵羊成纤维细胞株的筛选

为了获得绵羊MSTN基因敲低成纤维细胞株,克隆获得MSTN基因序列构建其真核表达载体;设计合成并筛选3种MSTN基因干涉序列(M1、M2和M3),构建相应的3种RNA干涉载体;将MSTN基因真核表达载体单独或分别与3种RNA干涉载体共转染绵羊成纤维细胞后,分别检测其对MSTN基因表达的干涉效率以获得最佳的MSTN基因RNA干涉载体;将筛选的RNA干涉载体线性化后转染绵羊成纤维细胞,通过筛选获得转基因细胞株。结果显示,成功克隆得到与GenBank中序列同源性为100%的绵羊MSTN基因序列,并获得真核表达载体pcDNA3.1(+)-MSTN;构建获得MSTN基因RNA干涉载体pRNAT-M1、pRNAT-M2和pRNAT-M3;与单独转染pcDNA3.1(+)-MSTN后293GP细胞中MSTN基因的相对表达量相比,转染干涉载体后MSTN基因相对表达量明显下降,其中pRNAT-M1干涉效率最佳;将pRNAT-M1线性化后转染绵羊成纤维细胞并利用G418筛选获得转基因阳性细胞;获得的转基因阳性细胞的细胞形态、生物学特性均呈现正常;PCR检测结果显示,pRNAT-M1已整合到细胞基因组中。上述结果表明,成功获得了MSTN基因敲低的绵羊成纤维细胞株。     

HA基因真核表达载体构建及在293T细胞中的表达

目的:为后续进一步研究H1N1病毒DNA疫苗对小鼠免疫系统的影响提供技术支撑.方法:应用PCR方法体外扩增血凝素(HA)基因全序列,并利用pcDNA3.1(+)载体构建甲型流感病毒(H1N1)血凝素(HA)的真核表达质粒(pcDNA3.1(+)-HA),经双酶切鉴定后,转染293T细胞,通过RT-PCR和Western...     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP3/GP5/M真核表达载体的构建及其体液免疫应答

本试验旨在构建表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP3、GP5和M蛋白的真核重组质粒。以PRRSV LN株为模板,采用PCR方法扩增出GP3、GP5、M基因片段,将扩增的GP5、M通过Linker序列串联成GP5-M,然后将GP3与GP5-M双酶切后插入pcDNA3.1(+)构建重组质粒pcDNA3.1-GP3-GP5-M,将其转染COS7细胞。PCR鉴定表明重组质粒pcDNA3.1-GP3-GP5-M含有PRRSV GP3、GP5-M基因,间接免疫荧光检测表明GP3、GP5-M蛋白在COS7细胞内获得表达。Western blotting检测证实GP3、GP5、M蛋白获得正确表达,并且所表达的GP3、GP5、M蛋白是融合蛋白。将pcDNA3.1-GP3-GP5-M免疫BALB/c小鼠,首免后2周可检测到特异性PRRSV中和抗体,首免后8周中和抗体效价最高可达1∶32。进一步将pcDNA3.1-GP3-GP5-M免疫断奶仔猪,首免后4周即可产生1∶4～1∶8的中和抗体。本试验成功构建了表达PRRSV GP3、GP5和M融合蛋白的真核重组质粒pcDNA3.1-GP3-GP5-M,中和抗体检测表明pcDNA3.1-GP3-GP5-M具有良好的免疫原性,从而为PRRSV基因工程疫苗的研制奠定基础。     

鸡α-2,3-唾液酸转移酶Ⅰ基因的克隆和真核表达载体的构建

试验利用Trizol法从鸡肠道组织提取总RNA,采用特异性引物通过RT-PCR扩增出α-2,3-唾液酸转移酶Ⅰ(α-2,3-sialyltransferaseⅠ,ST3GALⅠ)基因的cDNA片段,并将其克隆至pGEM-T easy载体,获得阳性重组质粒,再以阳性重组质粒为模板亚克隆ST3GALⅠ基因的完整ORF区,定向插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)上,进行PCR、限制性酶切和DNA序列分析鉴定。结果表明,ST3GALⅠ基因全长1029 bp,测序结果同GenBank数据库收录的序列一致,无任何密码子缺失与突变,插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)上的目的基因大小方向均正确。本研究成功构建了pcDNA3.1(+)-ST3GALⅠ真核表达载体,为下一步的真核表达及对ST3GALⅠ基因的功能研究奠定了基础。     

GPMV F、HN及NP蛋白核酸疫苗的构建及体外表达的研究

为了更好地预防和控制严重威胁养禽业的鹅副黏病毒病,试验采用基因重组的方法,以F、HN和NP基因作为候选基因,真核表达载体pcDNA3.1(+)作为载体,构建含以上3种基因的DNA疫苗,并用构建的3种DNA疫苗转染293T细胞进行瞬时表达。结果表明:3种DNA疫苗质粒均能在体外获得表达,表达的蛋白可与抗GPMV抗体发生特异性结合,于荧光显微镜下可见黄绿色荧光,而真核表达载体pcDNA3.1(+)及未转染质粒的293T细胞均未见荧光出现,呈阴性反应。     

日本血吸虫促凋亡基因SjBAD真核表达及其功能研究

根据日本血吸虫促凋亡基因SjB AD的参考序列设计引物,应用PCR技术扩增SjB AD,选用pcD NA3.1(+)真核表达载体,构建pcDNA3.1(+)-SjB AD,并将其转染到293T细胞内,采用实时定量PCR检测SjB AD在转染入293T细胞培养不同时期后的转录水平;利用细胞流式术检测pcD NA3.1(+)-SjB AD转染入293T细胞后细胞的凋亡水平。结果:成功克隆、表达了日本血吸虫SjB AD基因,构建了真核重组表达质粒pcD NA3.1(+)-SjB AD,并将其转染入293T细胞内,利用实时定量PCR检测SjB AD在转染入293T细胞培养36h后转录水平最高。利用细胞流式术检测pcD NA3.1(+)-SjB AD转染入293T细胞后可以引起细胞凋亡。本文为研究线粒体细胞凋亡通路和血吸虫的生长发育奠定基础。     

布鲁氏菌16M BtpA和BtpB真核表达载体的构建及在293T细胞中的表达

为了构建布鲁氏菌16M BtpA和BtpB真核表达载体,便于深入研究其在布鲁氏菌逃逸宿主免疫机制中发挥的作用。根据GenBank公布的布鲁氏菌16M BtpA和BtpB序列设计了特异性引物,并提取布鲁氏菌16M总RNA,将其逆转录成cDNA为模板,进行了PCR扩增,获得BtpA和BtpB目的片段,连接至pMD18-T进行克隆纯化,再与pcDNA3.1载体进行连接,经PCR、酶切和测序分析等方法鉴定后,利用Lipofectamine~(TM)2000脂质体转染至293T细胞,Western blot检测BtpA和BtpB蛋白的表达。结果显示,PCR扩增出了873 bp的BtpA基因片段和924 bp的BtpB基因片段,依次连至克隆载体pMD18-T和真核表达载体pcDNA3.1,经限制酶EcoRⅠ和XbaⅠ酶切验证正确,测序分析显示与GenBank公布的序列信息完全一致;Western blot检测结果显示,pcDNA3.1-BtpA-HA和pcDNA3.1-BtpB-HA分别在32 ku和35 ku处出现了条带,与预期结果完全相符,说明能在293T细胞中表达。成功构建了pcDNA3.1-BtpA-HA和pcDNA3.1-BtpB-HA真核表达载体,并证实了其能在293T细胞中表达,为后续研究其作用与机制提供了材料。     

新型鸡白细胞介素15真核表达质粒构建及其体外表达

应用重叠扩增PCR(SOE PCR)技术将鸡白细胞介素15(ChIL-15)的冗长信号肽序列替换为较短的鸡白细胞介素2(ChIL-2)信号肽序列,构建了一种新型ChIL-15融合基因(NChIL-15).将其连接到克隆载体pMD18-T中得到重组克隆质粒pMD18T-NChIL-15.阳性克隆质粒经鉴定正确后将NChIL-15基因亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,得到重组阳性表达质粒pcDNA3.1(+)-NChIL- 15.阳性表达质粒经鉴定正确后应用磷酸钙法体外转染293T细胞,通过间接免疫荧光试验(IFA)检测到了NChIL-15蛋白在293T细胞中的表达.本研究为NChIL-15佐剂作用的深入研究奠定了基础.     

转肌细胞特异表达MSTN基因RNA干涉序列的小鼠成纤维细胞株的筛选

为了筛选肌细胞特异表达MSTN基因RNA干涉序列的小鼠成纤维细胞株,研究利用人工合成的小鼠肌肉启动子SP,连接前期工作中获得带有GFP基因的小鼠MSTN基因RNA干涉载体pR-NAT-M1,构建真核表达载体pRNAT-SP-M1,将pRNAT-SP-M1线性化后转染小鼠成纤维细胞并通过300μg/mL G418筛选获得转基因阳性细胞。结果表明:获得的转基因阳性细胞呈现正常的小鼠成纤维细胞的梭形,且在荧光显微镜下呈现出表达绿色荧光蛋白的绿色;转基因阳性细胞的生长曲线呈"S"形;转基因阳性细胞经冷冻复苏后,仍具有正常的细胞形态和增殖特性;PCR鉴定结果显示转基因阳性细胞基因组DNA中整合有pRNAT-SP-M1序列。说明成功获得了转肌细胞特异表达的MSTN基因RNA干涉序列小鼠成纤维细胞株。     

猪β_2肾上腺素能受体基因真核表达载体及突变体的构建及表达

试验旨在构建猪β_2肾上腺素能受体(β_2adrenergic receptor,β_2AR)基因及其突变体真核表达载体,并鉴定其在HEK293T细胞中的表达。通过猪基因组DNA克隆猪β_2AR基因,利用同源重组技术将其连接至真核表达载体pcDNA3.1(+),构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-β_2AR,加入c-myc标签后命名为myc-pcDNA3.1(+)-β_2AR。以真核表达载体为模板构建突变体myc-pcDNA3.1(+)-β_2AR-D130N、myc-pcDNA3.1(+)-β_2AR-C285S和mycpcDNA3.1(+)-β_2AR-D130N/C285S,并将构建的真核表达载体和突变体转染HEK293T细胞,利用Western blotting技术验证其表达。结果显示,猪β_2AR基因已正确重组入pcDNA3.1(+)载体中;经测序鉴定,猪β_2AR的第130位天冬氨酸成功突变为天冬酰胺,第285位半胱氨酸成功突变为丝氨酸。Western blotting检测结果证明所构建的表达载体均可在HEK293T细胞中表达。本研究成功构建了猪β_2AR野生型的真核表达载体及2个单点突变和1个双点突变的突变体,并验证其在HEK293T细胞中正常表达,为进一步研究猪β_2AR蛋白表达及其药理学活性奠定基础。     

猪生长激素促分泌素受体基因真核表达载体的构建及鉴定简

本试验旨在构建猪生长激素促分泌素受体（pGHS-R）真核表达系统,并瞬时转染人源胚胎肾细胞（HEK293T）观察其表达情况。以猪基因组为模板,通过剪接重叠延伸聚合酶链式反应（SOE-PCR）克隆出pGHS-R的编码区序列,插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)/pGHS-R,酶切鉴定并测序,加myc标签,瞬时转染HEK293T细胞,用Western blotting鉴定该重组质粒是否能在真核细胞中表达相应的目的蛋白。结果显示,本试验成功扩增出pGHS-R编码序列,酶切和测序结果表明pcDNA3.1(+)-myc/pGHS-R构建正确,Western blotting方法证实转染的该质粒能在HEK293T细胞中正确表达目的蛋白。结果表明,本试验成功构建了pGHS-R真核表达载体,并正确表达蛋白,为进一步研究GHS-R的功能奠定了基础。     

山羊生物钟基因CLOCK真核表达载体的构建和生物信息学分析

试验旨在构建山羊昼夜运动输出周期蛋白(circadian locomotor output cycles kaput,CLOCK)基因真核表达载体,系统分析山羊CLOCK蛋白的生物学特性。从山羊卵巢组织中提取总RNA,反转录成cDNA后经PCR扩增山羊CLOCK基因CDS区序列,并以同源重组的方式将其连接至pcDNA3.1-Puro-N-3HA载体;经PCR、酶切和测序鉴定后,将阳性质粒命名为pcDNA3.1-3HA-gCLOCK;将pcDNA3.1-Puro-N-3HA和pcDNA3.1-3HA-gCLOCK质粒分别转染至HEK293T细胞中,通过实时荧光定量PCR和Western blotting检测山羊CLOCK基因的表达效果,并对山羊CLOCK基因进行系统的生物信息学分析。结果显示,山羊CLOCK基因CDS区片段长2 538 bp,将其与线性化的pcDNA3.1-Puro-N-3HA载体重组连接并通过酶切和测序鉴定后,成功构建了pcDNA3.1-3HA-gCLOCK真核表达载体;实时荧光定量PCR和Western blotting检测结果显示,pcDNA3.1-3HA-gCLOCK转染组CLOCK基因在mRNA和蛋白水平的表达量均极显著高于pcDNA3.1-Puro-N-3HA对照组(P<0.01)。生物信息学分析结果表明,山羊CLOCK基因CDS区序列与绵羊、牛和马的相似性分别为99.4%、98.7%和95.6%。山羊CLOCK蛋白是一种不稳定蛋白,具有一定的亲水性,无跨膜区和信号肽。二级结构由α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲组成;三级结构与小鼠和人的CLOCK蛋白相比具有极高的相似性。本研究成功构建了山羊生物钟基因CLOCK真核表达载体,并进行了生物信息学分析,为进一步研究山羊CLOCK基因的生物学功能及山羊生物钟的转录调控机制提供了材料。     

大肠杆菌植酸酶appA2基因真核表达载体的构建及在细胞中的表达

根据已经公布的植酸酶appA2基因序列,设计合成了1对特异性引物,应用RT-PCR技术从大肠杆菌中扩增得到植酸酶appA2基因,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建了重组真核表达质粒pcDNA-appA2,对重组表达质粒鉴定正确后,转染猪PK15细胞,经G418筛选后,通过实时荧光定量PCR检测细胞内appA2表达,同时测定细胞内植酸酶的活性,检测结果表明,本试验成功构建了pcDNA-appA2重组真核表达载体,转染细胞后appA2的表达量是对照组的1 686.55倍,同时具有较好的植酸酶活性,为通过生物反应器制备植酸酶研究奠定了基础。     

牛副流感病毒3型核衣壳蛋白基因的真核表达

根据牛副流感病毒3型(BPIV-3)内蒙09株(NM09)全基因组序列(GenBank登录号:JQ063064)设计特异性引物,利用RT-PCR方法扩增出牛副流感病毒3型分离株的核衣壳蛋白(N)基因,通过NheI和NotI限制性内切酶位点亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1/Zeo(+),获得真核重组质粒pcDNA3.1-N。采用Superfect转染试剂将重组质粒转染至BSR细胞中,转染后的BSR细胞经间接免疫荧光试验和RT-PCR方法检测,重组质粒pcDNA3.1-N在BSR细胞中能正确表达N蛋白。本研究结果为BPIV-3新型疫苗的研制奠定基础。     

人血小板生成素基因的克隆及CHO稳定细胞系的建立

 以人肝cDNA为模板克隆了人血小板生成素（Human Thrombopoietin,hTPO）基因,利用基因重组技术构建了带有新霉素抗性基因（neo）筛选标记的pcDNA3.1(+)-hTPO真核表达载体,将重组质粒瞬时转染293T细胞,用鼠抗人TPO 单抗Western blot 检测 TPO蛋白的瞬时表达;再将重组质粒转染中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary,CHO),应用400 μg/mL的G418筛选克隆,经PCR及Western blot验证,获得了3株hTPO蛋白表达水平不同的CHO细胞系,为获得大量蛋白并进行活性功能试验及临床应用奠定基础。     

湖羊MyoG基因CDS的克隆及其真核表达载体的构建

参阅GenBank发表的波尔山羊肌细胞生成素(MyoG)基因序列,设计3对具有互补末端的特异性引物,分别扩增出湖羊MyoG基因的3个外显子,利用重叠PCR技术,将此3个外显子连接,并构建成重组质粒pcDNA3.0-MyoG,转染NIH-3T3细胞,RT-PCR鉴定。结果表明:成功克隆了湖羊MyoG基因的CDS,在离体细胞中MyoG基因发生了转录,这为进一步研究MyoG基因的体内外表达及生物学的活性奠定了基础。     

奶牛NR1D1基因的真核表达载体构建、表达谱及其在卵巢组织的定位

旨在克隆奶牛核受体亚家族1 D组成员1(nuclear receptor subfamily 1 group D member 1,NR1D1)基因的蛋白编码序列(coding sequence, CDS),构建其真核表达载体，预测分析NR1D1基因的生物学功能，并检测该基因的组织表达谱及其在卵巢组织的表达分布。本研究以5头健康的24月龄雌性奶牛为试验动物，PCR扩增带有同源臂的奶牛NR1D1基因CDS区全长片段，利用同源重组法将目的片段连接至线性化的pcDNA3.1-Puro-N-3HA空载体，构建重组质粒，利用酶切、PCR及测序对重组质粒进行鉴定。结合质粒测序结果，利用生物信息学软件预测分析该基因的生物学功能。将鉴定正确的质粒转染至HEK293T细胞，利用实时荧光定量PCR(qPCR)与Western blotting技术检测NR1D1基因在mRNA与蛋白水平的表达。此外，利用qPCR检测奶牛NR1D1基因的组织表达谱，并利用免疫组织化学技术检测NR1D1蛋白在奶牛卵巢组织的表达分布。结果，成功获得带有同源臂的奶牛NR1D1基因的CDS区全长片段(1 884 bp),酶切、PCR及...     

山羊RORα基因的克隆、表达载体构建及功能分析

旨在克隆山羊维甲酸相关孤儿受体α(RORα)基因并构建其真核表达载体,然后利用生物信息学工具系统分析RORα的生物学特性,最后对其在山羊生物钟系统中的作用机制进行初步探究。本研究以1只健康的12月龄雄性西农萨能奶山羊为试验动物,提取其肝组织总RNA,经逆转录PCR反转录为cDNA后,利用常规PCR扩增山羊RORα基因的编码区(coding sequence,CDS)片段,使用同源重组法将其与pcDNA3.1-Puro-N-3HA载体相连接; 重组载体经PCR、酶切和测序鉴定后,将阳性质粒命名为pcDNA3.1-3HA-gRORα; 将pcDNA3.1-Puro-N-3HA和pcDNA3.1-3HA-gRORα质粒分别转染至HEK293T细胞后,通过实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)和蛋白质免疫印迹(western blotting,WB)技术检测山羊RORα的表达; 同时利用ExPASy、ProtScale等软件对山羊RORα基因进行系统的生物信息学分析。另外,使用同源重组法分别构建含有山羊生物钟基因BMAL1和NR1D1启动子片段的pGL4.10-BMAL1-Promoter-Luc及pGL4.10-NR1D1-Promoter-Luc的荧光素酶报告质粒,并通过双荧光素酶报告试验探究山羊RORα蛋白调控BMAL1和NR1D1基因启动子转录活性的作用机制。PCR、酶切和测序鉴定结果表明,pcDNA3.1-3HA-gRORα重组质粒构建成功; qPCR和WB结果显示,pcDNA3.1-3HA-gRORα转染组RORα基因的mRNA表达水平和蛋白表达水平均显著高于pcDNA3.1-Puro-N-3HA转染组(P < 0.01)。生物信息学分析结果显示,山羊RORα基因CDS区序列与绵羊、牛和猪的相似性较高,分别为97.5%、97.1%和95.2%。山羊的RORα蛋白是一种亲水性蛋白。二级结构由α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲组成,有信号肽的概率较小,无跨膜区; 三级结构与小鼠和人的RORα蛋白差异性极小,三者具有高度相似性。此外,PCR、酶切和测序结果表明,pGL4.10-BMAL1-Promoter-Luc和pGL4.10-NR1D1-Promoter-Luc重组质粒构建成功。双荧光素酶报告试验结果表明,山羊RORα蛋白可以显著上调山羊BMAL1和NR1D1基因启动子的转录活性。本研究成功构建了山羊RORα基因的真核表达载体,并证明了RORα蛋白可以正向调控山羊BMAL1和NR1D1基因的启动子活性,这为进一步探究山羊核受体RORα的功能及山羊生物钟的转录调控机制提供了前期基础。