鸡源致病性大肠杆菌iss基因原核表达产物的免疫保护作用

本试验以鸡E.coli强致病力菌株HO2的iss基因原核表达产物GST-Iss融合蛋白,免疫SPF鸡获得抗血清。分别检测菌株HO2在抗血清及正常血清中的存活状况,通过比较两者差别,探讨iss基因原核表达产物的免疫保护作用。结果显示,所获鸡大肠杆菌iss基因原核表达产物的抗血清能够减弱菌株的血清抗性,对鸡E.coli强致病力菌株HO2有抑制增殖或杀灭的作用。     

Iss蛋白在鸡源大肠杆菌不同毒力菌株中的检测

本试验以鸡源大肠杆菌O2血清型iss基因原核表达产物GST-Iss融合蛋白免疫SPF鸡,获得抗血清。采用间接ELISA法检测Iss蛋白在几种毒力强弱程度不同的鸡源大肠杆菌菌株中的表达情况,并通过检测菌株在血清中的存活状况,研究Iss蛋白与抗补体功能(血清抗性)及致病力的关系。结果表明,鸡源大肠杆菌Iss蛋白与菌株的血清抗性及菌株的致病力有相关性。     

河北禽源致病性大肠杆菌耐药性、毒力基因及超广谱β-内酰胺酶分析

以83株鸡源大肠杆菌河北省分离株为研究对象,通过药敏试验和PCR方法测定其毒力基因及超广谱β-内酰胺酶(Extended-spectrumβ-lactamase,ESBLs)基因的分布。药敏试验结果显示,83株大肠杆菌对头孢菌素药物耐药严重,其中青霉素最高,为100%,头孢拉定为77.1%,头孢曲松钠为61.4%,头孢噻肟为60.2%;PCR结果显示,69株(83.1%)产β-内酰胺酶,其中blaCTX、blaOXA、blaTEM、blaCMY和blaSHV的阳性率依次为70%、25%、17%、6%和0,说明河北地区致病性大肠杆菌产ESBLs主要为blaCTX、blaOXA,且有28株同时携带两种以上基因;毒力基因检测结果显示,83株鸡源大肠杆菌毒力基因阳性率由高到低为iro N(54株,65.06%)、iutA(51株,61.45%)、iss(37株,44.58%)、hly T(28株,33.73%)和omp T(9株,10.84%),iro N、iutA的阳性率均大于60%,说明二者是河北禽源致病性大肠杆菌致病力的关键所在;有17株未检测到所测毒力基因的存在,但临床也表现为败血症,可能涉及其他毒力基因,需进一步探讨。     

河北地区水貂源大肠杆菌的分离鉴定及致病性与耐药性研究

为分析河北地区水貂源大肠杆菌的致病性与耐药性,本研究对河北地区送检病死水貂采集组织样品,经分离鉴定、生化鉴定和16S rDNA基因序列分析,共分离得到24株水貂大肠杆菌。对分离菌株进行致病性试验、药敏试验、毒力基因和耐药基因检测。结果显示,24株大肠杆菌感染小鼠后小鼠死亡率为20%～100%;24株分离菌中有22株检测到毒力基因,fimC毒力基因检出率最高,为70.83%(17/24);分离的24株株大肠杆菌耐药性较强,对替米考星、土霉素、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、复方新诺明耐药的菌株占80%以上,对头孢曲松最敏感,敏感菌株占66.67%(16/24),且分离菌均具有多重耐药性,耐5种以上药物的菌株占比高达100%;24株大肠杆菌均检测到耐药基因,耐药基因检出率为4.17%～79.17%,其中氨基糖苷类耐药基因addA1(79.17%)、喹诺酮类耐药基因gyrA(75%)、gyrB(70.83%)检出率较高,β-内酰胺类耐药基因ctx-M(20.83%)和SHV(4.17%)检出率较低;未检测到tetA、tetC、sul1、mefA耐药基因。上述结果表明,分离菌对小鼠均具有一定的致病力,且毒力基因检出数越多的菌株对小鼠的致病力越强;β-内酰胺类、氨基糖苷类和喹诺酮类的耐药基因与耐药表型基本相符,分离菌的其余耐药基因与耐药表型不符,提示分离的大肠杆菌可能存在其他耐药机制。本研究为河北地区水貂大肠杆菌病的防治提供参考依据,为大肠杆菌的致病机制和耐药机制的研究奠定基础。     

江苏、山东部分地区禽致病性大肠杆菌流行病学调查

禽大肠杆菌病是造成家禽高发病率和死亡率的重要疾病,该病是由禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)感染引起的细菌性疾病。通过对2015~2016年分离自江苏和山东部分地区的173株禽大肠杆菌的血清型、致病性、耐药性等流行病学特征进行调查,结果表明:定型菌株135株,未定型菌株38株,定型率为78.03%;优势血清型有O78(21%)、O24(12%)、O1(10%),其余定型菌株涉及31种血清型;55个进行1日龄易感鸡致病性试验的分离株中,高致病性菌株39个,中度致病性菌株5个,低致病性菌株11个,其中80%分离株具有高中致病力;耐药性检测结果表明,APEC普遍存在耐药性,所有分离株对10种以上的抗生素耐药。调查结果为该地区禽大肠杆菌病的防控提供参考。     

江苏部分地区禽致病性大肠杆菌分离株的生物学特征及耐药性研究

为了解江苏部分地区禽致病性大肠杆菌(APEC)的分子流行状况,从临床分离鉴定出120株APEC,并对分离株的血清型、种系发生型、毒力基因型和耐药性进行检测。血清型检测结果显示,在已定型的95株分离株中,最常见的血清型为O78,约占定型菌株比例为27.4%,其他主要血清型还有O18、O24和O88等。APEC分离株种系发生型以B2型和D型为主,分别占受试分离株的35.6%和28.5%,而A型和B1型分别占22.8%和13.1%。对已知的12种毒力基因的检测发现,铁摄取基因的检出率相对较高,如tonB(93.3%)、iutA(90.8%)、iroN(84.2%)和feoB(82.5%),其他受检基因fimH、iss、cvaC和traT的检出率也在70%以上,而hlyD、papC、irp-2和tsh基因在APEC菌株中的检出率低于30%。筛选40株分离株进行1日龄雏鸡致病力试验,确定出高致病株和低致病株分别占65%和35%。进一步分析发现高致病株比低致病株检出率高的毒力因子有iutA、tsh、iroN、irp-2、iss和cvaC(P0.05),提示这6种毒力基因可作为鉴别APEC毒力的靶标基因。APEC分离株大多呈现多重耐药,对受试的13种抗生素的耐药率均超过了50%,特别是对强力霉素、四环素、先锋IV、氨苄青霉素、磺胺异噁唑的耐药率甚至达到了80%以上。本研究丰富了APEC流行病学数据,为指导临床APEC菌株的鉴定和防控提供科学依据。     

红嘴鸥源致病性大肠杆菌毒力基因检测及致病性分析

以10株红嘴鸥源大肠杆菌云南省分离株为研究对象,采用PCR菌株进行毒力基因测定并进行小鼠致病性试验。PCR性率依次为astA(60%6株)、fuyA(60%6株)、Iss(50%5株)、iucD(50%5株)、tsh(40%4株)、Vat(30%3株)、papC(30%3株)、kpsⅡ(30%3株)、hlyE(20%2株)、irp2(20%2株)、fimH(10%1株),小鼠致病性试验结果显示携带毒力基因数量多的菌株致病力越强,小鼠发病时间死亡时间越短。结果说明:10株分离菌株均携带不同的毒力基因,不同毒力基因的组合与小鼠的致病力密切相关。不同毒力基因的组合对小鼠相关致病机理有一定关系,有待进一步研究。     

鸡胚致死率作为检验鸡大肠埃希菌致病力指标的探讨

为探讨鸡胚致死率在检验鸡大肠埃希菌致病力方面的应用潜力,试验采用SPF级12日龄鸡胚和1日龄公雏鸡分别接种鸡大肠埃希菌菌株,检测20株鸡大肠埃希菌菌株对12日龄鸡胚和1日龄公雏鸡的致死率的相关性。结果显示,8株来源于患败血症鸡只的菌株致病力比较高,鸡胚致死率达到40%~70%;而来源于粪便的12株菌株中,10株菌株的致病力较低,其鸡胚致死率在0%~20%之间;雏鸡致死率与鸡胚致死率是相关的。表明鸡胚致死试验可反映出大肠埃希菌的毒力强弱,即鸡胚致死率可作为检验鸡大肠埃希菌致病力强弱的一种方法。     

禽源大肠杆菌的生物表型特性

对243株禽源大肠杆菌分离株进行血清耐受试验、菌毛化大肠杆菌血凝试验和温度敏感性血凝素试验.在这些分离株中,高度血清耐受、中等血清耐受、轻度血清耐受和血清敏感菌株分别占受试菌株的57.2%(139/243)、28.8%(70/243)、10.3%(25/243)和3.7%(9/243).在37℃细菌培养物与鸡红细胞凝集试验中,甘露糖敏感血凝(MSHA)和甘露糖耐受血凝(MRHA)菌株分别占受试菌株的64.6%(157/243)和5.8%(14/243);与豚鼠红细胞凝集试验中,MSHA和MRHA菌株分别占受试菌株的74.9%(182/243)和2.9%(7/243),其中与鸡红细胞凝集试验MSHA菌株中,MSHA阳性菌株占高致病株的69.5%(132/190),MRHA阳性菌株占低致病株的22.2%(2/9),两者差异极显著(p<0.01).在温度敏感性血凝素试验中,MRHA菌株为112株,占分离株的46.1%,其中O1、O2和O78血清型的高致病株占所在血清型分离株的83%～100%,而其它血清型的高致病株仅占57%左右,差异显著(p<0.05).结果显示禽源大肠杆菌的致病性与其血清耐受能力、鸡红细胞MSHA菌毛的表达和温度敏感性血凝素的表达呈一定的相关关系.     

聊城地区鸡源大肠杆菌毒力基因分析

为了明确聊城地区养鸡场大肠杆菌毒力基因的携带及分布情况,试验采集聊城地区养鸡场样品,分离、鉴定大肠杆菌菌株,并利用PCR方法检测18种毒力基因(aatA、papC、tsh、fimC、mat、ibeB、vat、yijp、ibeA、ompA、neuC、cvaC、iss、iroN、fyuA、iucD、irp2、chuA)的分布情况。结果表明:共分离、鉴定到212株大肠杆菌;阳性率超过50%的毒力基因有yijp、fimC、mat、ompA、ibeB、iroN等6种,阳性率为20%～49%的毒力基因有7种(aatA、tsh、vat、cvaC、iss、iucD、irp2),阳性率为20%以下的毒力基因有5种(papC、ibeA、neuC、fyuA、chuA);分离菌株同时携带10种及以上毒力基因的比例为10%,大多数菌株携带5～9种毒力基因,占比为73%。说明聊城地区鸡源大肠杆菌普遍携带5～9种毒力基因,且侵袭及毒素相关基因yijp的携带率最高。     

江苏泰州某鸡场禽源性大肠杆菌的分离鉴定及生物学特征研究

为确定江苏泰州某鸡场疑似禽大肠杆菌病的病原,通过病理剖检了解组织器官病变情况,采集患病鸡的肝脏、心脏等脏器进行细菌分离培养,并测定分离株生化特性和血清型;采用PCR鉴定分离株及其携带毒力基因(iut A、iss、tsh、iro N、irp-2、cva C)的数量,经动物感染试验确定其致病力;通过药敏试验测定分离株对14种抗生素的耐药性。结果显示:共鉴定出4株禽源性大肠杆菌,其血清型分别为O78、O24、O88和O13,其中O78株(携带iut A~+、iss~+、iro N~+、irp-2~+、cva C~+)和O24株(携带iut A+、iss+、iro N+、cva C+)为强毒力菌株,O88株(携带iutA~+、iss~+、cvaC~+)和O13株(携带iss~+、cva C~+)为弱毒力菌株;4株禽源性大肠杆菌呈现多重耐药,对氨苄青霉素、四环素、强力霉素、先锋Ⅳ、磺胺异噁唑普遍耐药。研究表明,临床分离的禽源性大肠杆菌具有不同程度的致病性,且耐药严重,提示禽大肠杆菌病的防控难度增大。     

鸡源致病性奇异变形杆菌的分离鉴定与遗传进化分析

为了解鸡源奇异变形杆菌的耐药情况、致病力和遗传特征,本试验从凉山地区分离得到2株细菌(YLF1、WS),通过培养特征、镜检特征和16SrRNA序列测定对分离菌进行鉴定及致病性试验;采用(K-B)法检测分离菌对14种常用抗生素(包括β-内酰胺类、头孢烯类、氨基糖苷类、四环素类、氟喹诺酮类、大环内酯类)的敏感性;并与GenBank中公布的21种不同来源的变形杆菌16SrRNA基因序列进行遗传进化分析。结果表明,YLF1、WS菌株均具有迁徙性和β-溶血生长特征,镜检为革兰氏阴性长短不一的杆菌或球菌,经16SrRNA基因鉴定与GenBank中奇异变形杆菌同源性均在99%以上,YLF1、WS菌株确定为奇异变形杆菌,均表现为多重耐药,耐药率分别为78.6%(11/14)和71.4%(10/14);雏鸡致死率均为80%;YLF1、WS菌株与日本人体分离株、中国新疆黄牛分离株和中国广东土壤分离株同源性最高,达99.9%;与来自中国河南、中国新疆及印度的鸡源奇异变形杆菌同源性较高(98.9%~99.3%),遗传关系密切。表明凉山地区鸡群中存在奇异变形杆菌感染,分离株有较高的致病力和较强的耐药性,也提示分离菌可能来源于环境、感染鸡或其他动物,同时存在人畜共患的潜在危险。     

fimC基因与鸡源大肠杆菌致病性的相关

将20株鸡大肠杆菌分别腹腔接种1日龄健康雏鸡,检测其致病性。同时以该20株菌的基因组DNA为模板,应用PCR技术分别进行fimC基因的扩增,结果95％高致病力菌为fimC^ ,而其它非致病性或致病力极低的菌株均为fimC^-。结合相关资料表明,fimC基因几乎只存在于高致病力鸡大肠杆菌中,可以作为高致病力鸡大肠杆菌鉴定的标志基因。将O2菌株PCR扩增产物克隆到pMD18-T载体上,并对其进行酶切鉴定和测序分析,测序结果与参考序列经同源性比较,核苷酸序列同源性为97．9％,氨基酸序列同源性为96．0％,证明所扩增基因是fimC基因。     

CTX-M-9亚群鸡大肠杆菌的遗传背景及毒力基因特性

探讨鸡大肠杆菌bla_(CTX-M-9)的遗传背景和毒力因子流行特征,为进一步研究bla_(CTX-M-9)与致病特性是否相关奠定基础。取近年来收集的17株产CTX-M-9族鸡大肠杆菌为研究对象,分别采用定位PCR、多重PCR等技术检测受试菌株的种系发育、MLST序列、质粒复制子特性、bla_(CTX-M-9)的上、下游基因环境及其携带的31种毒力基因。结果显示,bla_(CTX-M-9)的上游均含有ISEcpl,部分被IS26截断,下游最常见的是IS903。受试菌ST分型多样化,17株菌分别属于12种不同的ST型。受试菌携带3种以上复制子,最常见的是IncFII复制子,其次为IncFIB、IncK和IncI1型。受试菌分属于种系发育的D群(7株)、B1群(6株)和A群(4株),未检出强致病力的B2群菌株。受试菌均含有fimH、traT和feoB毒力基因,同时毒力基因检测率较高的还有sit A、iut A、iucC、iroN和iss基因。结果表明,ISEcpl和IS903转座子、IncF在bla_(CTX-M-9)快速散播过程中发挥了重要的作用,克隆传播仅发挥了次要的作用;产CTX-M-9族鸡大肠杆菌含有较多的毒力基因,具有一定的致病力。     

iss基因与鸡大肠杆菌毒力相关性的分析

对20株鸡源大肠杆菌的致病性进行测定。并对不同致病性鸡大肠杆菌的iss基因进行了扩增。结果表明：鸡E．coli O1、O2、北京1、北京3、贵州1、新大、田大、E10、E11、E27对1日龄雏鸡具有较强的毒力;O78、E5、E21的致病性较弱;而E．coli E1、E4、E7、E8、E9、E14、E18接种雏鸡均无死亡。iss基因在致病性鸡E．coli O1、O2、O78、北京1、北京3、贵州1、新大、田大、E5、E21、E10、E11、E27中的扩增频率为92．31％;在毒力较强的致病性鸡Ecoli O1、O2、北京1、北京3、贵州1、新大、田大、E10、E11、E27中的扩增频率为100％;在无致病性(或低毒力)的鸡Ecoli E1、E4、E7、E8、E9、E14、E18中的扩增频率为14．29％。结果表明：iss基因在致病力强的菌株中的扩增频率明显高于其它菌株,iss基因的存在与鸡大肠杆菌的毒力问有一定的相关性。     

60株大肠杆菌的分离与致病性鉴定

大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)是鸡肠道常在菌,部分菌株具有致病性。鸡大肠杆菌病就是由大肠杆菌中的某些致病性菌株引起的鸡感染性疾病。致病性大肠杆菌均携带毒力岛基因ChuA。为鉴定分离自临床病例的鸡大肠杆菌的致病性,本试验采用PCR法检测ChuA基因进行分子生物学鉴定,60株大肠杆菌中有31株属于致病性大肠杆菌,总阳性率为51.67%。     

鸡源大肠杆菌分离鉴定及ESBLs与AmpC酶基因型检测及耐药性分析

为了解山西省范围内鸡源产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)和头孢菌素酶(AmpC)大肠杆菌分离株的基因型及其耐药现状,本试验从呈现典型鸡大肠杆菌病临床症状的病料中分离、鉴定出68株符合鸡源大肠杆菌生物特性的流行菌株,采用K-B法与双纸片确认法对分离的68株大肠杆菌分别进行药敏试验和ESBLs、AmpC酶耐药表型的筛选;采用PCR方法检测了分离株中质粒介导的ESBLs、AmpC酶的基因型。结果显示,分离到的68株菌对22种抗菌药物均产生不同程度的耐药性,其中耐药谱达7耐以上的有66,占总分离菌株数的97.06%;呈ESBLs、AmpC酶阳性和两者均阳性的菌株数分别为57(83.82%)、19(27.94%)和16(23.53%)株;检测出ESBLs阳性菌株携带的耐药基因型包括bla_(TEM)、bla_(OXA)和bla_(CTX-M-1/9),AmpC酶阳性菌株耐药基因型为bla_(FOX)型。研究结果表明,分离的68株鸡源大肠杆菌已对绝大多数种类抗菌药物产生耐药性,且产ESBLs和AmpC酶菌株已普遍流行。山西省鸡源大肠杆菌中流行的ESBLs基因型与国内其他地区相关报道大体一致,而检测到的bla_(FOX)型AmpC酶基因在国内报道相对较少。     

青岛地区鸡源bla_(NDM)与mcr-1耐药基因的流行性试验

为了解青岛地区鸡源大肠杆菌中碳青霉烯耐药基因bla_(NDM)与黏菌素耐药基因mcr-1流行情况。2018-2019年从青岛地区共采集195份鸡直肠拭子和盲肠内容物,通过选择性培养基筛选目的菌株和16S rRNA菌属鉴定。采用琼脂稀释法测定菌株对10种常见重要抗菌药物的敏感性,通过PCR检测bla_(NDM)与mcr耐药基因并测序。结果共计分离到186株大肠杆菌,其中鸡泄殖腔源98株,鸡盲肠源88株。药敏试验结果显示,分离菌株对阿莫西林、四环素、头孢氨苄耐药率均高于90%;多黏菌素81.2%、庆大霉素88.7%、氧氟沙星86.6%和头孢噻肟87.1%,呈现较高的耐药率;对替加环素(4.8%)则表现低水平耐药率。进一步分析发现,62.9%的测试菌株对8种以上药物耐药,表现多重耐药。耐药基因检测揭示了31.2%(n=58)大肠杆菌携带mcr-1基因,7.5%(n=14)携带bla_(NDM),包括1株bla_(NDM-1)、1株bla_(NDM-9)、12株bla_(NDM-5)。其中6株大肠杆菌株同时携带了bla_(NDM)和mcr-1,包括5株bla_(NDM-5)+mcr-1和1株bla_(NDM-9)+mcr-1。表明山东青岛地区鸡源大肠杆菌耐药菌检出率较高,多重耐药现象严重;且bla_(NDM)和mcr-1存在共同传播。     

禽优势血清型大肠杆菌部分相关毒力基因的检测

为研究禽大肠杆菌的致病性及相关生物特性,试验对湖北省各地方养殖场送检的病料,通过分离培养及生化鉴定,分离得到232株禽大肠杆菌。18个O因子血清鉴定结果显示,优势血清型为O_(20)(19)、O_(78)(27),这两种血清型菌株合计46株,占血清型定型菌株的25.99%(未定型菌株为55株)。对优势血清型禽大肠杆菌菌株进行毒力基因检测,结果表明fimH、iroD、iucD、estA和ibeA基因携带率分别为87.88%、57.58%、48.49%、36.37%、0%。研究结果为湖北地区大肠杆菌防控和疫苗的研制提供数据支撑,并为阐明大肠杆菌的致病机理奠定基础。     

鸡胚源大肠杆菌的分离鉴定及其致病性和耐药性分析

为了解鸡胚来源大肠杆菌的致病性和耐药性情况，本试验对山东省某白羽肉鸡孵化场6个不同批次种蛋孵化后随机抽检的174枚啄壳未出壳死胚的卵黄和胎粪进行了大肠杆菌分离。通过细菌培养、形态观察、生化试验方法鉴定大肠杆菌；通过小鼠攻毒试验和毒力基因PCR检测确定大肠杆菌分离株的致病性；利用纸片扩散法药敏试验检测大肠杆菌分离株的耐药性。结果显示，共分离鉴定大肠杆菌28株；小鼠攻毒试验结果显示，27大肠杆菌分离株对小鼠的致死率达到了50.0%以上，其中有24株超过了83.0%;在检测的14种毒力基因中，papA、papC、eaeA和vat四种基因未检出，fimC检出率最高(85.7%),另外9种毒力基因检出率介于3.6%～64.3%;菌株的致病性与携带的毒力基因数量大致呈正相关；耐药性检测结果显示，大肠杆菌分离株对10种抗菌药物具有不同程度的敏感性，耐药率介于17.9%～89.3%。结果表明，本试验分离的鸡胚源大肠杆菌绝大多数具有致病性，对临床常见抗菌药物存在不同程度的耐药。本试验结果为种鸡场加强大肠杆菌垂直传播的管理和控制以及临床用药的选择提供了参考依据。