小花棘豆生物碱对α—甘露糖苷酶活性的影响

为探讨小花棘豆的中毒机理,采用苦马豆素、黄花碱以及这2种生物碱的混合物分别对小白鼠进行传统灌胃,并于试验开始后第7、14、21、28和35天分别从各组中随机取4只小白鼠,眼球采血,肝素钠抗凝,利用紫外可见分光光度计检测血清中α—甘露糖苷酶的活性。结果表明:低浓度的SW具有提高血清中α—甘露糖苷酶活性的作用,中等浓度和高浓度的SW在短时间内也可以提高血清中α—甘露糖苷酶的活性,但时间过长会严重降低血清中α—甘露糖苷酶的活性;Ts在整个试验过程中不影响血清中α—甘露糖苷酶的活性;混合生物碱组表现出与SW组类似的结果。     

变异黄芪有毒成分的分离与分析

从变异黄芪(Astragalus variabilis Bunge)中分离出结晶Ⅰ,经紫外、红外光谱及液相色谱分析、α-甘露糖苷酶抑制试验,并与苦马豆素(Swainsonine)标品进行了比较。确证变异黄芪所含主要有毒成分为吲哚兹定生物碱——苦马豆素,经测定其含量为0.029%。     

α-甘露糖苷酶研究进展

α-甘露糖苷酶多具有糖苷水解酶38、47家族保守序列,目前已测序的α-甘露糖苷酶基因序列超过2000多种,根据α-甘露糖苷酶基因保守序列可将其分为三类,即Ⅰ类α-甘露糖苷酶、Ⅱ类α-甘露糖苷酶和未分类α-甘露糖苷酶。α-甘露糖苷酶主要参与蛋白质糖基化修饰和糖蛋白聚糖水解修饰。其代谢异常可以引起多种疾病,目前研究较多的是由α-甘露糖苷酶功能障碍引起的先天性红细胞生成异常性贫血Ⅱ型和α-甘露糖苷贮积症。论文主要对α-甘露糖苷酶的分类及其在糖基化过程中的作用,以及与之有关的疾病进行介绍,以期为苦马豆素毒性作用机制研究提供理论参考。     

α-甘露糖苷酶法测定家兔血清中苦马豆素含量

试验旨在建立以α-甘露糖苷酶法测定家兔血清中苦马豆素(SW)浓度的方法。SW对α-甘露糖苷酶活性的抑制程度与其浓度呈线性相关。以对硝基苯基-α-D-甘露糖苷为底物,通过分光光度法(405 nm)检测α-甘露糖苷酶水解产生的对硝基酚吸光度,从而间接测定样品中SW浓度。结果显示:在0.107～1.730 mg/mL SW浓度范围内线性关系良好,加标平均回收率100.64%,RSD=2.743%(n=8)。试验期家兔血清SW含量随饲喂时间的延长而增高。该方法准确度较高、精密度较好、操作简便快速、特异性较好,可作为SW的微量定量检测方法。     

苦马豆素对机体免疫机能的影响

苦马豆素属吲哚里西啶类生物碱,是一种极强的α-甘露糖苷酶竞争性抑制剂。研究表明,它能抑制肿瘤细胞的生长与转移,刺激机体的免疫系统,提高机体的免疫机能,促进免疫细胞的增生,增强杀灭肿瘤细胞的能力。本文就近十几年来有关苦马豆素对于机体NK、LAK、巨噬细胞、淋巴细胞和骨髓细胞质、骨髓细胞及骨髓细胞分化成CFU-G、BFU-E、CFU-GEMM集落能力的影响进行了阐述,并对苦马豆素作用机理的研究做了介绍。     

小花棘豆中毒对家兔睾丸α-甘露糖苷酶的影响

将24只家兔随机分为4组,即对照组和试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组。将小花棘豆全草粉碎后,按Ⅰ组添加15%(含苦马豆素30mg/kg)、Ⅱ组添加30%(含苦马豆素60mg/kg)、Ⅲ组添加45%(含苦马豆素90mg/kg)的比例制作混合饲料,饲喂至典型临床症状出现为止。攻毒后第14、35、70d每次每组随机采集2只家兔的睾丸,检测家兔睾丸AMA活性及其表达变化。结果显示,试验组及对照组家兔睾丸高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ(AMA1)和溶酶体α-甘露糖苷酶(AMA2)均有表达,但各试验组表达转录水平与对照组差异显著,试验Ⅰ组家兔AMA1和AMA2的表达与对照组差异不显著(P0.05),但试验Ⅱ组和试验Ⅲ组家兔AMA1和AMA2的表达均显著低于对照组(P0.05),随着试验的进行抑制效果愈加明显。结果表明,小花棘豆中毒可影响家兔睾丸AMA的活性及其基因的转录表达。     

产苦马豆素疯草内生真菌U.oxytropis的发酵培养及苦马豆素检测方法的建立

通过对生长初期疯草内生真菌U.oxytropis菌丝复苏后连续培养32d,每隔4d取样1次,并设3个平行培养组,测定其不同培养时期菌丝干重变化,利用超声减压旋蒸法提取菌丝和发酵液中苦马豆素(SW),并分别利用薄层层析法、气相色谱法和α-甘露糖苷酶抑制法对菌丝、发酵液中SW含量进行测定。结果显示,经测定疯草内生真菌U.oxytropis菌丝干重质量,确定疯草内生真菌U.oxytropis生长周期为24d;薄层层析法、气相色谱法和α-甘露糖苷酶抑制法都可快速对菌丝和发酵液中提取的SW进行定性、定量检测,并比较3种检测方法,发现气相色谱法检测限低、灵敏度更高。本试验完成了疯草内生真菌U.oxytropis生长周期的测定,并建立了菌丝、发酵液中SW的有效、快速提取及检测方法,为下一步产苦马豆素疯草内生真菌U.oxytropis生物合成机理的研究奠定基础。     

绵羊血清α甘露糖苷酶活性测定

为了测定绵羊体内α甘露糖苷酶最适反应的pH,建立一种适合于绵羊血清α甘露糖苷酶活性的检测方法。根据对-硝基苯基-α-D-甘露糖苷在α甘露糖苷酶的作用下可水解产生对硝基酚和甘露的活性,用比色法测定产生的对硝基酚含量,与标准曲线对照,从而求出α甘露糖苷酶活性。试验对2份绵羊血清的α甘露糖苷酶活性在不同pH条件下进行了测定。研究表明,绵羊血清中α甘露糖苷酶在pH 3.8时活性比pH 4.6和pH5.0高,差异显著(P<0.05),初步推测绵羊体内α甘露糖苷酶最适反应的pH为3.8。     

自噬在疯草中毒中的作用及其机制

疯草已成为危害我国西部草原畜牧业发展的主要毒草,其主要有毒成分苦马豆素,能特异性地抑制α-甘露糖苷酶活性造成细胞内异常糖蛋白的形成,异常蛋白的清除主要在溶酶体进行,而溶酶体α-甘露糖苷酶活性被抑制使蛋白质清除受阻,最终出现与α-甘露糖苷贮积症相似的病理变化即广泛的空泡变性。自噬可以将自身受损、变性大分子物质运送到溶酶体进行自我消化,有资料显示,自噬降解受阻会导致自噬体蓄积形成空泡样病变。根据自噬的形成和作用机制,我们推测疯草中毒造成的空泡变性可能与自噬有关。现就从疯草中毒机制、自噬分子机制及疯草中毒与自噬的关系等方面进行综述,以期为苦马豆素毒性及作用机制研究提供理论依据。     

a-甘露糖苷酶法测定家兔血清中苦马豆素含量

试验旨在建立以a-甘露糖苷酶法测定家兔血清中苦马豆素（SW）浓度的方法。SW对a-甘露糖苷酶活性的抑制程度与其浓度呈线性相关。以对硝基苯基-a-D-甘露糖苷为底物,通过分光光度法（405Flm）检测a-甘露糖苷酶水解产生的对硝基酚吸光度,从而间接测定样品中SW浓度。结果显示：在0．107-1．730mg／mLSW浓度范围内线性关系良好,加标平均回收率100．64％,RSD=2．743％（n=8）。试验期家兔血清SW含量随饲喂时间的延长而增高。该方法准确度较高、精密度较好、操作简便快速、特异性较好,可作为SW的微量定量检测方法。     

直立黄芪中产苦马豆素真菌的分离与鉴定

为了确定直立黄芪中是否存在能产生苦马豆素的真菌及该类真菌与链格孢属波状芽管孢组疯草内生真菌的遗传进化关系,对直立黄芪植物组织中的真菌进行了分离,应用ɑ-甘露糖苷酶抑制法和超高效液相色谱-串联质谱法对分离菌株菌丝中的苦马豆素进行分析,筛选能够产生苦马豆素的菌株。PCR法扩增产苦马豆素真菌的内部转录间隔区(ITS)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GPD)和β-酮脂酰合酶(β-ketoacyl synthase,KS)基因,测定其序列,进行序列一致性比对。基于ITS和GPD序列构建系统发育树,根据遗传进化分析结果和形态特征,对直立黄芪中的产苦马豆素真菌进行种属分类和命名。结果显示:从直立黄芪中共分离到43株真菌,其中有13株菌丝中含有苦马豆素,序列一致性和系统发育分析结果表明,该类真菌与已报道的直立黄芪病原真菌甘肃链格孢(Alternaria gansuense)和产苦马豆素疯草内生真菌(Alternaria Section Undifilum sp.)的亲缘关系最近。直立黄芪中存在能产生苦马豆素的真菌,根据形态特点和遗传进化分析结果,本研究将从直立黄芪中分离的产苦马豆素真菌划分到链格孢属波状芽管孢组中,并命名为甘肃波状芽管孢(Alternaria Section Undifilum gansuense)。     

小花棘豆毒性的危害与利用

小花棘豆Oxytropis glabra是内蒙古主要的疯草植物之一,所含有毒成分苦马豆素可抑制动物细胞内的甘露糖苷酶,引起牲畜慢性中毒。概述小花棘豆的生物学特性和牲畜小花棘豆中毒的机理及其危害,分析与牲畜中毒相关的生态和环境因素,指出中毒发病与采食量、饲养管理和草原生态状况有关;评论了通过化学脱毒、抗毒疫苗和药物研制、生态治理等措施对小花棘豆进行利用,对于苦马豆素的抗肿瘤应用也进行了回顾。     

苦马豆素抑制α-甘露糖苷酶的剂量效应关系

根据苦马豆素(Sw)抑制α-甘露糖苷酶(AMA)的特点,建立了SW抑制AMA的剂量效应关系曲线和酶法测定SW溶液浓度的方法.SW溶液浓度范围在5×10-8mol/L～5×10-6mol/L时,SW溶液浓度的负对数与其抑制AMA活性百分比呈线性关系,线性方程Y=0.026X+5.167 4,R2=0.994 7.建立了酶...     

棘豆的毒性、危害及防治

综述了棘豆Oxytropis主要有毒成分苦马豆素（Swainsonine）的来源、毒性原理、对家畜危害及防治办法的研究进展。棘豆中苦马豆素主要来源于内生菌（endophyte）的代谢产物,其含量与根瘤菌固氮作用有密切关系,而与遗传无关。苦马豆素通过血液转运到中毒牲畜各个组织器官中,累积到一定量后即可抑制甘露糖苷酶（mannosidase）活性,使细胞产生空泡而变性,进而影响到家畜的免疫健康、精神行为、消化吸收、生长繁殖和引种。目前的预防手段有：轮牧法、隔离法和厌食法;治疗手段主要为灌服药剂治疗。     

疯草内生真菌苦马豆素合成相关基因及其研究方法的进展

<正>豆科棘豆属(Oxytropis)和黄芪属(Astragalus)有毒植物统称为疯草。疯草的营养价值丰富,是潜在的优良牧草。但家畜长期或过量采食后,可发生以神经机能紊乱为特征的慢性中毒病,称之为疯草中毒病[1]。中毒家畜表现为共济失调、瘫痪、流产、不孕、出生缺陷和死亡等。疯草导致动物中毒的主要因素是疯草中的吲哚里西啶类生物碱—苦马豆素,它能特异性地抑制参与糖蛋白分解代谢的溶酶体α-甘露糖苷酶、高尔基α-甘露糖苷酶Ⅱ,破坏细胞内膜系统[2-     

苦马豆素人工抗原接种和田羊的免疫学研究

为了探索苦马豆素(SW)人工抗原SW-BSA免疫接种后对和田羊的保护作用,试验通过间接血凝试验(IHA)和间接酶联免疫吸附试验(ELISA)分析SW-BSA免疫和田羊后血清抗体效价的变化,并检测试验羊血清E-玫瑰花环率的变化,以及血清谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(AKP)、乳酸脱氢酶(LDH)、α-甘露糖苷酶(AMA)、肌酐(CRE)活性的变化,同时检测试验组尿液和血液中有无SW。结果表明:SW-BSA可以诱导和田羊产生高效价的抗SW抗体,而且这种高效价保持的时间较长,机体E-玫瑰花环率显著上升;试验组与对照组比较,血清中AST、ALT、AKP、LDH、AMA、CRE水平均差异不显著(P0.05),尿液和血液中均未检查出SW。说明合成的人工抗原SW-BSA具有较好的免疫原性和安全性。     

小花棘豆中生物碱对小鼠T淋巴细胞的影响

为了研究不同剂量的苦马豆素(SW)、黄花碱(Ts)及其两类生物碱的混合物对小鼠T淋巴细胞转化的影响,探讨小花棘豆的中毒机理,试验将240只小鼠随机分组,分别灌服不同浓度的苦马豆素、黄花碱和两类生物碱的混合物,于试验第7,14,21,28,35天每组随机抽取4只小鼠,眼球采抗凝血,分离淋巴细胞,用Con A刺激,用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测T淋巴细胞增值性反应情况。结果表明:低剂量苦马豆素能够促进小鼠T淋巴细胞增殖;中剂量和高剂量短时间内对T淋巴细胞的增殖也有促进作用,长时间会严重抑制T淋巴细胞增殖。低剂量黄花碱对T淋巴细胞的增殖几乎无影响,高剂量也会抑制T淋巴细胞的增殖。生物碱混合物出现了与苦马豆素类似的结果。说明不同浓度的苦马豆素、黄花碱及其混合物均能不同程度地影响T淋巴细胞的增值反应。     

不同因素对疯草内生真菌合成苦马豆素的影响

研究不同因素对疯草内生真菌——Undifilum oxytropis合成苦马豆素的影响,筛选出显著影响U.oxytropis苦马豆素合成的因素。将U.oxytropis分别接种到不同pH或不同浓度聚乙二醇(PEG)、L-哌可酸、L-赖氨酸、α-酮戊二酸的培养基中培养,测定菌丝及其发酵液中苦马豆素,分析各条件下真菌苦马豆素产率的变化。结果表明:当pH在4.5~6.5时,随pH增加,真菌SW产率显著增加(P0.05);当PEG质量浓度在0~32g·L-1时,随PEG增加,真菌苦马豆素产率显著降低(P0.01);当在培养基中添加相同量(10-3 mol·L-1)的L-哌可酸、L-赖氨酸、ɑ-酮戊二酸时,L-哌可酸添加组的苦马豆素产率显著降低(P0.05),L-赖氨酸添加组苦马豆素产率显著增加(P0.05);当L-哌可酸的初始浓度为10-3和10-2 mol·L-1时,真菌的苦马豆素产率显著下降(P0.05),当其浓度为10-4 mol·L-1时,苦马豆素产率显著增加(P0.01);当L-赖氨酸的初始浓度为10-1、10-2或10-4mol·L-1时,真菌苦马豆素产率显著降低(P0.05)。当ɑ-酮戊二酸的初始浓度分别为10-1、10-2、10-3 mol·L-1时,真菌的苦马豆素产率显著降低(P0.05)。由试验可知,低pH或添加PEG可抑制U.oxytropis中苦马豆素的合成,L-哌可酸、L-赖氨酸、α-酮戊二酸均对U.oxytropis的苦马豆素合成产生显著影响,但对苦马豆素合成的影响与各物质在培养基中的浓度密切相关。     

生物降解对疯草营养成分与苦马豆素含量影响的研究

为研究生物发酵降解对疯草营养成分与苦马豆素含量的影响,采用混合青贮技术对疯草类有毒植物变异黄芪有毒成分苦马豆素进行生物降解处理,测定降解处理前后变异黄芪营养成分及苦马豆素含量变化情况。结果表明,变异黄芪经生物降解处理后其营养成分变化较小,而苦马豆素含量平均下降了78.09%。该处理方法简单经济、毒素降解高效,适宜在我国疯草威胁区域推广。     

变异黄芪中产苦马豆素内生真菌的分离与鉴定

从变异黄芪种子中分离并纯化内生真菌,应用ɑ-甘露糖苷酶抑制法检测能产生苦马豆素的内生真菌。提取真菌DNA,扩增和测定真菌ITS和GPD序列,进行序列同源性比较,构建系统发育树。结果:从变异黄芪种子中共分离到3株产苦马豆素内生真菌,其形态特征均与波状芽管蠕孢属相近;ITS和GPD序列与棘豆波状芽管蠕孢一致性高达99%;遗传分析显示,3株菌与棘豆波状芽管蠕孢真菌遗传距离最近。根据形态特点和遗传进化分析结果,将该3株菌鉴定为棘豆波状芽管蠕孢。