鹅ACSL1基因克隆及其在鹅肥肝形成中作用的初步研究

本研究旨在克隆鹅长链酯酰辅酶A合成酶1(ACSL1)基因,并研究其在填饲诱导鹅肥肝形成中的作用,为揭示ACSL1在鹅肥肝形成过程中的作用提供依据。以前期抑制消减杂交文库筛选的部分ESTs序列为基础,通过RT-PCR扩增鹅ACSL1基因CDS、并用实时定量等技术检测该基因在皮脂、腹脂、肝脏等10个组织中的表达情况及填饲对其在肝脏中表达的影响,同时与填饲后鹅肝脏总脂质、甘油三酯(TG)、肝质量等指标进行相关分析。结果发现:鹅ACSL1基因CDS全长2100bp,编码699个氨基酸。保守结构区预测发现,其蛋白质跟其他物种一样,也存在2个保守功能区(ATP/AMPmotif和FACSmotif)和1个跨膜结构域,它与鸡、牛、人、小鼠ACSL1基因的同源性分别为93%、80.4%、78.5%、77.3%;该基因主要表达于腹脂、皮脂、肝脏,而在其他组织表达相对较低;填饲能引起ACSL1mRNA在鹅肝脏的表达丰度极显著增加(P0.01),且与肝质量、肝内TG和总脂质呈显著正相关;同时,填饲导致其在朗德鹅肝脏中的表达丰度显著高于四川白鹅(P0.05)。结果提示:填饲引起ACSL1mR-NA在鹅肝脏中极显著增加(P0.01),且其增加幅度存在着品种间差异(P0.05)。     

鹅生长激素受体基因克隆及其个体发育性表达研究

以籽鹅为实验材料,根据鸡生长激素受体(GHR)基因mRNA序列设计并合成引物,通过PCR技术克隆了鹅GHR基因,并利用TaqMan实时荧光定量PCR方法检测籽鹅出壳到90日龄GHRmRNA在部分组织中的表达量变化。结果表明:鹅与鸡和鸭的GHR基因核苷酸序列同源性为97.1%和99.1%,氨基酸同源性均为99.1%。籽鹅肝组织中GHRmRNA表达水平在10到90日龄都较高,显著高于1日龄,以30日龄的表达量最高。30日龄GHRmRNA在肝脏等检测的组织中都有表达,但在肝脏和骨骼肌中的表达量高。肝组织中GHRmRNA表达量与日增重呈显著正相关(r=0.9116)。本实验结果揭示了生长期籽鹅组织中GHRmRNA表达水平的差异,为进一步研究生长轴相关基因对鹅生长及繁殖的调控作用奠定基础。     

扬州鹅NPFFR1基因CDS区克隆、生物信息学分析及组织表达检测

本研究旨在对鹅促性腺激素抑制激素受体基因(NPFFR1)进行克隆及生物信息学分析,并检测其在鹅不同组织中的表达。利用鸡NPFFR1基因为种子序列,采用RT-PCR方法克隆出扬州鹅NPRRF1基因,并通过相关软件对基因序列进行生物信息学分析。结果显示:共发现扬州白鹅NPFFR1基因的两种剪接形式:剪接体1的ORF大小为1 200 bp,编码399个氨基酸;剪接体2的ORF大小为432 bp,编码143个氨基酸,相对剪接体1缺失31 bp。对其进行生物信息学分析发现,鹅NPFFR1基因与鸡NPFFR1基因CDS序列同源性为92.8%,其产物是一种不稳定、疏水性蛋白,主要分布在细胞膜上;蛋白质跨膜结构预测显示鹅NPFFR1蛋白含有7个跨膜结构,属于跨膜蛋白,无信号肽片段。对产蛋末期母鹅10个组织样品的cDNA实时定量PCR结果显示,NPFFR1基因在各组织中均有表达,在下丘脑中表达最高,其次是腹脂、小肠、卵巢、胃、垂体、心脏、肌肉,在肾脏以及肝脏中表达很低。研究结果为今后探究鹅NPFFR1蛋白的相关功能及与其他蛋白质的相互作用提供了理论依据,同时为扬州鹅生殖轴调控产蛋性能的机理研究提供参考。     

鹅肌肉生长抑制素基因5′-调控区序列特征和组织表达分析

根据鸡的Myostatin基因序列设计引物,从鹅的基因组DNA中扩增到了Myostatin基因的5′-调控区,克隆并测序后获得了1．3kb片段序列。与其他物种的序列比较发现,鹅Myostatin基因的该调控序列与鸭同源性为94．8％,与鸡同源性为69．2％,而与小鼠仅为14．3％。通过生物信息学方法,分析确定了其启动子和转录起始位点,发现在转录起始位点上游-34bp处存在1个TATA盒,-77bp处存在1个CAAT盒。还发现在该片段中包含5个E框、2个MEF2结合位点、1个MSX2盒和1个MTATA盒等肌肉特异性转录因子结合位点。采集鹅肝脏、胸肌、腿肌、心脏、肺、肠、肾和脑等8种组织并提取总RNA,用Northernblot方法检测了Myostatin基因mRNA在8种组织中的表达情况,发现其只在胸肌和腿肌中表达,而在其他几种组织中没有检测到表达信号。     

鹅IGF-I基因cDNA的克隆、分析与原核表达

从GenBank中读取鸡、鸭、鹌鹑、火鸡等的胰岛素样生长因子-I(IGF-I)基因序列进行分析并设计引物,运用RT-PCR法从五龙鹅的总RNA中克隆了IGF-I基因的完整编码区序列(GenBank登录号为DQ662932).运用生物信息学技术对序列进行分析,结果显示:五龙鹅JGF-I基因的编码区长462 bp,与鸭和鸡基因序列同源性分别为99.6%和98.1%;分子进化树进一步揭示了五龙鹅与鸭、鸡及其他动物的进化关系;同源建模分析发现该基因有3个α-螺旋组成.克隆鹅IGF-I基因表达序列,然后连接到pET-32a载体上进行原核表达.经SDS-PAGE分析发现原核表达产物约为28 ku的融合蛋白,Western杂交分析表明,重组蛋白为目的蛋白.     

鹅卵泡选择过程中差异表达基因的初步探索

采用银染mRNA差异显示技术筛选并克隆鹅卵泡选择过程中差异表达的基因片段,测序后在Genbank中进行Blast检索分析其同源性.共获得5个差异片段(EST,表达序列标签),经Blast同源性分析发现1个与人甲硫氨酸腺苷基转移酶Ⅱβ亚基(MAT Ⅱβ)同源,同源性为95%,另一个与鸡mKIAA0840基因同源,同源性为94%,其余3个与已知基因或序列无任何同源性,可能是尚未发现的新基因.本研究结果显示鹅卵泡选择过程中的基因表达存在差异,筛选出的5个EST的全序列和功能有待于进一步深入研究.     

鹅副粘病毒NA-1分离株HN蛋白基因的克隆与序列分析

鹅副粘病毒分离株NA-1经11日龄鸡胚增殖后纯化.提取病毒的基因组RNA,采用RT-PCR扩增出与预期设计的1.7kb大小相符合的特异条带.将扩增产物提纯后克隆入pMD 18-T载体,经纯化、筛选及酶切鉴定后,初步获得了含鹅副粘病毒HN基因的阳性克隆,并对阳性克隆进行测序.测序后拼接得出HN基因的全序列长度为1 740bp,该基因的ORF总长为1 716 bp,编码571个氨基酸.与GenBank下载的15株参考毒株比较HN基因编码区全核苷酸序列,发现所测NA-1毒株与参考毒株YG97核苷酸序列同源性为97.3%,与F48E9同源性为84.5%,与La Sota为82.2%.同源性分析表明NA-1相对于NDV在HN基因上发生了较大的变异.     

北京鸭×番鸭杂种优势差异表达基因GHR的克隆

以北京鸭、法国番鸭及其正反杂交1代为试验材料,采用mRNA差异显示(DDRT-PCR)方法分析不同试验组肌肉组织基因表达差异,结合抑制性消减杂交(SSH)加以验证,发现生长激素受体(GHR)基因在杂种中上调表达。鸭GHR基因3′端578bp片段测序及比对结果表明,该基因与鸡GHR基因核苷酸序列同源性为90%,氨基酸序列同源性为93%。     

柳蚕异柠檬酸脱氢酶基因cDNA的克隆与表达分析

异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase,IDH)是生物体内一种重要的氧化还原酶。根据已报道的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸异柠檬酸脱氢酶(NADP-IDH)基因的保守性序列设计引物,以柳蚕(Actias seleneHubner)蛹脂肪体cDNA为模板,经PCR扩增获得了柳蚕IDH基因的部分序列。该序列长1 269 bp,编码412个氨基酸,与家蚕IDH基因的cDNA序列同源性达82.5%。柳蚕IDH与果蝇、赤拟谷盗、斑马鱼、人、大鼠、库蚊、人体虱、恶性疟原虫IDH的氨基酸序列同源性在70%左右,具有较高的保守性。半定量PCR检测结果表明,柳蚕IDH基因在蛹期不同组织中均有表达,且表达量没有显著差异。     

鸭A-FABP基因的克隆及其组织表达

本文采用RT-PCR方法从35周龄母鸭脂肪组织中克隆了A-FABP基因的cDNA序列,其长度为422 bp,包含了1个399 bp的完整CDS,编码132个氨基酸。该序列与家禽（鹅、鸡）和哺乳动物（人、小鼠、猪、牛）的A-FABP基因序列约有94%和73.4%-75.7%的同源性,而相应氨基酸序列的同源性为92.4%和72.0%-77.3%。半定量RT-PCR研究结果为A-FABP基因在间脑、肺和肾组织中不表达,在脂肪组织中的表达明显高于其他组织（P〈0.5）。表明A-FABP基因在动物进化中具有高度保守性,该基因的表达具有组织特异性。