猪伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体制备与鉴定

为获得猪伪狂犬病毒(PRV)gE蛋白单克隆抗体,选择原核表达的重组gE蛋白免疫6周龄BALB/c雌性小鼠,将其脾细胞与SP2/0进行融合,经间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞,结果获得了2株能稳定分泌抗PRV gE蛋白的杂交瘤细胞,命名为E3B8和E5C11。间接ELISA检测2株杂交瘤细胞的培养上清液抗体效价为1∶6.4×10~3,腹水的抗体效价分别达到1∶3.28×10~6和1∶6.55×10~6。2株杂交瘤细胞的染色体数分别为105和108。E3B8亚类鉴定重链为IgG1,轻链为κ链;E5C11亚类鉴定重链为IgG2b,轻链为κ链。Western blot检测显示2株单克隆抗体腹水均能与PRV重组gE蛋白发生特异性反应,间接免疫荧光试验(IFA)检测显示2株单克隆抗体均能与PRV分离毒株感染的BHK-21细胞发生特异性反应,交叉反应性检测显示2株单克隆抗体与常见病毒不发生交叉反应。表明制备的2株gE蛋白单克隆抗体效价高、特异性强,为gE蛋白结构与功能分析以及PRV免疫诊断试剂盒的开发奠定了基础。     

抗伪狂犬病病毒gG蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

以大肠杆菌表达的猪伪狂犬病病毒 (PRV) g G蛋白作为抗原 ,免疫 BAL B/c小鼠 ,经细胞融合、克隆后 ,获得了1F6、2 B92株稳定分泌抗伪狂犬病病毒 g G蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。 1F6、2 B9培养上清及小鼠腹水效价(EL ISA)分别为 1∶ 2 1 1 、1∶ 2 1 1 及 1∶ 10 0× 2 1 1 、1∶ 10 0× 2 1 2 。 1F6、2 B9的染色体众数分别为 87(80～ 94 )、84 (81～ 87)。经间接 EL ISA鉴定 ,1F6、2 B9单抗分别属于 Ig G2 a、Ig G3亚类。1F6、2 B9与猪伪狂犬病病毒 Ea株感染细胞的间接免疫荧光试验结果表明 ,1F6、2 B9确实为伪狂犬病病毒 g G蛋白的单抗。所得单抗与牛传染性鼻气管炎病毒 (IBRV)、猪细小病毒 (PPV)、猪繁殖与呼吸道综合征病毒 (PRRSV)之间无交叉反应     

禽呼肠孤病毒σB蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为了制备禽呼肠孤病毒(ARV)σB蛋白的单克隆抗体,以实验室保存的融合蛋白His-σB为免疫原免疫BALB/c小鼠,经过融合、筛选、亚克隆后,获得2株能稳定分泌抗σB蛋白单克隆抗体的特异性杂交瘤细胞株,分别命名为3C3、4H11。经间接ELISA方法测定,2株单抗的亲和力解离常数分别为5.17×10-10和5.04×10-10,均为高亲和力抗体。2株单抗的重链类型分别为Ig G2a和Ig G2b。间接免疫荧光和Western Blot结果分析表明,该两株单抗均能特异性识别ARV感染DF-1细胞后产生的σB蛋白。以Western blot方法利用单抗检测不同截短的σB蛋白,初步确定3C3、4H11两株单抗抗原识别表位分别位于101 aa~120 aa之间和121 aa~140 aa之间。该单抗为检测ARV及研究ARVσB蛋白的生物学功能奠定了基础。     

猪伪狂犬病毒变异株单克隆抗体的制备与鉴定

为制备猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)变异毒株的单抗,以纯化灭活的PRV JS-2012毒株免疫BALB/c雌性小鼠。经间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence assay,IFA)筛选,获得2株稳定分泌PRV单抗的杂交瘤细胞:4D8、4F10。2株单抗经亚型鉴定均为Ig G1亚类,轻链为κ链,腹水IFA效价均达1:51 200;IFA与IHC结果显示,二者均能与PRV毒株发生特异性反应;Western blot结果表明,4D8与PRV反应条带大小约为60 k Da,而4F10不与PRV发生反应,推测其可能针对PRV的构象性抗原表位。该单抗的制备对PRV的抗原变异及诊断研究均有重要意义。     

猪细小病毒核衣壳VP2蛋白单克隆抗体的制备及部分特性鉴定

以纯化的PPV重组VP2蛋白免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合技术,间接ELISA筛选和3次以上细胞克隆,获得了5株稳定分泌抗PPV VP2蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为2D5、1F11、2B4、3C8、1 H3。其染色体平均数均为87～102条,分泌抗体亚类4株为Ig M类,1株为IgG类,Western blot检测表明,5株单抗均识别猪细小病毒VP2蛋白;间接免疫荧光鉴定表明,5株单抗均与PPV全病毒发生反应;间接ELISA鉴定与其他相关病毒的交叉反应性表明,制备的5株单抗不与TEGV、PRV和PEDV反应,表明所制备的抗体与猪细小病毒具有较强的特异性反应。     

伪狂犬病毒单克隆抗体的制备和鉴定

以伪狂犬病毒（PRV）作为免疫原,免疫BALB／c小鼠,融合之后经间接ELISA、IFA和IHC试验进行杂交瘤筛选,共获得2株能分泌针对PRV单克隆抗体（简称单抗）的杂交瘤细胞株。2株猪伪狂犬病毒单抗与猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒均无交叉反应,IFA结果显示单抗能与接种于猪睾丸细胞（ST）的PRV发生特异性反应,IHC结果显示单抗能用感染了PRV的猪神经组织发生反应,证实抗PRV单克隆抗体具有良好的特异性和敏感性,此结论为猪伪狂犬病毒抗原表位分析及相关抗原抗体诊断试剂盒的研制奠定了基础。     

传染性囊病病毒VP5蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

传染性囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus,IBDV)的非结构蛋白VP5在病毒感染细胞的不同阶段发挥着抑制或诱导细胞凋亡的重要作用。为制备抗血清I型IBDV VP5蛋白的单克隆抗体,取经His-VP5蛋白免疫4次的BALB/c小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合,3次亚克隆后获得2株能稳定分泌VP5蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为5EC7和2BE5。经间接ELISA测定,以上2株单抗的亲和力解离常数分别为1.14×10~(-10)和4.87×10~(-10),亚类分别为Ig G2a和Ig G1。通过Western Blot和间接免疫荧光试验检测,2株单抗均能识别IBDV感染DF-1细胞后产生的VP5蛋白。Western Blot试验表明,2株单抗识别的抗原表位区域为VP5 N-端的1~10 aa。该单抗为研究血清I型IBDV VP5蛋白的生物学功能及病毒致病机理奠定基础。     

猪伪狂犬病病毒HeN1株gB蛋白单克隆抗体的制备及B细胞线性表位鉴定

为制备抗猪伪狂犬病病毒(PRV)gB蛋白的单克隆抗体(MAb),本研究将PRV HeN1株全病毒免疫BALB/c小鼠,取免疫后小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,用间接免疫荧光方法筛选,获得了一株稳定分泌抗PRV g B蛋白的杂交瘤细胞株1E7。Western blot结果显示,MAb 1E7与PRV全病毒和真核表达的g B蛋白均能够反应。阻断ELISA试验显示MAb 1E7与PRV的结合可以被猪阳性血清阻断。抗体亚类鉴定显示MAb 1E7的重链为Ig G2b亚类,轻链为kappa链。利用大肠杆菌原核表达系统,表达一系列截短的g B蛋白,最终确定1E7识别的抗原表位是~(81)SAEESLE~(87)。序列分析和western blot结果表明该表位在各PRV病毒株间相对保守。该MAb的制备为建立具有广泛适用性检测PRV野毒感染和疫苗免疫效果评价的阻断ELISA方法奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体的研制

以猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)JYC株全病毒作为免疫原,免疫BALB/c小鼠,融合后经间接ELISA进行杂交瘤筛选,共获得4株能分泌针对PRRSV单克隆抗体(简称单抗)的杂交瘤细胞株,分别命名为2G7、6G7、7F2和7E8,其亚类均为IgG1;单抗腹水的间接ELISA效价分别为10×215、10×211、10×215、10×214;间接ELISA试验结果表明,4株单抗与实验室保存的江苏地区临床分离的12株PRRSV以及VR-2332均发生特异性反应,而与猪常见其他病毒如猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(HCV)、猪圆环病毒2(PCV2)均无反应性;间接荧光试验表明,4株单抗与Marc-145细胞感染的PRRSV均呈特异性的荧光反应。因此这些单抗均可用于ELISA方法以及间接荧光试验,从而为建立快速、敏感的PRRSV的抗原检测方法奠定了基础。     

猪伪狂犬病病毒变异毒株gE和gB蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为建立猪伪狂犬病病毒(PRV)疫苗免疫抗体与病毒感染抗体鉴别诊断方法,分别以PRV变异毒株的gE或gB重组蛋白免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)和酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选所需单克隆抗体,获得6株抗PRV gE蛋白的单抗(3E6、7E1、7C5、10C3、15C1、14C1)和6株抗PRV gB蛋白的单抗(1C1、5D2、2F11、5G8、10C7、8H5)。IPMA检测结果显示,gE蛋白单抗能识别PRV变异毒株,但不识别疫苗株;而gB蛋白单抗可同时识别PRV变异毒株和疫苗株。gE单抗10C3和gB单抗10C7的ELISA效价和IPMA效价均分别达1∶5×10~(5.0)和1∶8×10~(3.0)以上。所筛选出的单抗均不与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、流行性乙型脑炎病毒(JEV)等其他常见病毒发生交叉反应。gE蛋白和gB蛋白的表达及单抗的制备为PRV感染抗体与疫苗免疫抗体鉴别诊断(DIVA)试纸的研发奠定基础。