SIRT1对牛卵泡颗粒细胞凋亡及雌激素分泌的影响

本实验旨在研究沉默信息调节因子1(SIRT1)对牛卵泡颗粒细胞凋亡及雌激素分泌的影响。构建SIRT1基因干扰载体,并转染体外培养的颗粒细胞。实验分为转染SIRT1-sh RNA的干扰组、转染NC-sh RNA的对照组和未转染的空白组,每组设3个重复。流式细胞术检测细胞凋亡;实时荧光定量PCR检测细胞内Bax、Bcl-2 m RNA表达;Western Blot检测细胞内Bax、Bcl-2蛋白表达;ELISA试剂盒检测雌激素水平。结果表明:干扰组颗粒细胞SIRT1 m RNA表达量显著低于对照组与空白组(P0.05),而对照组与空白组之间差异不显著(P0.05);干扰组颗粒细胞凋亡率显著低于对照组与空白组(P0.05);干扰组颗粒细胞Bax m RNA和蛋白质表达显著低于对照组与空白组(P0.05),而Bcl-2 m RNA和蛋白质表达均显著高于对照组与空白组(P0.05);干扰组颗粒细胞培养液中雌激素含量显著低于对照组与空白组(P0.05)。SIRT1基因可以促进牛卵泡颗粒细胞的凋亡,并促进雌激素分泌。     

PTEN基因过表达对犬乳腺肿瘤细胞系CHMm增殖及Bcl-2、Bax基因调控的影响

为探讨过表达的第10号染色体同源丢失性磷酸酶-张力蛋白基因(PTEN)对犬乳腺肿瘤细胞系(CHMm)增殖及Bcl-2、Bax基因的影响,本研究构建了PTEN表达质粒pc DNA-PTEN,采用脂质体转染法将其导入CHMm细胞系,采用western blot检测PTEN蛋白表达情况,CCK-8法检测CHMm细胞增殖情况,荧光定量PCR检测Bcl-2和Bax的基因表达情况。结果显示,转染PTEN的CHMm细胞组的PTEN蛋白表达水平显著高于空载体组和未转染组;转染PTEN细胞组的细胞增殖显著低于空载体组和未转染组(p0.05);转染PTEN的CHMm细胞组Bcl-2的m RNA表达水平显著低于空载体组和未转染组(p0.05);转染PTEN的CHMm细胞组Bax的m RNA表达水平显著高于空载体组和未转染组(p0.05)。本实验将PTEN基因导入犬乳腺肿瘤细胞系(CHMm),抑制犬乳腺肿瘤细胞增殖,为寻找乳腺肿瘤基因治疗新方法提供依据。     

RNA干扰DGAT1和DGAT2在猪肝细胞和肌内前体脂肪细胞中表达的研究

本研究旨在探索DGAT1和DGAT2基因表达对猪脂肪沉积效率的影响。以3日龄宗地花猪为实验动物,针对DGAT1和DGAT2基因m RNA序列设计6对sh RNA序列,构建RNA干扰表达载体,将DGAT1和DGAT2的sh RNA干扰载体分别转染至猪的肝细胞和肌内前体脂肪细胞中,采用RT-q PCR筛选出肝细胞和肌内前体脂肪细胞中的最佳sh RNA干扰载体,将最佳干扰载体再次转染肝细胞和肌内前体脂肪细胞,测定细胞代谢液中甘油三酯和总胆固醇含量变化。结果表明:所构建的干扰载体对肝细胞中DGAT1和DGAT2基因的最高抑制效率分别为78.45%和87.52%,对肌内前体脂肪细胞中DGAT1和DGAT2基因的最高抑制效率分别为82.24%和89.82%;肝细胞和肌内前体脂肪细胞培养液中甘油三酯和总胆固醇的含量均降低,其中转染p GPU6/GFP/Neo-DGAT2-1实验组的肝细胞培养液中甘油三酯含量显著低于空白组(P0.05)。结果提示,抑制DGAT1和DGAT2基因的表达,可降低猪肝细胞和肌内前体脂肪细胞代谢液中甘油三酯和总胆固醇的含量。     

INHA基因干扰对马关无角山羊卵巢颗粒细胞的影响

为了揭示INHA基因在马关无角山羊卵泡发育过程中的作用,为山羊多胎性状的研究提供理论依据,以高繁殖力地方品种--马关无角山羊的卵巢颗粒细胞为研究对象,采用siRNA技术,对卵巢颗粒细胞所分泌的糖蛋白激素基因INHA进行了干扰,Western blot法检验了干扰后INHA蛋白的表达量,Real-time PCR法检测了干扰后凋亡家族主要基因、主要生长因子及激素受体的mRNA表达量变化。Western blot结果显示,干扰48h后的INHA蛋白的表达量极显著低于正常组和阴性对照组(negative control,NC)(P0.01);Real-time PCR结果显示,凋亡促进基因Bax在转染后,表达量极显著低于正常组和NC组(P0.01),凋亡抑制基因bcl-2和bcl-xl基因在转染后,表达量极显著高于正常组和NC组(P0.01);主要生长因子IGF-1和IGF-2基因在转染后,mRNA的表达量明显减少(P0.01),其中IGF-1的表达量降低最为明显;激素受体FSHR和LHR基因mRNA的表达量极显著低于正常组和NC组(P0.01)。由此推测,INHA基因可能是通过影响卵巢颗粒细胞凋亡/增殖,进而影响了卵泡的发育。     

β-伴大豆球蛋白通过上调NOD样受体蛋白-3表达诱导猪小肠上皮细胞焦亡

本试验旨在探讨β-伴大豆球蛋白通过上调NOD样受体蛋白-3(NLRP-3)表达诱导猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)焦亡的作用机制。利用慢病毒转染IPEC-J2沉默目的基因NLRP-3,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和蛋白质印迹法(Western blot)验证目的基因沉默效果。慢病毒转染成功沉默目的基因NLRP-3后,将样本分为4组:A组为对照组(未转染),B组为阴性对照组(转染慢病毒空载体),C组为干扰组(转染携带NLRP-3干扰片段的慢病毒载体),D组为β-伴大豆球蛋白调节组(转染携带NLRP-3干扰片段的慢病毒载体+10 mg/mL的β-伴大豆球蛋白)。利用细胞增殖毒性检测试剂盒检测细胞活性;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)和白细胞介素-1β(IL-1β)含量;脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)观察细胞阳性变化;透射电镜观察细胞形态;RT-qPCR和Western blot检测NLRP-3、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、Caspase-1、IL-1β和消皮素D(GSDMD)的mRNA相对表达量及蛋白表达水平。结果表明:1)与A组相比,B组的NLRP-3 mRNA相对表达量及蛋白表达水平无显著差异(P0.05)。C组细胞NLRP-3 mRNA相对表达量及蛋白表达水平均极显著低于A组和B组(P0.01)。2)与A组相比,C组细胞Caspase-1含量显著降低(P0.05),IL-1β含量极显著降低(P0.01),NLRP-3、ASC、Caspase-1、IL-1β、GSDMD mRNA相对表达量和蛋白表达水平显著降低(P0.05)。3)与B组相比,C组细胞Caspase-1和IL-1β含量极显著降低(P0.01),NLRP-3、ASC、Caspase-1、IL-1β、GSDMD mRNA相对表达量和蛋白表达水平显著降低(P 0.05)。4)与C组相比,D组细胞活性极显著降低(P 0.01),IL-1β和Caspase-1含量极显著升高(P0.01),TUNEL染色显示细胞呈阳性表达,透射电镜观察可见D组细胞肿胀、细胞膜破裂、胞浆内容物流出,线粒体变性肿胀,NLRP-3、ASC、Caspase-1、IL-1β和GSDMD mRNA相对表达量和蛋白表达水平显著升高(P0.05)。综上所述,β-伴大豆球蛋白上调NLRP-3表达,并通过NLRP-3/Caspase-1/GSDMD信号通路介导IPEC-J2细胞焦亡。     

肿瘤转移抑制因子(Kisspeptin)对牛卵巢颗粒细胞凋亡的影响

肿瘤转移抑制因子(Kisspeptin)在颗粒细胞上有表达,但其对颗粒细胞凋亡的作用尚不清楚,本试验旨在利用流式细胞术和荧光定量PCR的技术研究Kisspeptin对牛卵巢颗粒细胞凋亡的影响。向DMEM-F12培养液中分别添加0、100 nmol/L的Kp-10培养牛颗粒细胞,24 h后收集细胞,用流式细胞技术检测细胞凋亡和细胞周期,用荧光定量PCR技术检测Caspase-3、Bcl-2、Fas和Fasl的m RNA表达。结果表明:Kisspeptin可显著促进牛颗粒细胞凋亡,且伴随着Caspase-3、Fas和Fasl m RNA表达上调及Bcl-2 m RNA表达下调(P0.01);流式细胞分析表明,Kisspeptin可使牛颗粒细胞在G1期增加、S期下降(P0.05)。研究结果说明,Kisspeptin可促进牛颗粒细胞凋亡,这一作用可能通过上调促凋亡基因Caspase-3、Fas、Fasl和下调抗凋亡基因Bcl-2的m RNA表达实现。     

线粒体融合蛋白2基因干扰与过表达对布鲁氏菌诱导巨噬细胞凋亡的影响

[目的] 试验旨在探究线粒体融合蛋白2（MFN2）基因干扰与过表达对布鲁氏菌诱导小鼠巨噬细胞凋亡的影响。[方法] 利用RNA干扰技术设计3条特异性针对MFN2基因的siRNA序列（siMFN2-450、siMFN2-1661、siMFN2-2275）和1条阴性干扰序列（siMFN2-Negative）;利用空质粒pcDNA3.1-EGFP通过过表达技术构建1个重组质粒pcDNA3.1-EGFP-MFN2。双酶切法鉴定过表达重组质粒pcDNA3.1-EGFP-MFN2,通过实时荧光定量PCR和Western blotting检测筛选最佳干扰序列并鉴定重组质粒的过表达效率,使用筛选出的最佳干扰序列和鉴定过表达后的重组质粒分别构建MFN2基因干扰及过表达的转染巨噬细胞模型;用牛种布鲁氏菌疫苗株A19侵染巨噬细胞,按照细菌数：细胞个数=100：1的比例侵染24 h,通过实时荧光定量PCR和Western blotting检测B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）相关X蛋白（BAX）的表达情况,用流式细胞术检测细胞凋亡情况。[结果] 双酶切结果显示,pcDNA3.1-EGFP-MFN2过表达重组质粒构建成功;实时荧光定量PCR和Western blotting结果显示,siMFN2-1661组MFN2的表达极显著降低（P<0.01）,pcDNA3.1-EGFP-MFN2组MFN2的表达极显著增加（P<0.01）,成功构建干扰及过表达MFN2基因的转染巨噬细胞模型;布鲁氏菌侵染干扰MFN2基因表达的巨噬细胞后,BAX蛋白表达水平显著高于siMFN2-Negative组（P<0.05）,BAX转录水平和细胞凋亡率极显著高于siMFN2-Negative组（P<0.01）;布鲁氏菌侵染过表达MFN2基因的巨噬细胞后,BAX的转录及蛋白表达水平均显著低于pcDNA3.1-EGFP组（P<0.05）,细胞凋亡率极显著低于pcDNA3.1-EGFP组（P<0.01）。[结论] 本试验结果表明,干扰MFN2基因的表达会增强布鲁氏菌诱导细胞凋亡的能力,而过表达MFN2基因则会抑制布鲁氏菌诱导细胞凋亡的能力,结果可为研究MFN2基因的生物学功能提供参考,为进一步解析布鲁氏菌的致病机制提供理论基础。     

靶向抑制MAP3K1对小鼠乳腺癌细胞生物学行为的影响

为了在细胞学水平研究靶向抑制MAP3K1(mitogen-activated protein kinase kinase kinase 1)基因对小鼠乳腺癌4T1细胞黏附、运动及侵袭能力等生物学行为的影响,试验用体外构建靶向"沉默"MAP3K1基因的amiRNA(artificial microRNA)干扰载体,以X-treme GENE HP转染4T1细胞(干扰组转染amiRNA干扰载体,对照组转染空载体,空白组未转染质粒)对MAP3K1基因mRNA及蛋白表达水平进行检测,以测定干扰效率;分别以黏附试验检测小鼠乳腺癌4T1细胞的黏附能力,用划痕-愈合试验与Transwell侵袭试验测定小鼠乳腺癌4T1细胞的运动与侵袭能力。结果表明:小鼠乳腺癌4T1细胞转染MAP3K1 amiRNA-3干扰载体与空载体后,干扰4T1细胞MAP3K1 mRNA水平及蛋白水平均被有效抑制,干扰效率高达70%(P0.01)。试验组4T1细胞黏附能力极显著低于对照组(P0.01);干扰组4T1细胞的运动与侵袭能力均显著低于对照组(P0.05)。说明构建的amiRNA干扰载体能够有效抑制靶基因MAP3K1的表达,并能够显著抑制小鼠乳腺癌4T1细胞的黏附、运动与侵袭能力;靶向抑制MAP3K1基因能够广泛地影响小鼠乳腺癌4T1细胞的生物学行为。     

CLC对冻融牛精子体外获能及抗氧化、抗凋亡能力的影响

本研究目的是评价CLC对牛冻融精子获能、抗氧化及抗凋亡能力的影响。试验分对照组和CLC处理组(0.5、1.0、1.5及2.0 mg/mL),检测冻融牛精子体外获能后的酪氨酸磷酸化水平以及冻融牛精子抗氧化基因和细胞凋亡基因的表达。结果:1)在0.5 mg/mL CLC处理组冷冻效果最好,与对照组和1.0 mg/mL CLC处理组相比无显著差异;2)冻融牛精子获能处理后,在1.0 mg/mL CLC处理组精子蛋白酪氨酸磷酸化水平最高,与对照组相比无显著差异;3)在0.5 mg/mL CLC处理组冻融牛精子抗氧化基因CAT、GPX和SOD的表达量与对照组相比显著升高(P<0.05);4)在0.5和1.0 mg/mL CLC处理组凋亡基因Caspase-3、Caspase-8和BAX的表达量与对照组相比显著降低(P<0.05)。结论:添加CLC可以改进冻融牛精子获能和抗氧化、抗凋亡能力。     

miR-18b-3p靶向SCD调控绵羊前体脂肪细胞分化的研究

本实验旨在研究miR-18b-3p及其靶基因SCD调控绵羊前体脂肪细胞分化的作用机制。采集3日龄公羊背最长肌,培养绵羊前体脂肪细胞并进行诱导分化,采用油红O染色检测细胞分化情况;通过TargetScan预测miR-18b-3p的靶基因,通过qRT-PCR测定miR-18b-3p、靶基因SCD以及分化标志基因PPARγ、CEBPα在分化过程中的时序性表达;分别转染miR-18b-3p过表达载体(mimics)或抑制载体(inhibitor)及阴性对照至前体脂肪细胞后,通过qRT-PCR及Western blot检测miR-18b-3p对SCD以及分化标志基因表达量的作用;采用双荧光素酶证明miR-18b-3p是否靶向SCD基因。结果表明:miR-18b-3p在分化过程中的表达量先上升后下降,在第6天表达量最高;SCD表达量低于阴性对照组(P0.01),PPARγ及CEBPα基因表达量均低于阴性对照组(P0.05),SCD蛋白表达量低于阴性对照组(P0.01),油红O染色面积减少(P0.05);转染miR-18b-3p inhibitor后,SCD、CEBPα基因表达量均高于阴性对照组(P0.01),PPARγ基因表达量高于阴性对照组(P0.05),SCD蛋白表达量高于阴性对照组(P0.01),油红O染色面积增加(P0.05);miR-18b-3p对SCD基因具有直接靶向作用。本实验首次在绵羊上证明miR-18b-3p可以通过靶向SCD抑制前体脂肪细胞分化,为绵羊选育给予分子育种技术支撑。     

腺病毒介导shRNA干扰绵羊MSTN基因效果及对生肌调节因子和干扰素反应基因表达的影响

旨在进一步揭示MSTN在绵羊成肌细胞中的调控机制,制备可有效失活MSTN基因的工具,为通过RNA干扰技术提高绵羊产肉量提供方法和理论依据。本研究以绵羊成肌细胞为试验材料,构建特异靶向绵羊MSTN基因的shRNA干扰质粒载体,将干扰效果好的质粒进一步包装为重组腺病毒,转染细胞后采用qRT-PCR和Western blot检测MSTN基因以及生肌调节因子和干扰素反应基因的表达。结果表明,质粒ShR218和ShR511干扰MSTN基因效率分别达到35%和48%,双元干扰质粒ShR3+4干扰效率最高达到85%。成功包装shRNA重组腺病毒载体Sh511和Sh3+4,病毒滴度达到1×10~8 pfu·mL~(-1),对成肌细胞的感染效率达到90%以上。Sh511和Sh3+4对MSTN基因mRNA的表达抑制分别达到53%和76%,对蛋白表达抑制分别达到55%和64%。MSTN基因沉默后,伴随着Myf5、MyoD、MyoG、Myf6基因mRNA水平的极显著性下调(P0.01),但只引起MyoG蛋白水平极显著升高(P0.01),未引起Myf5、MyoD、Myf6蛋白水平的显著变化;腺病毒感染成肌细胞未引起OAS1基因mRNA水平的显著变化,但引起IFNGR1基因mRNA水平的极显著升高(P0.01),对二者蛋白水平均无显著影响。本研究成功构建靶向MSTN基因的shRNA腺病毒载体,能有效抑制成肌细胞MSTN的mRNA和蛋白表达,并影响生肌调节因子Myf5、MyoD、MyoG、Myf6基因和干扰素受体基因IFNGR1表达。     

牛化脓隐秘杆菌病肾脏Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bax和Bcl-2的表达

通过研究牛化脓隐秘杆菌感染牛肾脏组织的病理学变化及检测Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bax和Bcl-2的表达,来确定牛肾脏组织的坏死和细胞凋亡情况。本研究首先筛检5头自然感染化脓隐秘杆菌病牛和2头阴性健康对照牛,采集其肾脏组织样本。采用H.E.染色法观察病理组织学变化;采用免疫组织化学方法来检测肾脏组织中与细胞正负凋亡有关的调节基因Bax和Bcl-2的表达情况以及凋亡通路蛋白Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的表达情况。结果显示,感染牛肾脏组织有坏死,间质有中性粒细胞浸润;感染组牛肾脏肾小球内皮细胞和肾小管上皮细胞Bax、Caspase-3和Caspase-9表达呈阳性,与对照组相比,差异显著;有少量肾小管上皮细胞、肾小球内皮细胞Caspase-8和Bcl-2表达呈阳性,但与对照组相比差异不显著。结果表明,化脓隐秘杆菌能够引起牛肾脏组织实质细胞发生坏死和凋亡,且以线粒体凋亡途径为主。     

MEF2C基因RNA干扰质粒的构建及干扰效率测定

为了构建猪MEF2C基因的RNA干扰重组质粒,并筛选出最佳干扰效率的序列,本试验采用RNAi技术,设计并合成了3条针对猪MEF2C基因的RNA干扰序列,构建了RNA干扰重组质粒(命名为siRNA-1,siRNA-2,siRNA-3),将其转染到小鼠C2C12细胞,并用实时定量PCR检测细胞中MEF2C基因mRNA的表达,Western blot测定细胞中MEF2C基因蛋白的表达。结果表明:重组质粒经PCR扩增后显示产物大小与预期一致,产物经双酶切及测序鉴定该序列与NCBI提供的序列一致。重组质粒转染C2C12细胞后,MEF2C基因mRNA表达受到不同程度抑制,抑制率分别为(33.67±2.51)%、(21.00±3.60)%、(71.67±4.04)%。Western blot结果表明MEF2C基因蛋白表达受到不同程度抑制,抑制率分别为(47.33±0.05)%、(38.25±0.16)%、(67.27±0.12)%。本试验成功构建猪MEF2C基因干扰重组质粒,最终确定干扰质粒(siRNA-3)具有最佳干扰效果,证实MEF2C基因的干扰质粒能有效抑制目的基因mRNA和蛋白的表达,为探讨该基因与肌肉肉质性状的关系提供理论基础。     

牛PSMA5基因RNA干扰载体的构建与筛选及在奶牛乳腺上皮细胞中的表达

设计4条待选的shRNA序列以及1条阴性对照序列,构建RNA干扰载体,然后转染到奶牛乳腺上皮细胞(MAC-T)中,最后利用实时荧光定量PCR和Western blotting技术分别检测蛋白酶体α5亚基(PSMA5)在奶牛乳腺上皮细胞(MAC-T)中mRNA和蛋白水平的表达。结果显示:转染shRNA-1组,shRNA-3组和shRNA-4组的PSMA5基因相对表达量显著低于阴性对照组(P0.05),且shRNA-4组的PSMA5基因相对表达量最低。结果表明:本试验成功构建并筛选出了PSMA5基因RNA干扰载体,并在奶牛乳腺上皮细胞(MAC-T)中成功表达。     

RNA结合蛋白QKI抑制ST细胞凋亡的研究

QKI是信号转导与RNA激活家族(STAR)成员之一,是进化保守的调控蛋白。其KH结构域能与RNA上的quaking反应元件(QRE)结合,参与调控RNA的运输、翻译、剪切、稳定等过程,从而影响细胞增殖、分化、凋亡等。本试验探究QKI是否对猪睾丸成纤维细胞(ST细胞)凋亡存在影响。构建pEF1α-QKI过表达载体,采用qRTPCR、Western blot方法检测QKI及目的基因BCLAF1的mRNA和蛋白的表达量,用流式细胞术检测过表达QKI对ST细胞凋亡的影响。结果显示:转染pEF1α-QKI质粒在ST细胞中可显著提高QKI mRNA的表达量(P<0.01),并且与对照组相比能显著降低BCLAF1mRNA和蛋白的表达量(P<0.05);流式细胞术检测细胞凋亡率证明过表达QKI具有抑制ST细胞凋亡的作用(P<0.05)。结果表明:在ST细胞中过表达QKI能够抑制BCLAF1基因的表达,并且降低ST细胞凋亡率。     

miR-10b对牛卵巢颗粒细胞凋亡的影响

颗粒细胞是卵巢中必需的体细胞,在卵泡发育过程中起重要作用。为探究miR-10b对牛卵巢颗粒细胞凋亡的影响,本实验中2个处理组分别转染miR-10b模拟物(miR-10b mimics)和miRNA模拟物(mimics NC),转染48h后,通过Quantitativereal-timePCR(qRT-PCR)检测内源miR-10b表达量,明确miR-10b mimics转染成功。利用qRT-PCR和Western Blot检测凋亡相关蛋白Caspase-3、Bcl-2和Bax表达量的变化;利用流式细胞术检测颗粒细胞凋亡率。结果显示:与mimics NC组相比,miR-10b mimics组Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平显著降低,Bax和Caspase-3 mRNA和蛋白表达水平显著升高;同时miR-10b mimics组的细胞凋亡率较mimics NC组显著升高。结果表明,miR-10b可促进牛卵巢颗粒细胞凋亡。     

ASH1L甲基转移酶在牛卵丘细胞中的表达与功能研究

旨在探究缺失、小的、同源异形1(absent, small, or homeotic 1-like,ASH1L)甲基转移酶在牛卵丘细胞中的表达与功能。本研究通过免疫荧光染色在健康母牛卵丘细胞中对ASH1L甲基转移酶进行定位,并分析细胞的组蛋白H3第36位赖氨酸(histone H3 lysine36, H3K36)甲基化修饰模式;合成靶向Ash1L基因的siRNA,对siRNA-1、 siRNA-2、siRNA-3及对照组进行荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹,筛选有效siRNA;采用荧光定量PCR分析干扰Ash1L表达对处理组及对照组中凋亡相关基因及多梳抑制复合体(polycomb repressive complex 2, PRC2)组成基因的表达水平的影响。结果显示,ASH1L甲基转移酶位于牛卵丘细胞的细胞核中,呈点状分布。成功筛选到能有效干扰牛Ash1L基因的siRNA-2,其干扰效率为60%～70%。将siRNA-2转染卵丘细胞后,该干扰组细胞中H3K36的单甲基化、二甲基化及三甲基化3种甲基化水平均显著低于对照组(P0.05);干扰Ash1L导致凋亡相关基因Bax、Bcl-2及caspase-3表达水平显著上调,凋亡基因Bax和caspase-3表达量高于抗凋亡相关基因Bcl-2(1.311和1.179 vs 1.146);同时,干扰Ash1L基因表达也引起PRC2蛋白亚基EZH2和Suz12基因的mRNA表达量显著升高(P0.05)。综上所述,本研究探讨了ASH1L甲基转移酶在牛卵丘细胞中的表达和功能,ASH1L在牛卵丘细胞中呈点状分布,且Ash1L基因的抑制导致H3K36me1/2/3水平均显著下降及凋亡基因和PRC2蛋白相关亚基EZH2和Suz12基因表达的升高,为进一步研究其对家畜胚胎的调控作用提供技术和理论基础。     

小尾寒羊SP1基因克隆及其对前体脂肪细胞分化的影响

试验旨在对小尾寒羊特异性蛋白1（specificity protein 1,SP1）基因进行克隆和序列分析,并研究SP1基因对前体脂肪细胞分化的影响。选取1月龄小尾寒羊尾部脂肪组织进行前体脂肪细胞的分离、培养和诱导分化;用重叠PCR法克隆SP1基因编码区（coding DNA sequence,CDS）;用生物信息学软件分析SP1基因CDS,并对其编码蛋白的结构、功能结构域、亚细胞定位、翻译后修饰进行预测;用慢病毒包装SP1基因过表达、干扰及对照质粒转染293T细胞后,收取病毒液感染小尾寒羊前体脂肪细胞;用油红O染色检测脂滴沉积能力;用实时荧光定量PCR检测SP1基因和成脂标志基因的mRNA表达量。结果表明,小尾寒羊SP1基因CDS全长2 340 bp,编码779个氨基酸;序列相似性分析显示,小尾寒羊SP1基因CDS及其编码序列与绵羊、山羊的相似性最高,其次是牛、马、猪、人、小鼠、大鼠,与鸡的相似性最低,系统进化分析结果与之相符;SP1蛋白定位于细胞核,有109个磷酸化位点,其二级结构由α-螺旋、β-转角、无规则卷曲和延伸链4种结构组成,所占比例分别为16.94%、8.60%、54.17%和20.28%,二级结构和三级结构均存在3个锌指结构域;过表达、干扰及对照质粒转染293T细胞,每组细胞皆出现较强绿色荧光,载体成功转染至293T细胞;病毒液感染小尾寒羊前体脂肪细胞并分化12 d后,过表达组SP1基因表达量极显著高于对照组（P<0.01）,干扰组SP1基因表达量极显著低于对照组（P<0.01）;过表达SP1基因极显著上调成脂标志基因mRNA的表达量（P<0.01）,产生更多脂滴;干扰SP1基因则结果相反。因此,SP1基因对小尾寒羊尾部前体脂肪细胞分化具有正向调控的作用。     

化脓隐秘杆菌病牛肺脏中Caspase-8、Caspase-9和Caspase-3蛋白表达

为了研究化脓隐秘杆菌致牛肺脏细胞凋亡途径,试验对自然感染奶牛肺脏和阴性对照牛肺脏进行取样,并制作病理组织切片和进行苏木素伊红染色,观察肺脏的病理组织学变化;同时采用免疫组织化学的方法检测肺脏中Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9蛋白的表达情况。结果表明:化脓隐秘杆菌可以引起牛肺脏发生化脓和坏死;与阴性对照牛肺脏相比,奶牛化脓隐秘杆菌病肺脏的Caspase-9和Caspase-3蛋白表达差异显著(P0.05),Caspase-8蛋白表达差异不显著(P0.05)。说明化脓隐秘杆菌能够引起奶牛肺脏化脓、肺脏细胞坏死和凋亡,并且以线粒体信号途径介导的凋亡途径占主导。     

干扰lnc0803基因对牛骨骼肌卫星细胞增殖与分化的影响

为了探究lncRNA对牛骨骼肌卫星细胞(MSCs)增殖及成肌分化的影响,试验选择前期通过高通量测序技术获得的一个牛MSCs分化前后表达差异的lnc0803基因,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术验证测序获得的牛MSCs分化前后表达差异倍数;Ensembl数据库比对分析lnc0803基因的生物信息学特征;以及通过细胞核质分离试验后的实时荧光定量PCR对lnc0803基因进行亚细胞定位;并设计合成lnc0803基因的干扰RNA(siRNA),筛选有效的siRNA转染牛MSCs,采用EdU染色方法检测干扰lnc0803基因对牛MSCs增殖的影响;进一步对牛MSCs进行体外成肌诱导分化,采用实时荧光定量PCR和Western-blot分别检测分化标志因子肌细胞生成素(MyoG)和肌球蛋白重链(MyHC)的基因及蛋白表达水平,从而综合分析干扰lnc0803基因对牛MSCs成肌分化的影响。结果表明:诱导分化后的牛MSCs中lnc0803基因的表达量比增殖期高2.26倍;lnc0803基因由牛基因组的28号染色体转录而来,是一条不具有蛋白编码能力的长链非编码RNA,在牛MSCs的细胞质和细胞核中均有分布;牛MSCs干扰lnc0803基因表达后,EdU阳性细胞比率极显著下降(P0.01),显示下调lnc0803基因表达可以抑制牛MSCs的增殖;成肌诱导分化后,分化标志因子MyoG与MyHC在基因表达水平均极显著升高(P0.01),MyoG蛋白表达水平显著升高(P0.05),MyHC蛋白表达水平极显著升高(P0.01),显示下调lnc0803基因表达可以促进牛MSCs的成肌分化。说明干扰lnc0803基因可以抑制牛MSCs增殖,并促进其成肌分化进程。