光生物素RNA探针:RNA/RNA杂交试验检测蓝舌病病毒

用国产光敏生物索标记20型蓝舌病病毒(BTV)全基因RNA,检测BTV、鹿流行性出血热病毒(EHDV)和实验感染绵羊的血样品。3、10、20、21型BTV RNA杂交阳性,与EHDV无交叉反应。0号感染羊的血样为阳性。试验表明,用乙二醛变性RNA样品,可检出10pg水平的BTV RNA样品,灵敏度高出热变性方法的10—100倍。 蓝舌病是由呼肠孤病毒科环状病毒属内的蓝舌病病毒引起的重要疾病。主要通过昆虫传播,感染反刍动物。本病上世纪发现于非洲,现在叫中东、北美、澳大利亚等国家和地区都有蓝舌病的报道。蓝舌病现有24个血清型,其痫毒的核酸由10个片段的双链RNA(dsRNA)组成。这些基因片段决定BTV衣壳蛋白的氨基酸序列上的差异。通常用补反、琼脂扩散或ELISA等血清学方法检查BTV抗体的存在。但这些方法除了敏感性低以外,一个重要缺陷是和EHDV等相关病毒存在交叉反应。K.R.E.Squire等人采用放射性同位素~(32)P,3'末端或5'末端标记全基因组BTV RNA作探针,检测BTV。P·P.C.Mertens和吴时友等,将基因组RNA用一定浓度的NaOH随机水解成150bp左右的片段,再进行末端标记,末端的增加使标记效率显著提高。由于同位素的使用受到经济和安全等方面的限制,为此我们采用非放射性的光生物素标记BTV RNA,打点杂交检测BTV,试验证明该方法是可行的。     

光生物素cDNA探针对体内外蓝舌病病毒感染的检测

蓝舌病病毒(BTV)基因的第三片段(RMA_3)在不同型间有较高的同源性.用光生物素标记的其cDNA重组体pC7,检测2～22型BTV BHK细胞培养物全部为阳性,而相关病毒EHDV_1、EHDV_2和Ibraki病毒为阴性;同一探针检测17个型BTV攻毒羊的全血样品均为阳性,未感染的正常羊血细胞和BHK细胞培养物样品均为阴性.     

用~(32)P标记RNA5′末端探针检测蓝舌病病毒研究初报

目前世界上报导蓝舌病病毒(BTV)已有24个血清型,各型病毒的毒力不一致。由于蓝舌病病毒的基因序列漂移和基因重配列现象的存在,新的BTV血清型还有不断增加的趋势,这就给蓝舌病的研究和诊断带来了困难。近年来,不少国外学者应用核酸杂交技术来研究蓝舌病各型之间的相关性和进行病毒的检测。不少国家和地区用琼扩及其它血清     

蓝舌病病毒荧光定量RT-PCR检测技术

蓝舌病是一种侵害反刍动物的虫媒传染病,被世界动物卫生组织(Office International des Epizooties,OIE)列为上报疾病,我国将其列为一类动物疫病.本研究利用计算机软件分析获取蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)核酸检测的保守靶序列,设计引物和TaqMan荧光探针,建立了BTV荧光定量RT-PCR技术,进行了特异性、敏感性、重复性等实验评价,并对动物样品进行检验.结果显示,该技术可有效检出不同血清型BTV,与流行性出血病病毒(Epizootic hemorrhagic disease virus,EHDV)无交叉反应;对RNA标准品的检测灵敏度为102 copies;重复检测CV<5%,可对动物样品进行有效检测.因此,所建立的BTV TaqMan/荧光定量RT-PCR技术可为蓝舌病诊断提供一种快速、可靠的病原检测手段.     

蓝舌病自然感染病毒核酸、抗体转阳和病毒分离相关性研究

为了提高蓝舌病病毒(BTV)的分离效率,2015年在师宗县设置监控点,选择蓝舌病抗体阴性的10头牛和5只羊作为监控动物,5—10月份每周采血1次,每次每头动物分别采集常规全血、EDTA抗凝血和肝素抗凝血各1份,检测蓝舌病抗体、蓝舌病病毒核酸并进行病毒分离。结果表明:蓝舌病病毒核酸阳性可以持续4~5周,蓝舌病抗体阳性可以持续5~6周。BTV核酸开始转为阳性到核酸转阳后的第1周和第2周采集的肝素抗凝血,或者蓝舌病抗体转阳前1周到蓝舌病抗体转阳和蓝舌病抗体转阳后1周采集的肝素抗凝血BTV分离效果最佳。说明通过蓝舌病抗体检测或蓝舌病病毒核酸检测确定分离蓝舌病病毒最佳分离时间是可行的。     

反刍动物蓝舌病的诊断及防控措施

<正>蓝舌病是由蓝舌病病毒(Blue tongue vires,BTV)引起的反刍动物的一种急热性传染病。临床特征主要表现为病畜口鼻、胃肠道黏膜出现溃疡性炎症变化。该病可导致胎儿畸形、幼畜发育不良甚至死亡,给反刍养殖造成了巨大的经济损失。基于此,笔者结合实践经验,阐述了反刍动物蓝舌病的诊断和防控措施。1病原学本病的病原为蓝舌病病毒(BTV),BTV属于呼肠孤病毒科     

蓝舌病病毒分离株的定型研究

用国际标准蓝舌病病毒(BTV)型特异性血清和新制备的BTV型特异性血清,按OIE推荐方法进行蚀斑抑制试验,并试用“悬浮法”蚀斑抑制试验,对BTV分离株(L001)作了血清型鉴定,结果表明该分离株为BTV16型。与标准毒株相对照,两者试验结果完全一致;L001株的RNA的PAGE电泳带谱与BTV16型标准株的带谱相同。     

进境蓝舌病抗体阳性动物带毒分析及检疫处理研究

为评估进口蓝舌病病毒(BTV)抗体阳性动物的感染状态,分析其带毒风险,对从国外进口的9批19714头动物,无菌采集全血分离血清,采用竞争ELISA方法检测BTV抗体。对BTV抗体检测阳性的动物,采集抗凝血,采用OIE推荐的套式RT-PCR和荧光RT-PCR方法进行检测,同时将样品送往蓝舌病参考实验室进行病毒分离鉴定,以确定动物的蓝舌病感染状态。结果 9批动物中检出28头BTV抗体阳性动物,但核酸检测和病毒分离鉴定的结果均表明这些BTV抗体阳性动物并不携带有非感染性和感染性病毒粒子。结合9个批次的进口动物并无明显临床表现,且进口动物来源地也无蓝舌病(BT)的疫情发生,据此根据OIE《陆生动物卫生法典》条款,判定这些抗体阳性动物为带毒阴性。本研究通过对BTV抗体阳性动物的带毒分析,并结合OIE确定BTV感染的要求,对BTV口岸隔离检疫流程提出建议,以指导动物检疫工作,阻止病原经口岸传入。     

蓝舌病病毒蛋白结构与检测方法研究进展

<正>蓝舌病(Bluetongue, BT)是由蓝舌病病毒(Bluetongue virus, BTV)引起,经库蠓、伊蚊等媒介昆虫传播感染反刍动物的烈性非接触性传染病。1876年首次在南非被发现[1],1906年Theiler正式命名为"蓝舌病",将引起该病的病毒命名为蓝舌病病毒[2]。20世纪初,伴随国际贸易的发展,BT随后传入美洲、亚洲、欧洲等地,中国1979年首次发现该病的存在。BTV主要引起绵羊发病和死亡,牛和山羊常为隐性感染,反刍     

用斑点酶联免疫吸附试验测定蓝舌病抗体的研究

蓝舌病病毒(BTV)是具有多片段的双股RNA病毒,它是呼肠孤病毒科环状病毒属的代表毒株。迄今为止,已发现本病毒至少有24个血清型,并广泛流行于世界各国,对畜牧业的危害极大。本病的常规诊断方法是琼脂凝胶免疫扩散试验(AGID)。近年来不少学者又应用多克隆抗体和单克隆抗体先后建立了酶联免疫吸附试验(ELISA)     

亚洲璃眼蜱唾液腺差异表达基因文库的构建及分析

从单雌蜱克隆群中挑选未吸血雌蜱60只，随机分成两组。未吸血组直接剖取唾液腺．半饱血组于蜱吸血第5d采集，分离唾液腺。Trizol法提取总RNA，经第一链合成、LD—PCR、RasⅠ酶切、接头连接和抑制消减杂交（SSH）等步骤，获得差异表达基因的cDNA片段。将纯化的cDNA片段与pGEMT—Easv我体连接，转化DH5a，获得204个白色菌落。扩增检查表明，136个克隆含有插入片段，片段大小为250bp-850bm，测出有效序列120个。由10个cDNA片段的RT—PCR检查结果初步断定，本研究消减效果良好。由网上资源分析得：21个片段与其他蜱的基因，19个片段与按蚊、库蚊、钩虫、奥斯特线虫等其他吸血寄生虫的基因，9个与果蝇的基因具有同源性。     

鸡毒支原体抗体识别抗原的基因克隆和序列分析

抗体筛选阳性克隆,用EcoRI酶切回收3．6kb外源片段,测序。序列用大肠杆菌密码进行读框分析,至少有6个开放放阅读框,而在MG可能分为3个开放阅读框,同源性分析,发现序列的某些碱基主要与肺炎支原体、生殖支原体、山羊支原体和莱氏无胆甾原体的某些地方同源性高、没有同其他细胞或病毒有同源性的地方,说明克隆的基因完全是一个新的基因片段。     

减蛋综合征病毒33K蛋白基因克隆及结构分析

纯化的减蛋综合征病毒（ＥＤＳＶ）ＤＮＡ经ＨｉｎｄⅢ水解、０．８％琼脂糖电泳后,回收各ＤＮＡ条带并克隆至ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ载体,建立了ＥＤＳＶ基因文库,对３３Ｋ蛋白基因进行了分析。本研究证实,ＥＤＳＶ３３Ｋ蛋白基因含有２个外显子,与羊腺病毒（ＯＡＶ）３３Ｋ蛋白比较,Ｎ端编码产物的同源性为３０．８％,Ｃ端的为６０％。用ＲＴ－ＰＣＲ扩增３３ＫｍＲＮＡ和ｃＤＮＡ克隆及序列分析证实,ＥＤＳＶ３３Ｋ蛋白含有８２碱基（ｎｔ）的内含子,去掉内含子３３Ｋ蛋白基因能形成完整的ＯＲＦ,其编码产物由１７７氨基酸（ａａ）组成,推测分子质量为２．０６×１０４,与人５型腺病毒和ＯＡＶ的同源性分别为２８．１％和４４．７％。     

禽流感病毒A/Chicken/Mudanjiang/0823/00(H9N2) 株NS1基因的克隆及序列分析

用PCR方法,成功扩增出国内分离株禽流感病毒H9N2型非结构蛋白(NS1)基因cDNA,并将该片段连接到pMD 18-T载体上,转化TGI感受态细胞,在含氨苄青霉素的LB平板上筛选阳性克隆,提取质粒,经限制性内切酶鉴定,对目的片段进行测序,结果获得了NS1基因全长,约700bp.该片段的核酸序列与已知A/Chick/HongKong/1074/99(H9N2)、A/Chick/HongKong/1073/99(H9N2)毒株序列进行同源性比较,同源性皆为94.37%,氨基酸序列同源性分别为93.91%和93.48%.     

Primary structure of the 3'-terminal region of the RNA-polymerase gene in foot-and-mouth virus A22

This study was undertaken for the purpose of determining the primary structure of the 3' end gene of RNA polymerase of foot-and-mouth disease virus A22 550. Reported are isolation and purification of the virus, isolation of RNA, synthesis of cDNA, experience obtained from cloning as well as analysis of hybridisation and isolation of plasmid DNA. Nucleotide sequences, characterised by specific clones, were tested for potential needle structures. Also described are homology comparisons among FMD virus types A12, A10, O1, and C1.     

猪瘟病毒石门株基因组cDNA片断的扩增与克隆测序

以猪瘟病毒（ＨＣＶ）中国石门株强毒的血毒、细胞毒及Ｃ系兔化弱毒的细胞毒中提取的总ＲＮＡ为模板，应用逆转录─聚合酶链式反应（ＲＴ一ＰＣＲ），在合成的两对ＨＣＶ特异引物引导下，扩增出与预计大小一致的４４１和３００ｂｐ两个核酸片断。寡核苷酸探针杂交证实确为ＨＣＶＰ_８０和ｇｐ４４／４８蛋白编码区特异性的ｃＤＮＡ片断。扩增片断克隆入ｐＵＣ_１９和ｐＢＳＫ（＋）中，并对ＨＣＶ石门株Ｐ_８０区ｃＤＮＡ片断进行测序分析，其与国外Ａｌｆｏｒｔ、Ｂｒｅｓｃｉａ株同源性分别为９０．６％和９４．６％。氨基酸水平上同源性高达９８．４％。为抗猪瘟病毒Ｐ_８０区核酶的设计和应用提供了依据。     

H5、H7和H9亚型禽流感病毒多重反转录聚合酶链式反应检测方法的建立

参考GenBank登录的H5、H7和H9亚型禽流感病毒(AIV)的血凝素基因序列,利用DNAStar软件分析其同源性,利用Primer Premier5.0软件设计3对分别针对AIVH5、H7和H9亚型的特异性引物。3对引物所扩增的cDNA片段大小分别为427、228、830bp。结果显示,利用3对引物,通过对多重RT-PCR扩增条件的优化,建立了同时检测H5、H7和H9亚型AIV的多重RT-PCR技术。该方法对H5、H7和H9亚型AIV能同时扩增出3条大小分别为427、228、830bp的cDNA片段,与其他常见禽病病原不存在交叉反应。该方法对H5、H7和H9亚型AIVcDNA的最低检出量分别为10-4、10-2和10-4。结果表明,本试验建立了可同时检测鉴别H5、H7和H9亚型AIV的多重RT-PCR技术。     

狂犬病病毒3aG株核蛋白基因cDNA的克隆、序列分析及在COS细胞中的暂态表达

从狂犬病病毒 ３ａ Ｇ 株感染的 Ｂ Ｈ Ｋ 细胞裂解上清液中快速提取病毒 Ｒ Ｎ Ａ,用 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ 得到编码核蛋白完整结构基因的 ｃ Ｄ Ｎ Ａ。进一步将此基因克隆入 ｐ Ｕ Ｃ １８中,进行核苷酸序列分析,并与国外狂犬病病毒 Ｐ Ｖ、 Ｃ Ｖ Ｓ、 Ｓ Ａ Ｄ Ｂ１ ９ 株以及国内另一狂犬病病毒 ５ａ Ｇ 株的 Ｎ 基因序列进行了同源性比较。然后将 Ｎ 基因正向插入真核表达质粒中,转染 Ｃ Ｏ Ｓ７ 细胞,用免疫组化方法证明所克隆基因可在细胞中正确表达出 Ｎ 蛋白。