鸡HSP90AA1基因SNP检测及启动子区CpG岛的甲基化研究

试验旨在获得鸡热休克蛋白90α(HSP90AA1)基因序列并分析其基因结构和相关遗传变异,检测HSP90AA1基因启动子区CpG岛的甲基化状态,初步探索HSP90AA1基因在肌肉组织生长发育中的作用。以文昌鸡和北京油鸡为试验材料,利用PCR扩增鸡HSP90AA1基因组序列;通过基因测序寻找该基因中的单核苷酸多态性(SNP)位点;使用在线软件MethPrimer预测鸡HSP90AA1基因中CpG岛的位置;应用MassArray质谱法检测鸡胸肌中HSP90AA1基因启动子区CpG岛的甲基化水平,比较分析文昌鸡和北京油鸡HSP90AA1基因的甲基化差异。结果显示,在鸡HSP90AA1基因组中共发现7个SNPs位点,分别位于启动子区(A-189G,C-109T)、第1外显子(A+6G)、第2外显子(C+343T)、第2内含子(A+634G、A+836G)和第7内含子(A+3449G);鸡HSP90AA1基因包含10个外显子和9个内含子,其启动子区存在1个CpG岛,位于-1 802～-469bp处;在HSP90AA1基因启动子区共检测了42个CpG位点的甲基化水平,文昌鸡和北京油鸡中分别有9个(CpG_16.17.18、CpG_21.22.23、CpG_32.33和CpG_57)和4个CpG位点(CpG_1、CpG_5.6和CpG_57)在胸肌生长发育过程中发生甲基化改变。结果表明,文昌鸡与北京油鸡HSP90AA1基因序列信息和启动子区CpG岛的甲基化水平不同,这可能导致两种鸡对于应激反应具有不同的耐受程度。以上试验结果将为文昌鸡和北京油鸡生长发育规律、系统选育等方面的研究提供表观遗传学依据。     

鸡热休克蛋白70基因启动子区CpG岛的甲基化研究

为了获得鸡热休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)基因启动子区CpG岛的甲基化状态,初步探索HSP70基因在肌肉组织生长发育中的作用,试验以文昌鸡和北京油鸡为试验材料,采用MassArray质谱法检测鸡胸肌中HSP70基因启动子区CpG岛的甲基化水平,比较分析文昌鸡和北京油鸡HSP70基因的甲基化差异。结果表明:在HSP70基因启动子中共检测到65个CpG位点的甲基化水平;文昌鸡胸肌生长发育过程中有8个CpG位点甲基化水平发生明显改变,其甲基化密度从第30天到第120天基本呈下降趋势;北京油鸡胸肌生长发育过程中只有3个CpG位点甲基化水平发生明显改变,其甲基化密度从第30天到第120天基本呈升高趋势,第120天时甲基化水平达到最高。说明文昌鸡与北京油鸡HSP70基因启动子区CpG岛的甲基化模式和水平不同,这可能导致两种鸡对应激反应产生不同的耐受程度。     

文昌鸡与北京油鸡肌肉组织DNA甲基化的MSAP分析

为了获得鸡不同肌肉组织基因组DNA甲基化水平、模式等表观遗传信息,试验以文昌鸡、北京油鸡及其杂交F1代基因组为试验材料,采用甲基敏感扩增多态性(methylation sensitive amplification polymorphism,MSAP)技术检测了鸡胸肌和腿肌2个组织基因组在CCGG位点的甲基化状态,分析了不同组织的DNA甲基化水平及特异性甲基化模式。结果表明:文昌鸡、北京油鸡及其正交F1代和反交F1代鸡的DNA甲基化程度均较高,其中胸肌基因组DNA的总甲基化水平分别是(53.56±2.40)%、(52.82±0.85)%、(53.67±2.24)%、(54.82±2.42)%,腿肌基因组DNA的总甲基化水平分别是(52.85±2.37)%、(53.48±0.96)%、(51.87±2.85)%、(53.15±0.96)%;胸肌和腿肌组织中全甲基化条带数均高于半甲基化条带数,非甲基化条带数均高于全甲基化、半甲基化条带数;在4个不同鸡群间,基因组甲基化程度差异不显著(P0.05);对部分甲基化位点进行回收,鉴定出6个存在甲基化修饰的基因(ADAMTS5基因、ATP2A2基因、C8H1ORF27基因、C-SNO基因、FAM91A1基因、FBXO33基因)。说明鸡肌肉组织甲基化多态性丰富,且不同遗传背景会造成部分基因甲基化的差异。     

香猪卵巢RARRES1基因第1外显子CG位点的甲基化及其与基因差异表达的关联

为验证和探索香猪卵巢转录组RNA测序检测到的视黄酸受体应答1(retinoic acid receptor responder 1,RARRES1)基因在香猪高、低产仔组之间差异表达的原因,本试验针对RARRES1基因第1外显子ATG下游富含CpG位点区段设计特异性引物,采用亚硫酸氢盐测序法(bisulfite sequencing PCR,BSP)研究卵巢RARRES1基因中的甲基化修饰水平;利用实时荧光定量PCR方法检测高、低产仔组香猪卵巢RARRES1基因的表达量,并探究其与基因甲基化水平之间的相关性。结果表明,与低产仔组相比,香猪高产仔组的甲基化水平较高;4个CpG位点均未被甲基化(CpG_7、CpG_11、CpG_12和CpG_15),另外3个CpG位点(CpG_8、CpG_17和CpG_18)基本上全部发生了甲基化。此外,与低产仔组相比,香猪高产仔组中CpG_4(P0.05)、CpG_9(P0.05)和CpG_16(P0.05)位点的甲基化占比较高,而CpG_6位点在香猪低产仔组中的甲基化比例较高,两组差异极显著(P0.01)。实时荧光定量PCR结果显示,高产仔组香猪RARRES1基因的表达水平较高(P0.05)。Spearman相关分析结果显示,CpG_9和CpG_16两个位点的甲基化比例与RARRES1基因的表达水平高度正相关(R2=0.896,P0.01),提示这两个位点的甲基化可能是香猪高产仔组RARRES1基因表达量较高的原因。     

猪肌分化因子1基因启动子区多态性及生物信息学研究

为揭示猪肌分化因子(myogenic differentiation 1,MyoD1)基因启动子区多态性,本试验分别以野猪×从江香猪二元杂交猪、杜×长×大外三元杂交猪及贵州宗地花猪为研究对象,采用DNA池和直接测序技术,筛选MyoD1基因5'UTR及部分第1外显子区SNP位点,利用生物信息学软件预测SNP位点对核心启动子区、CpG岛和转录因子结合位点的影响。结果表明,在MyoD1基因5'UTR及部分第1外显子区筛查到3个SNPs位点,分别为A-39G、T+150C和C+227G;生物信息学软件预测发现,A-39G位点附近出现重要转录因子结合位点消失和新位点生成;CpGIslandsearcher软件分析得到多态位点突变前后CpG岛大小及GC含量发生改变,据此推测猪MyoD1基因5'UTR区域的A-39G位点对调控启动子功能元件有重要影响。     

鸡miR-17-92基因簇宿主基因启动子的甲基化及其功能分析

为研究鸡脂肪组织miR-17-92基因簇宿主基因(MIR17HG)启动子的甲基化情况,实验以东北农业大学高、低腹脂双向选择品系肉鸡为实验材料,采用Sequenom MassARRAY法检测鸡腹部脂肪组织MIR17HG启动子区CpG岛的甲基化;利用CpG甲基转移酶处理MIR17HG启动子片段,采用报告基因技术检测DNA甲基化对MIR17HG启动子活性的影响。结果表明:高、低脂鸡脂肪组织中MIR17HG启动子区都存在一定程度的甲基化,其中2周龄低脂鸡脂肪组织MIR17HG启动子区的整体甲基化程度显著高于高脂鸡(P0.05),4个CpG位点(25、26、27、28)的甲基化在高、低脂鸡脂肪组织间差异均显著(P0.05);3周龄高、低脂鸡脂肪组织中MIR17HG启动子区的甲基化程度无显著差异(P0.05);7周龄低脂鸡脂肪组织MIR17HG启动子的2个CpG位点(41和42)的甲基化程度显著低于高脂鸡(P0.05)。总体看,高、低脂鸡脂肪组织MIR17HG的启动子甲基化随年龄增长呈下降趋势;体外甲基化分析发现,DNA甲基化抑制MIR17HG启动子活性。     

Lbx1与Lbx2基因在猪骨骼肌中的甲基化状态简

为了探究猪Lbx1和Lbx2基因的甲基化模式,本研究采用亚硫酸盐测序技术,在猪背最长肌中分析Lbx1和Lbx2基因启动子和外显子1的甲基化状态。结果发现,Lbx1基因的甲基化差异区在外显子1处的CpG岛内;Lbx2基因的甲基化差异区在CpG岛外的启动子区。Lbx1基因CpG岛内的高密度甲基化可能参与下调该基因在背最长肌中的表达量。     

山羊DCT基因启动子区甲基化水平、SNP与毛色特征关系研究

旨在探究DCT基因启动子区甲基化水平和SNP突变对山羊毛色的影响,为探索DCT基因调控山羊毛色变化的机理提供理论依据。本研究以山羊为试验动物,对DCT基因启动子区进行CpG岛预测,设计引物对预测的2个CpG岛富集区域进行亚硫酸氢盐甲基化测序,使用甲基化水平分析软件BISMA统计甲基化位点,比较唐山奶山羊(白色)和南江黄羊(黑色品系)两种不同毛色山羊群体DCT基因启动子区甲基化水平差异。克隆DCT基因核心启动子区,筛选不同毛色山羊群体的SNPs,使用JASPAR和Nsite预测SNPs位点突变前后转录因子的改变,并检测比较突变前后DCT基因启动子活性变化。结果,成功克隆了山羊DCT基因启动子区甲基化序列及核心启动子区(g.-1045～-318)。在g.-348～-150区域和g.+222～+502区域分别发现6个和23个甲基化位点,其中g.+312、g.+352和g.+400位点与g.+389和g.+404位点白色山羊甲基化水平分别显著和极显著高于黑色山羊(P<0.05和P<0.01),并且g.+222～+502区域白色山羊甲基化平均水平极显著高于黑色山羊(P<0.01)。在DCT基因核心启动子区的g.-804T> G、g.-705C> T和g.-679G> A,3个SNPs位点的基因型构成在白色山羊和3个有色山羊群体中存在差异,g.-804T> G突变导致该区域的SOX10转录因子结合位点缺失,DCT基因启动子活性显著下降(P<0.05)。结果显示,白色山羊DCT基因g.+222～+502区域的高甲基化水平,g.-804、g.-714和g.-679 3个位点的突变,尤其是g.-804T> G造成SOX10转录因子结合位点的缺失,突变的G型DCT基因启动子活性显著降低。因此,DCT基因启动子区SNP突变和高甲基化水平可能抑制了基因的表达从而形成山羊白色被毛。     

乌珠穆沁羊生长分化因子11基因外显子1序列CpG位点的甲基化模式分析

为了探讨乌珠穆沁羊生长分化因子11 (growth differentiation factor 11,GDF11)基因外显子1的甲基化模式,本研究采用亚硫酸氢盐测序PCR (BSP)的方法对普通乌珠穆沁羊和多脊椎乌珠穆沁羊GDF11基因外显子1的甲基化水平进行检测,通过检测发现普通乌珠穆沁羊GDF11基因外显子1的平均甲基化率为0.123,多脊椎乌珠穆沁羊的平均甲基化率为0.569,差异显著性检验表明这两组数据间差异极显著(P<0.01),即多脊椎乌珠穆沁羊GDF11基因外显子1中的CpG甲基化率极显著高于普通乌珠穆沁羊(P<0.01).通过分析GDF11基因外显子1的13个CpGs位点发现,多脊椎乌珠穆沁羊CpG_11和CpG_13位点的甲基化率值最高,达到90%,推测这两个位点的甲基化可能与乌珠穆沁羊的脊椎数增加有关,是导致多脊椎发生的主要原因.     

海南文昌鸡生长激素基因克隆测序及生物信息学分析

为了克隆文昌鸡的生长激素(growth hormone,GH)基因,获得该基因序列并分析基因结构和相关遗传变异,采用PCR方法扩增GH基因组序列,通过克隆测序寻找基因中的突变位点,利用PCR产物直接测序检测GH基因的多态性。结果显示:在鸡GH基因组中共发现7处碱基突变位点,分别位于GH基因的5'端、第1内含子、第4外显子和第4内含子中;多态性分析发现,在GH基因-391 bp处的A/G突变位点、-360bp处的A/G突变位点、-121 bp处的C/T突变位点上,文昌鸡的优势基因型分别是AA、GG和CC;鸡GH基因启动子区域发现多种潜在的转录因子结合位点,如GATA序列结合因子1(GATA-binding factor 1,GATA-1)、环磷酸腺苷应答元件结合蛋白(c AMP response element-binding protein,CREB)、核因子1(nuclear factor 1,NF-1)、上游刺激因子(upstream stimulatory factor,USF)、增强子结合蛋白α(CCAAT/enhancer binding protein alpha,C/EBPalp)等。本试验为进一步研究文昌鸡GH基因的功能提供了参考。     

鸡、鹌鹑及其杂交种早期胚胎bcl-2基因甲基化的分析

采用甲基化特异性PCR(MSP)方法进行鸡、鹌鹑及其属间杂交种早期胚胎发育期60、66、72、84、96、108、120 h 7个不同胚龄胚胎组织bcl-2基因启动子区CpG岛甲基化状态的对比分析,探讨bcl-2基因甲基化对鸡与鹌鹑属间杂交种早期胚胎发育的影响。结果显示,正常发育的鸡胚和鹌鹑胚龄在60、66、72、120 h均呈高甲基化状态,84和96 h呈非甲基化状态,而鸡与鹌鹑属间杂交种胚胎在60、66、72、96、108和120 h则与鸡、鹌鹑不同,呈现出甲基化或非甲基化无规律性并存,甚至检测不到甲基化状态;84 h则只检测到非甲基化状态。鸡与鹌鹑杂交种早期胚胎组织中bcl-2 基因启动子区CpG岛的异常甲基化有可能是引起鸡与鹌鹑属间杂交种胚胎早期死亡的一个重要影响因素。     

鸡Nramp1基因第9外显子的单核苷酸序列多态性分析

以文昌鸡、安卡鸡及藏鸡为试验动物,利用PCR-SSCP方法检测Nramp1基因部分区域的单核苷酸多态性(SNP)。结果发现,该区域存在2个突变,分别为C315G、C357T;共出现4种基因型,分别为GG、GT、TT及AA型,在文昌鸡和藏鸡群体内,T为优势等位基因,而安卡鸡中G为优势等位基因。3个群体该座位均处于哈代-温伯格平衡(PO.05),且3个群体间基因型分布无显著差异(P0.05)。     

香猪卵巢RARRES1基因第1外显子CG位点的甲基化及其与基因差异表达的关联

为验证和探索香猪卵巢转录组RNA测序检测到的视黄酸受体应答1（retinoic acid receptor responder 1,RARRES1）基因在香猪高、低产仔组之间差异表达的原因,本试验针对RARRES1基因第1外显子ATG下游富含CpG位点区段设计特异性引物,采用亚硫酸氢盐测序法（bisulfite sequencing PCR,BSP）研究卵巢RARRES1基因中的甲基化修饰水平;利用实时荧光定量PCR方法检测高、低产仔组香猪卵巢RARRES1基因的表达量,并探究其与基因甲基化水平之间的相关性。结果表明,与低产仔组相比,香猪高产仔组的甲基化水平较高;4个CpG位点均未被甲基化（CpG_7、CpG_11、CpG_12和CpG_15）,另外3个CpG位点（CpG_8、CpG_17和CpG_18）基本上全部发生了甲基化。此外,与低产仔组相比,香猪高产仔组中CpG_4（P>0.05）、CpG_9（P<0.05）和CpG_16（P<0.05）位点的甲基化占比较高,而CpG_6位点在香猪低产仔组中的甲基化比例较高,两组差异极显著（P<0.01）。实时荧光定量PCR结果显示,高产仔组香猪RARRES1基因的表达水平较高（P<0.05）。Spearman相关分析结果显示,CpG_9和CpG_16两个位点的甲基化比例与RARRES1基因的表达水平高度正相关（R²=0.896,P<0.01）,提示这两个位点的甲基化可能是香猪高产仔组RARRES1基因表达量较高的原因。     

鸡GPC1基因外显子8的SNPs与部分免疫性状的相关性分析

采用PCR-SSCP对12个不同鸡种glypican-1(GPC1)基因外显子8的单核苷酸多态性进行检测,同时检测如皋鸡、安卡鸡和文昌鸡3个鸡种56日龄的5个免疫性状,进一步分析SNP位点与免疫性状的关系。结果表明:12个鸡种中均出现3种带型,存在g.155 C>A错义突变,引起苏氨酸突变为精氨酸。12个鸡种群中,AA、AB和BB基因型平均频率分别为0.259、0.545和0.211;平均观察杂合度为0.466,平均Shannon信息指数为0.671。除乌骨鸡、大骨鸡偏离了Hardy-Weinberg平衡外(P<0.05),其余群体均处平衡状态。基于该位点构建的UPGMA聚类图将12个鸡种分为3大类,反映了12个鸡种在抗性方面存在的差异。经过关联分析,如皋、安卡鸡中AB型个体的IL-1浓度、H/L值与BB型存在显著差异,与AA型差异不显著;在其他免疫性状中各基因型之间均无显著差异。安卡鸡的一般抗性总体低于如皋鸡和文昌鸡。     

Basic characterization of 90 kDa heat shock protein genes HSP90AA1, HSP90AB1, HSP90B1 and TRAP1 expressed in Japanese quail (Coturnix japonica)

In the current study, we describe four novel members of the 90 kDa heat shock protein (HSP90) family expressed in Japanese quail, Coturnix japonica. The coding regions of the genes, CjHSP90AA1, CjHSP90AB1, CjHSP90B1 and CjTRAP1, exhibited more than 94% similarity to their related genes in chicken. The putative proteins encoded by these quail genes contained motifs considered essential for HSP90 gene function. In addition, the predicted proteins were more similar to HSP90AA1, HSP90AB1, HSP90B1 and TRAP1 proteins expressed in vertebrates than they were to other members of the HSP90 family. Exon numbers of CjHSP90AA1 (11), CjHSP90AB1 (12) or CjTRAP1 (18) are the same as the chicken and mammalian orthologs. Furthermore, gene order in the regions surrounding CjHSP90AB1 and CjTRAP1 has been preserved, providing evidence that the genomic regions were orthologous to HSP90‐containing regions in the chicken genome. The promoter regions of the genes also contained conserved motifs identified in related genes of chicken. However, the nucleotide sequences of the 5′‐flanking region of these genes were highly polymorphic. We also found that CjHSP90AA1 exhibited a robust response to heat shock treatment. Taken together, the data suggest that CjHSP90AA1, CjHSP90AB1, CjHSP90B1 and CjTRAP1 encode orthologs of HSP90AA1, HSP90AB1, HSP90B1 and TRAP1, respectively.     

三鸡种NLRC5基因编码区SNPs及其与部分免疫性状的关联分析

本研究通过检测鸡NLRC5基因编码区域单核苷酸多态位点,以期分析与免疫性状相关的遗传标记。采用PCR-SSCP方法对3个鸡品种NLRC5基因编码区SNPs进行检测,仅在外显子8区域发现多态位点,其中在文昌鸡中检测到AA、BB和AB 3种基因型,如皋鸡中检测到AA和AB 2种基因型,安卡鸡中仅存在AA基因型。序列分析结果显示,NLRC5基因外显子8存在G43A同义突变。测定部分免疫性状,分析不同鸡品种之间以及不同基因型与免疫性状间的关联性,结果表明:安卡鸡H/L值、ND抗体滴度、IL-1浓度均显著高于如皋鸡和文昌鸡(P0.05),AI抗体滴度极显著低于其他2个品种(P0.01),如皋鸡SBRC抗体滴度最高,但3个品种之间差异不显著(P0.05);不同基因型同免疫性状之间,AA型个体各项性状值均优于AB和BB型个体,但是差异不显著(P0.05)。综合分析,中国地方品种文昌鸡、如皋鸡的抗性优于安卡鸡种,AA型可能是NLRC5基因在机体免疫应答能力的有利基因型。     

鸡脂肪组织TCF21基因启动子区DNA甲基化与其表达的关系

旨在研究鸡脂肪组织中TCF21基因启动子区DNA甲基化水平与其表达的关系。以东北农业大学高、低腹脂双向选择品系（简称高、低脂系）第24世代7周龄肉鸡为试验材料，利用RT-qPCR检测高、低脂系肉鸡腹部脂肪组织中TCF21基因的mRNA表达水平；利用生物信息学和双荧光素酶报告系统分析TCF21基因启动子的结构与功能；利用Sequenom MassARRAY飞行质谱检测高、低脂系肉鸡腹部脂肪组织中TCF21基因启动子区CpG位点的甲基化水平；利用CpG甲基转移酶处理TCF21启动子报告基因质粒，分析DNA甲基化对TCF21基因启动子活性的影响。结果显示，高脂系肉鸡腹部脂肪组织中TCF21基因的mRNA表达水平极显著高于低脂系（P<0.001）；TCF21基因的启动子区存在40个CpG位点，且在启动子的近端和远端均有分布，但不存在CpG岛；将TCF21基因的启动子划分为5个功能区域，分别为R1区域（-2 000~-1 500 bp）、R2区域（-1 500~-1 000 bp）、R3区域（-1 000~-500 bp）、R4区域（-500~-200 bp）和Core区域（-200~-100 bp）；高脂系R2、R3和R2+R3区域的DNA甲基化水平显著或极显著高于低脂系（P<0.05或P<0.001）；R2、R3、R2+R3区域的DNA甲基化水平与TCF21基因mRNA表达水平呈显著正相关（R2区域：r=0.438，P<0.05；R3区域：r=0.371，P<0.05；R2+R3区域：r=0.489，P<0.05）；R2区域的DNA甲基化显著抑制其转录活性（P<0.05）。综上所述，TCF21基因在高、低脂系肉鸡腹部脂肪组织中的表达水平主要与其启动子R2区域的DNA甲基化水平有关。     

三鸡种白细胞介素-1β基因多态与血清中白细胞介素-1含量相关性分析

本研究旨在通过检测鸡白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)基因部分区域单核苷酸多态位点,以期查找与血清中IL-1含量相关的遗传标记。根据红色原鸡IL-1β基因序列设计2对引物,利用PCR及单链构象多态性(Single-Strand Conformation Polymorphism,SSCP)方法对如皋鸡、文昌鸡和安卡鸡进行单核苷酸多态性(Singlenucleotide polymorphism,SNP)分析,并利用试剂盒ELISA法对56日龄血清IL-1含量进行检测。结果表明血清中IL-1含量安卡鸡极显著高于如皋鸡(P0.01)和文昌鸡(P0.001)。IL-1β基因476位点发生G→A突变、482位点发生T→C突变、1 215位点发生C→T突变、1 507位点发生T→C突变。对多态位点和IL-1含量作关联分析,只发现1 215位点与IL-1含量有关,TT基因型个体IL-1含量显著高于CC型个体。本研究初步表明IL-1β基因1 215多态位点可以作为抗病育种中的候选遗传标记。     

文昌鸡促卵泡激素β基因内含子1的SNP分析及其与早期产蛋性能的相关性研究

以109只海南文昌鸡为试验动物,利用PCR-SSCP技术检测了促卵泡激素(follicle-stimulating hormone β,FSHβ)基因的多态性,在其内含子1区域内发现了1个SNP,在群体中检测出2种基因型:AA、AB。将不同基因型个体与产蛋数、畸形蛋数、体重和开产日龄等进行了关联分析。结果表明,AA基因型鸡个体的产蛋数比AB基因型个体多9.54枚,畸形蛋数比AB基因型个体少1.54枚,开产日龄比AB基因型个体早2.97 d,且差异均不显著(P＞0.05)。22~26、27~30和31~34周龄的AA基因型鸡的产蛋量显著高于AB基因型(P＜0.05),而18~21和35~39周龄的AA基因型鸡的产蛋量也明显高于AB基因型,但差异不显著(P＞0.05)。AA基因型鸡6、8、14、20周龄的体重高于AB基因型个体,AA基因型个体18周龄的体重却低于AB基因型个体,差异均不显著(P＞0.05)。总体而言,FSHβ基因位点的A等位基因对产蛋数、畸形蛋数、体重和开产日龄的影响均未达到差异显著水平。