CRISPR/Cas9技术在动物非编码RNA功能研究中的应用

CRISPR/Cas9系统是一种广泛存在于细菌和古菌中的免疫机制。近年来,已发展为一种快捷高效的基因编辑工具,用于研究编码或非编码RNA的功能。非编码RNA是一类不编码蛋白质的RNA,其可通过多种调控途径在动物的生长发育、疾病免疫等生理或病理过程中发挥重要的生物学功能。CRISPR/Cas9技术可以靶向核酸序列稳定敲除基因,得到敲除小鼠或细胞系,虽然其在非编码RNA功能研究中的使用干扰了邻近基因或宿主基因表达,但该技术的出现为非编码RNA功能机制的探索提供了不同的途径。本文通过简要概述CRISPR/Cas系统的发展和作用原理,并重点介绍CRISPR/Cas9技术在动物miRNA、lncRNA及circRNA功能研究中的应用,以期为相关研究提供参考。     

家禽疱疹病毒CRISPR/Cas9基因编辑最新研究进展

基于CRISPR/Cas9系统的基因编辑是最新一代的基因组编辑技术，在向导RNA （gRNA）的介导下几乎可以靶向编辑任何一种基因，实现基因组的定点突变、敲除或插入。近年来将CRISPR/Cas9基因编辑技术应用于大基因组DNA病毒的研究，尤其是用于疱疹病毒的基因编辑已成为病毒学研究领域的最新国际热点。自2016年首次报道利用CRISPR/Cas9系统改造家禽疱疹病毒如马立克病病毒（MDV）基因组以来，短短5年时间已全面应用于家禽疱疹病毒的蛋白编码基因和非编码RNA基因的编辑、基因缺失疫苗和重组疫苗研发、抗病毒治疗以及抗病育种等领域。本文详细综述了当前CRISPR/Cas9基因编辑技术在家禽疱疹病毒中的应用进展和最新成果，并对其面临的问题和前景进行了展望，以期为后续研究提供重要参考。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术原理及其在牧草中的应用

CRISPR/Cas9系统是一种新型RNA靶向的基因编辑系统。在近几年的研究中, CRISPR/Cas9基因编辑技术的发展十分迅猛, 因其具有经济、高效、简便的特点而广泛应用于育种、医疗、工业等领域。介绍了2种新型基因编辑技术, 阐述了CRISPR/Cas9的结构、功能以及CRISPR/Cas9基因编辑技术原理, 综述了该技术在牧草中的应用研究进展, 以期为利用CRISPR/Cas9系统研究牧草基因功能及改良牧草性状提供思路。     

利用CRISPR/Cas 9技术构建大肠杆菌aroA基因的敲除系统及其初步应用

旨在利用CRISPR/Cas 9新型基因编辑技术构建大肠杆菌aroA基因的敲除系统,并分析其对不同大肠杆菌aroA基因敲除、修复的差异。首先构建靶向aroA基因的CRISPR/Cas 9载体;随后人工设计同源修复供体基因序列,并亚克隆到CRISPR/Cas 9载体中,构建成完整的CRISPR/Cas 9基因敲除体系;将该系统分别应用到大肠杆菌DH10B、DH5α和JM109细胞中,PCR鉴定筛选到的阳性菌株,并回收其扩增条带进行克隆、测序。CRISPR/Cas 9载体的酶切与测序结果均正确,表明载体构建成功;PCR鉴定结果显示,该系统对三种大肠杆菌均能进行aroA基因的有效敲除,敲除效率为46%~58%;测序结果进一步证实目的基因敲除成功。本试验成功构建大肠杆菌aroA基因CRISPR/Cas 9敲除系统,为进一步研究致病菌aroA基因功能及开发减毒大肠杆菌疫苗提供新型、有效的基因敲除工具。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术及应用研究概述

CRISPR/Cas9是从细菌中发现的一种用Cas9核酸酶对外源DNA进行切割从而保护自身基因完整性的防御机制。通过对其结构中指导性RNA的改变即可便捷地对其识别位点进行改变,在基因编辑的应用方面具有很大潜力。论文主要概述CRISPR/Cas9系统的组成、机制以及优缺点,同时介绍CRISPR/Cas9系统在科学研究、动物疾病治疗以及一些由基因改变导致的疾病模型方面的应用,对CRISPR/Cas9基因编辑技术的发展进行预测。     

利用CRISPR/Cas9技术制备敲除Myostatin基因牛胎儿成纤维细胞株

CRISPR/Cas9系统作为第3代人工核酸内切酶,是一种具有广阔应用前景的基因定点修饰工具。肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)基因能够负向调节肌肉的生长,影响动物的产肉量。为了获得MSTN基因敲除的细胞株,给转基因动物的制备提供材料,试验利用CRISPR/Cas9系统的不同类型的表达载体对牛MSTN基因外显子序列随机设计靶位点,利用T7核酸内切酶I(T7EI)从中挑选出敲除效率最高的靶位点的表达载体,在无筛选标记条件下对牛胎儿成纤维细胞进行基因敲除。结果表明:经过长时间培养获得了基因敲除的细胞株。说明CRISPR/Cas9技术用于基因敲除方面的研究应用前景广阔。     

CRISPR/Cas9基因敲除研究进展

功能基因组学的发展促进基因敲除技术的进步,基因敲除技术从载体的构建到细胞筛选再到动物模型都取得长足进步。基因敲除手段种类繁多,其中CRISPR/Cas9作为常用的基因编辑技术,具有高效、便捷、精确等优点,在农业、医学、生物学的模型构建中被广泛运用。随着科研工作的逐渐深入,CRISPR/Cas9技术逐渐渗透到植物和微生物研究领域中。文章综述近年来CRISPR/Cas9的应用,为科研工作的开展提供参考。     

浅谈基因编辑技术与猪遗传改良

近年来,CRISPR/Cas基因编辑技术（主要包括CRISPR/Cas9及其同源蛋白、单碱基编辑及基因表达调控技术）的发展和应用在动物功能基因研究和遗传性状改良上都取得了重要突破。文章主要通过围绕CRISPR/Cas系统,重点阐述了CRISPR/Cas9及其衍生的基因编辑新技术的结构、作用机制差异及在猪遗传育种中的应用,并对目前该系统存在的问题及系统优化方法进行分析。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术在重要猪病毒病防控中的研究与应用

规律成簇的间隔短回文重复序列系统（clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR）是一种广泛存在于古细菌和细菌中，由RNA介导在Cas蛋白协助下发挥作用的获得性免疫系统，目前，已发现的CRISPR系统中以CRISPR/Cas9应用最为广泛，本文主要对CRISPR/Cas9系统的基本原理和研究进展进行概述，着重介绍其在重要猪病毒病防控中的应用，包括改造宿主和改造病毒两方面，该技术为研究病毒致病机制、新型疫苗研发以及抗病育种研究等提供了强有力的工具，对疫病的控制有着深远的影响。     

CRISPR/Cas9系统在家禽中应用研究进展

CRISPR/Cas系统是一种在细菌和古细菌中发现的获得性免疫系统,由规律成簇间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）和CRISPR相关蛋白（CRISPR-associated proteins,Cas）组成。在此基础上改造获得的CRISPR/Cas9基因定点编辑技术可通过设计小的单链引导RNA（single guide RNA,sgRNA）对目标基因进行定向编辑。家禽作为农业经济动物,能够快速高效地生产蛋和肉产品,是世界范围内重要的蛋白质来源,也是极具价值的脊椎动物发育生物学模型。但是受限于卵生动物特点,家禽的受精卵与蛋黄表面紧密结合,未受精的卵子非常难取出,对家禽单细胞阶段受精卵进行靶向遗传修饰的可行性较低,因而家禽功能基因及转基因研究进展较为缓慢。CRISPR/Cas9基因定点编辑技术相较于其他基因编辑系统操作简单,靶向效率高,极大地推动了家禽功能基因的研究进展,是目前筛选和验证家禽功能基因的最有效的工具之一。文章综述了近年来CRISPR/Cas9在家禽细胞、生长发育和性腺分化、家禽疾病、家禽胚胎编辑和转基因家禽制备上的研究进展,以期为CRISPR/Cas9在家禽上的深入研究和应用提供参考。     

CRISPR/Cas9技术在畜禽育种中的研究进展

利用传统方法在畜禽特定基因座上进行基因组修饰时,只能通过在体细胞中进行同源重组再经细胞核移植实现。传统同源重组方法的困难性和低效性阻碍了基因修饰在畜禽遗传育种中的广泛应用。近年来,位点特异性核酸内切酶的发现为靶向基因修饰提供了一条更直接的途径,主要由于这些酶能直接在DNA序列上进行一步式的基因编辑。成簇规律间隔短回文重复序列/Cas关联蛋白9(clustered regularly interspersed short palindromic repeat/CRISPR associated protein 9,CRISPR/Cas9)是一种RNA导向的DNA内切酶,精准定位于特定的靶位点,高效完成RNA导向的DNA识别及编辑。CRISPR/Cas9技术作为精准而强大的第3代基因组编辑工具,已经成功应用于猪、牛、山羊、绵羊和鸡上,这些CRISPR/Cas9基因编辑畜禽可作为研究人或畜禽生理和病理的生物模型、生产功能性蛋白质的生物反应器或器官移植的供体。特别是在畜禽生产方面,CRISPR/Cas9基因编辑可用于改善生产遗传特性及畜产品质量,提高畜禽对疾病的抵抗力。作者对当前畜禽中特定位点基因组修饰的CRISPR/Cas9技术的原理及基因组编辑在畜禽育种中应用的最新进展进行了综述,以期为推进CRISPR/Cas9技术在畜禽育种中的研究提供参考。     

CRISPR/Cas9系统在寄生虫基因组编辑中的应用研究进展

基因编辑是一种依赖于核酸内切酶对目标基因进行定向改造的现代生物学技术,可实现特定片段的加入、删除,以及特定碱基的插入、缺失、替换等。CRISPR/Cas9系统(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/associated nuclease 9)是在细菌和古细菌中发现的一种用来抵御外源质粒和噬菌体入侵的获得性免疫系统,经改造后已成为一种新型的基因组编辑工具,因其具有操作简单、成本低、切割效率高等优点被广泛应用于多种动物、植物及微生物等的基因组编辑。应用CRISPR/Cas9系统在进行基因编辑的基础上可分析和验证基因功能、研究遗传育种及筛选药物靶点和疫苗分子等,以达到减弱病原微生物致病性、增强动植物抗病性、治疗遗传性疾病、病毒性感染及肿瘤等目的。寄生虫因其生活史复杂,与细菌和病毒相比基因组较大、结构较复杂,缺乏有效的研究工具等原因,使得相关研究进展缓慢,而CRISPR/Cas9基因编辑技术的出现为基因功能研究提供了新的技术手段。笔者对CRISPR/Cas9系统的发现及其在寄生虫基因组编辑中的应用研究进展进行综述,并对该系统的应用现状和发展进行总结和展望。     

CRISPR/Cas9基因组编辑技术及其在草类植物中的应用

CRISPR/Cas9系统作为新一代基因组编辑技术,一经问世就受到广泛关注。CRISPR/Cas9系统具有对特定基因位点进行精确修饰(包括敲除、插入、替换等)的强大功能,同时具有操作简单、效率高、适应性广等技术优势,目前已在微生物、植物、动物以及人类基因治疗等整个生命科学领域得到应用。本文简要介绍了CRISPR/Cas9技术的发展历程、作用机理、技术优势、功能及应用领域,总结该技术在植物领域的基因组定向编辑中的研究进展。并提出了这项技术在草类植物基因功能分析、基因代谢调控途径与遗传改良等方面的应用前景,为相关领域的研究工作奠定了基础。     

CRISPR/Cas9技术在猪、鸡中的应用研究进展

基因编辑是利用核酸酶在基因组的特定位点产生DNA双链断裂，从而触发细胞自身的DNA损伤修复机制，实现对靶基因序列进行位点特异性修饰。规律成簇间隔短回文重复序列（clustered regularly interspersed short palindromic repeat，CRISPR）及其相关蛋白9（Cas9）系统作为第3代基因编辑技术在农业和基因治疗研究中发挥着重要作用，与传统的锌指核酶和转录激活因子样效应物核酶基因编辑方法相比，它可以靶向基因的任何位点引起DNA双链断裂，实现目标基因的精准敲除或插入外源片段，并能快速、高效地修饰基因组，包括基因敲除、敲入、抑制、激活等，是应用最广泛的基因编辑工具。CRISPR/Cas9技术的出现彻底改变了生命科学、医学和遗传学研究现状。近年来，利用CRISPR/Cas9技术对动物基因组进行修饰，开启了畜禽分子育种的新纪元，不仅极大地推动了现代畜禽养殖技术的发展，而且为人类医学研究做出了特殊贡献，特别是在猪和鸡上。作者以猪和鸡为对象，综述了CRISPR/Cas9技术在异体器官移植供体、人类疾病的生物模型、抗病育种材料、全基因组高通量筛选等方面的研究进展，以及如何利用CRISPR技术快速又简单地生产出基因编辑猪、鸡，为推动CRISPR技术制备其他基因编辑动物提供参考依据。     

Mechanism of CRISPR/Cas System and Its Application in Parasitology

CRISPR/Cas system is an immune system present in bacteria and archaea that includes the RNA which has the ability to target viruses invading the host or exogenous DNA fragment of the nucleic acid and the Cas9 nuclease cutting the fragment. In view that the system is easier to operate, more efficient, lower cost, has been widely used in various fields of genetic engineering. Here, we demonstrated the mechanism of CRISPR/Cas systems and summarized the application in respect of the parasite.