利用锌指核酸酶对猪基因组进行定向遗传修饰（续完）

4利用ZFN修饰猪的基因组 早期通过ZFN获得遗传修饰动物的研究开始于将其注射到非洲爪蟾（Xenopus laevis）的卵母细胞中（Bibikova等,2001）。虽然最终没有得到活着的基因敲除蟾蜍,但是这个研究证明了ZFN在活体内具有活性,以及可以通过同源重组介导基因组修饰。     

锌指核酸酶技术研究进展

重组锌指核酸酶(Zinc finger nuclease,ZFN)是锌指蛋白和FokI核酸内切酶的剪切结构域组成的嵌合融合蛋白,可切割特异DNA序列,引起DNA双链断裂(double strand break,DSB),提高了依赖同源重组完成特定基因改造和修饰等的基因打靶的效率,为转基因及基因治疗研究提供了更有效的技术...     

基因编辑技术及其应用的研究进展

基因编辑技术是一项对生物体内源基因进行精准定点修饰的技术,极大地推动了生命科学的发展进程,是目前生物科学研究领域应用最广泛的技术。基因编辑技术主要包括锌指核酸酶（ZFN）、类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）和规律性重复短回文序列簇（CRISPR/Cas）。基因编辑技术可以特异性识别靶向序列,定点修饰靶向基因,进而深入研究目标基因的功能。基因编辑技术具有操作简便、作用效率高和脱靶率低等优势,因此广泛应用于生命科学研究、疾病模型的构建、药物研发以及农业生产等领域。作者主要介绍了ZFN、TALEN、CRISPR/Cas 3种新型基因编辑技术,综述了基因编辑技术在基因治疗、品种研发和改良、研究功能基因以及构建疾病动物模型等方面的应用,简要讨论了基因编辑技术与传统转基因技术之间的区别,并对基因编辑技术的应用前景进行了展望。     

转基因及基因编辑技术与猪遗传育种

基因编辑是一种利用人工核酸酶系统对特定基因进行敲除、插入或修饰的技术。在猪的传统育种中,存在着选育时间长、低遗传力性状选择效率低等诸多缺陷,而基因编辑技术可以对控制相关性状的关键基因进行改变,不仅可以克服传统育种中的困难,而且在生长速度、瘦肉率、抗病能力、环境改善等方面都有重要突破,成为近年来猪遗传育种的新方向。另外,猪在解剖学与生理学上与人具有高度同源性,使得猪成为疾病模型和异体器官移植的研究热点。本文主要总结了基因编辑和转基因技术在猪现代育种中的相关进展,并展望了其发展前景。     

猪基因转移技术的新进展

前言过去十年里,随着重组 DNA 技术的发展,科学家们已能分离单一基因,分析和修饰核苷酸的结构,复制分离到的基因,并将外源基因转移到动物的基因组中。这种对遗传物质的直接操作被称作“遗传工程”。“转基因动物”则是指基因组中含有重组 DNA 的动物1983年,作者与 Ralph 致力于生产转基因猪的研究,并获得了首例转基因猪(Ham-mer 等,1985)。本文扼要介绍转基因猪生产技术的研究现状。1 转移猪基因的方法生产转基因猪的微注射过程与小鼠相似,只是猪卵母细胞不透明,其原核很难辨认。我们发现,将猪卵母细胞以10000～     

创新生物科技对猪营养和猪肉生产效率改进的推动作用

随着世界人口的不断增长和生活水平的提高,在现有资源不断减少的同时,人们对优质猪肉蛋白质的需求却大幅度增加。除了通过改善日粮的营养水平及组成,还需要依靠生物技术培育出具有优良性状的猪。生物技术可以归类为克隆具有相同遗传组成的动物(通过体细胞核移植,胚胎细胞核移植或胚胎胚吐)或用基因工程(通过重组DNA技术和基因编辑)来产生转基因动物或微生物。克隆有助于保护物种和品种,特别是那些具有良好生物和经济特性的物种和品种。重组DNA技术将来自多个来源的遗传物质结合到单个细胞中以产生蛋白质,并且是基因(基因组)编辑的基础。基因编辑涉及基因的敲除、插入或沉默,以产生具有重要生产性状的转基因猪;或对抗生素敏感的微生物。目前的基因编辑工具包括使用锌指核酸内切酶(ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶(TAL?EN),或基因组定点编辑技术[成簇规律间隔短回文重复-Cas9蛋白(CRISPR/Cas9)]。根据细胞类型和质粒,通过转染(基于脂质的试剂、电穿孔、核转染或显微注射)或噬菌体将ZFN、TALEN或CRISPR/Cas9组分递送到靶细胞中。与ZFN和TALEN编辑相比,CRISPR/Cas9提供更高的效率,更易于设计,以及更高的基因工程灵活性。迄今为止,已经产生转基因猪可以表达牛生长激素、细菌植酸酶、真菌糖酶、植物和秀丽隐杆线虫脂肪酸去饱和酶,以及解偶联蛋白-1;缺乏肌肉生长抑制素,α-1,3-半乳糖基转移酶或CD163[猪生殖和呼吸综合征病毒("蓝耳病")的细胞受体]。生物技术有望在未来能提高猪生产效率和开发抗生素替代品。     

世界首例转基因克隆猪在英国诞生

英国的 PPLTherapeutics公司于 2 0 0 1年 4月 1 1日宣布 ,世界首例转基因克隆猪诞生 ,5头健康的克隆仔猪均含有外源标记基因。这是该公司 2 0 0 0年宣布世界首例克隆猪诞生之后又一重大成果。这次的克隆猪所不同的是 ,它们是由经过遗传修饰的体细胞核产生的。这一工作的成功进一步证明了生产基因敲除 ( knock-out)猪的可行性。这种基因敲除猪含有特异性的基因 ,可使人对猪器官产生排斥作用的免疫系统失活。 PPL公司此前曾报道过在猪细胞成功敲除靶基因 ,所用技术为该公司的专利技术 ,也就是他们生产转基因克隆绵羊丘比特 ( Cupid)和戴…     

RNA干扰技术在动物抗病育种中的应用前景

动物疾病尤其是病毒性疾病一直是畜牧业亟待解决的问题,随着转基因技术的出现,生产遗传修饰动物来抵抗特定传染病的策略备受关注。从长远利益来看,这种基因工程动物从遗传本质上提高了畜禽的抗病能力。转基因抗病育种在未来可能成为减少动物传染性疾病的最有前途的方法之一。RNA干扰是双链RNA特异性诱导同源基因表达沉默的现象。研究证实,RNA干扰在细胞水平,小鼠模型以及动物个体的抗病毒效果是非常明显的,RNA干扰技术作为抗病毒策略为生产抗病转基因动物提供了光明的应用前景。RNA干扰技术介导的抗病转基因动物的研究相继取得了阶段性进展,抗疯牛病转基因羊和牛以及抗内源性逆转录病毒猪已经成功获得,虽然目前获得的转基因动物类型有限,但为继续生产抗病转基因家畜提供了有效的参考和依据。     

世界首例内源性基因敲除猪诞生

我国科学家首次将锌指核酸酶基因打靶技术应用于猪内源性基因敲除研究,成功敲除了猪内源性PPARγ基因。近日,从中科院广州生物医药与健康研究院获悉,该院研究员赖良学研究团队与美国密歇根大学心血管研究中心陈育庆团队合作,首次将锌指核酸酶基因打靶技术应用于猪内源性基因敲除研究,成功敲除了猪内源性PPARγ基因。     

家蚕条件基因打靶技术的建立及应用研究进展

条件基因打靶技术是通过借助位点特异性重组酶和预先引入宿主基因组的重组酶特异识别位点,在宿主特定发育阶段的组织或细胞中实现目标基因时空特异性定点插入、删除、替换和倒位等突变操作的技术。目前条件基因打靶技术已被广泛应用于拟南芥(Arabidopsis thaliana)、水稻(Oryza sativa)、小鼠(Mus musculus)和果蝇(Drosophila melanogaster)等高等真核模式生物的功能基因研究,并逐渐成为转基因动植物研究领域进行基因操作的强有力工具。近年来,国内外多个研究机构系统地开展了家蚕(Bombyx mori)条件基因打靶技术的开发研究,目前已经建立了较为完善的基于多种不同位点特异性重组系统的家蚕条件基因打靶技术平台。本文较为全面地介绍目前最为常用的位点特异性重组系统的组成和作用原理,系统概述基于位点特异性重组系统的家蚕条件基因打靶策略及其应用,并对家蚕条件基因打靶技术存在的主要问题和发展趋势进行讨论。     

家畜基因打靶研究进展

将一段DNA片段导入哺乳动物细胞中后，能够定位并且与内源的同源序列重组，这种类型的同源重组叫做基因打靶(gene targting)。基因打靶技术可以用来生产转基因动物。在小鼠胚胎干细胞中应用这一技术已生产出各种不同基因位点的突变体，可对小鼠中特异性基因的表型进行评价。基因打靶技术不只是一种使基因失活的手段，而且可作为一种用来改变基因活性的方法。     

RNAi技术在转基因猪中的应用研究进展

RNAi技术介导的转基因小鼠的出现,预示着在哺乳动物整体水平上研究靶基因的敲除成为可能。目前,针对家畜这一类较大的动物,出现了RNAi技术介导的转基因猪,为应用RNAi技术培育抗猪病毒新品种奠定基础。文章以RNAi转基因猪为代表,阐述了RNAi技术在哺乳动物细胞中特殊的现象及最有应用前景之一的抗病毒逃逸方法,并详细介绍了RNAi技术在抗病转基因猪中的研究进展。     

转基因体细胞克隆奶山羊成功

青岛森淼实业有限公司与中国科学院遗传与发育生物学研究机构经过两年共同开展乳腺生物反应器项目研究。２００２年９月至１０月７日出生４只带有医用蛋白转基因体细胞的克隆奶山羊，目前仍有３只成活。经过DNA检测，证明已获得了预期的转β－干扰素基因和转抗凝血酶素Ⅲ基因克隆羊。这标志着功能基因转基因羊在国内的首次成功，其中该项目采用的基因打靶技术应用在山羊上为国际先例。（）□转基因体细胞克隆奶山羊成功$新华社     

基因组编辑技术在鱼类基因功能研究及鱼类遗传改良中的应用

利用分子生物学技术将重组基因转移到鱼类中进行人工修饰是目前研究的热点。分子生物学为基因组编辑提供了技术基础,分子生物学领域不断获得新发现为基因组编辑方法的优化与应用提供了有力保障。基因组编辑技术是一种能精确改造生物基因组,实现基因定点敲除和外源基因定点整合的技术,其可实现鱼类的品种改良和鱼类模型构建,亦是研究基因功能的重要手段。目前,运用此技术已建立了多种转基因鱼,并且能够实现外源基因的组织特异性启动,控制外源基因在特定的时间和/或特定的组织器官内表达。文章主要综述了与鱼类基因组编辑相关的方法,以及鱼类作为动物模型在遗传改良上的应用。     

世界首例内源性基因敲除猪诞生

近日，从中科院广州生物医药与健康研究院获悉，该院研究员赖良学研究团队与美国密歇根大学心血管研究中心陈育庆团队合作，首次将锌指核酸酶基因打靶技术应用于猪内源性基因敲除研究，成功敲除了猪内源性PPARγ／基因。这项研究在世界上首次建立了PPARγ／基因敲除猪模型，对糖尿病和心血管并发症的研究有重要应用价值。     

CRISPR/Cas9技术在猪、鸡中的应用研究进展

基因编辑是利用核酸酶在基因组的特定位点产生DNA双链断裂，从而触发细胞自身的DNA损伤修复机制，实现对靶基因序列进行位点特异性修饰。规律成簇间隔短回文重复序列（clustered regularly interspersed short palindromic repeat，CRISPR）及其相关蛋白9（Cas9）系统作为第3代基因编辑技术在农业和基因治疗研究中发挥着重要作用，与传统的锌指核酶和转录激活因子样效应物核酶基因编辑方法相比，它可以靶向基因的任何位点引起DNA双链断裂，实现目标基因的精准敲除或插入外源片段，并能快速、高效地修饰基因组，包括基因敲除、敲入、抑制、激活等，是应用最广泛的基因编辑工具。CRISPR/Cas9技术的出现彻底改变了生命科学、医学和遗传学研究现状。近年来，利用CRISPR/Cas9技术对动物基因组进行修饰，开启了畜禽分子育种的新纪元，不仅极大地推动了现代畜禽养殖技术的发展，而且为人类医学研究做出了特殊贡献，特别是在猪和鸡上。作者以猪和鸡为对象，综述了CRISPR/Cas9技术在异体器官移植供体、人类疾病的生物模型、抗病育种材料、全基因组高通量筛选等方面的研究进展，以及如何利用CRISPR技术快速又简单地生产出基因编辑猪、鸡，为推动CRISPR技术制备其他基因编辑动物提供参考依据。     

基因敲除在畜牧兽医领域的应用和展望

基因敲除是指对DNA序列已知但其功能未知的基因,从分子水平上设计实验,使该基因失活或缺失,从而推测出其生物学功能的基因修饰技术。目前该技术已经应用于畜牧兽医领域:在动物模型的建立方面发展迅速,广泛应用于小鼠、斑马鱼、鸡、牛、羊、猪等物种;功能基因组学方面,通过建立基因敲除动物模型发现了部分基因的功能;药理学方面,基因敲除小鼠可以用来揭示疾病的机理和寻找新的治疗靶点;免疫学方面,通过基因敲除可以从基因水平研究免疫系统的疾病;动物疾病预防和治疗方面,针对各种动物疾病的相应基因敲除也有很多应用;转基因动物研究方面,现已研究出很多调控元件用于转基因动物的外在调控;基因敲除技术在病原微生物的复制、代谢、致病机理和动物生长发育、育种方面也有应用。     

基因打靶技术的研究进展

基因打靶技术是通过外源基因与受体细胞染色体基因组上的序列之间发生同源重组,将外源基因整合到某一特定位点上,从而实现外源基因的定点整合、修饰和改造受体细胞遗传特性的技术。作者简要介绍基因打靶技术的基本原理、产生、筛选策略及该技术的应用等研究进展。     

基因修饰技术及其在动物育种和生物医药领域的应用

基因修饰技术是一种能精确改造生物基因组,实现外源基因定点整合和基因定点敲除的技术。早期的基因修饰形式主要是转基因,随着科学研究的不断深入,新型基因修饰方法也逐渐研发出来,包括敲除、敲入、定点突变等。根据研究或应用的目的,可以将基因修饰技术分为转基因和基因敲除两方面内容。近年来,随着现代分子技术的高速发展,基因修饰技术不断改进创新,其相关方法和技术已逐步应用于改良家畜性状、研究基因功能、制作动物生物反应器以及构建人类疾病动物模型等领域中,使得畜禽基因功能的研究和转基因育种更加高效,在动物遗传育种以及生物医药等领域取得了显著成就,弥补了传统转基因技术的随机整合、遗传不稳定等缺陷,具有广阔的发展前景。作者从动物转基因和基因敲除技术两方面阐述了基因修饰技术的发展现状及发展趋势,并简要概括了基因修饰技术在动物育种和生物医药领域的应用现状。