转双基因(pGH/IGF-Ⅰ)猪胎儿成纤维细胞系的建立及鉴定

本研究旨在建立转双基因（pGH/IGF-Ⅰ）猪胎儿成纤维细胞系,保存转双基因猪的成纤维细胞以便于后续细胞水平研究。试验采用胰蛋白酶消化法对猪胎儿躯干组织进行原代培养,通过原代培养、细胞传代、冷冻保存等成功分离出转双基因猪胎儿成纤维细胞,并对细胞进行了形态学观察、冻存前和复苏后细胞活力检测、生长动力学分析、波形蛋白免疫组化及微生物污染检测等生物学特性分析。结果显示,原代细胞经过胰蛋白酶消化和差速离心分离培养出成纤维细胞,冻存前细胞活力为94.3%,冻存3个月后细胞复苏后活力为91.2%;细胞生长总趋势呈“S”型,经历了潜伏期、指数生长期和平台期3个阶段;细胞波形蛋白在成纤维细胞中呈阳性反应;细胞的细菌、真菌、病毒和支原体检测均为阴性。结果表明本试验成功建立了转双基因猪成纤维细胞系。     

新生广西巴马小型猪肾成纤维细胞体外培养体系的建立

利用微量液体组织块贴壁法原代培养分离新生广西巴马小型猪肾成纤维细胞,进行常规传代培养、冷冻和复苏;通过接触抑制和解除抑制研究该类细胞的增殖潜力,免疫荧光进行鉴定;并通过脂质体介导对分离到的新生广西巴马小型猪肾成纤维细胞分别进行EGFP-N1和DsRed-N1基因转染。结果成功分离到新生广西巴马小型猪肾成纤维细胞,体外可以大量传代和冷冻,目前已经传至50代以上,生长良好;冷冻复苏和接触抑制解除后仍可以正常培养和传代;细胞免疫荧光检测,波形蛋白表达阳性,角形蛋白表达阴性;转染48h后荧光显微镜下可以观察到绿色荧光和红色荧光,表明瞬时转染新生广西巴马小型猪肾成纤维细胞可以获得成功,其中转染DsRed-N1基因的新生广西巴马小型猪肾成纤维细胞已经传至60代以上。结果表明,本试验成功建立了新生广西巴马小型猪肾成纤维细胞的体外培养体系,在体外能稳定培养和传代,并可以成功获得转基因的新生广西巴马小型猪肾成纤维细胞。     

不同方法培养猪胎儿成纤维细胞的研究

随着畜禽资源保存,核移植、转基因动物胚胎学、遗传工程等研究工作的发展,猪成纤维细胞培养工作越来越受到重视。本试验采用胰酶消化法和组织块法培养了大量优质的猪胚胎成纤维细胞,并成功进行了冻存和复苏,建立了一套较完备,快速的猪胚胎成纤维细胞的培养模式。     

转pGH基因猪繁殖性能及外源基因的传代

为探讨外源pGH基因对转基因猪繁殖性能的影响及其在F1代中的遗传情况,对转pGH基因长白猪与普通长白猪繁殖性能的各项指标进行了测定和比较,并对转基因猪F1代仔猪进行了外源基因的检测。结果显示,除转基因母猪F1代仔猪断奶个体质量差异显著(P0.05)外,转pGH基因猪与非转基因猪繁殖性能其他指标均差异不显著;转基因公猪和转基因母猪F1代仔猪转基因阳性率分别为50.00%和47.83%,外源pGH基因对转基因猪的繁殖性能未产生显著影响,并可遗传给下一代。本研究为规范合理选育转pGH基因猪提供了理论依据,为进一步研究节粮型高瘦肉率转基因猪及其在实际生产中的应用奠定基础。     

F1代转pGH、IGF-1双基因猪的阳性鉴定及其差异性表达

为了探究转pGH、IGF-1双基因猪F1代阳性率及表达差异情况,试验采用PCR、测序及荧光定量PCR检测转pGH、IGF-1双基因猪的mRNA表达水平。结果表明:53头F1代猪中17头为阳性猪,阳性率为32.08%,证实外源pGH和IGF-1基因已遗传到F1代中;1月龄到4月龄转双基因猪与非转基因猪IGF-1和pGH基因平均表达量均无显著性差异(P0.05);5月龄转双基因猪pGH和IGF-1基因平均表达量分别是非转基因猪的1.98倍和2.00倍,存在显著差异(P0.05);6月龄转双基因猪pGH和IGF-1基因平均表达量分别是非转基因猪的1.67倍和1.73倍(P0.05)。说明pGH、IGF-1双基因已遗传至F1代猪中,并且能够在猪体内稳定表达。     

敖汉细毛羊毛囊细胞系的建立及鉴定

为了研究敖汉细毛羊毛囊细胞的培养方法,建立敖汉细毛羊毛囊细胞系,保存毛囊细胞便于后续细胞水平毛囊相关基因的深入研究,试验采用胰蛋白酶消化法对初生40日龄以内的敖汉细毛羊皮肤组织进行原代培养,通过原代培养、细胞传代、冷冻保存、复苏等方式成功分离并纯化出敖汉细毛羊毛囊细胞,然后对细胞进行了形态学观察,冻存、复苏活力检测,生长动力学分析,核型分析和微生物污染检测等分析。结果表明:原代毛囊细胞经胰蛋白酶消化及差速离心分离培养出毛囊细胞,冻存前细胞活力为94.19%,冻存1个月复苏后细胞活力为91.96%。细胞生长呈S型,经历潜伏期、指数生长期和平台期三个阶段。细胞的细菌、真菌、病毒和支原体检测均为阴性。试验成功分离了敖汉细毛羊毛囊细胞并建立了敖汉细毛羊毛囊细胞系。     

鸽胚胎成纤维细胞系的构建及生物学特性研究

(目的)为了研究鸽肌肉发育特点,本试验采用组织贴壁法成功培养白羽王鸽成纤维细胞系。(方法)本研究选用白羽王鸽第10日龄胚胎的腿部肌肉组织,采用组织块贴壁培养法进行原代细胞培养,在原代培养第3天开始进行细胞计数,建立其生长曲线,通过细胞冻存和复苏分析细胞活力。(结果)结果表明,贴壁后的细胞呈特征的梭型,多星型,彼此间紧密连接,生长状态良好,细胞生长曲线呈"S"型。细胞复苏率达到80%以上。(结论)通过组织块培养法,已成功建立白羽王鸽鸽胚的成纤维系,为深入研究与鸽肌纤维发育相关的基因功能提供良好的实验平台。     

新疆驴成纤维细胞原代培养及鉴定

为了获得纯度较高的驴皮成纤维细胞并建立成纤维细胞特征鉴定方法,试验采用组织块贴壁法进行原代细胞培养,用胰蛋白酶联合组织块进行差时消化法分离、纯化成纤维细胞,并通过细胞形态观察、PCR扩增鉴定vimentin、免疫荧光染色法鉴定分离的细胞并计算纯度,用CCK-8法检测细胞增殖能力,台盼蓝染色检测冻存前后的细胞活率。结果表明：分离纯化后的细胞呈梭形或纺锤形,具备典型的成纤维细胞形态;PCR扩增可清晰检测到vimentin的表达条带;细胞免疫荧光显示vimentin染色为阳性,DAPI核染呈椭圆形,以上方法均鉴定为成纤维细胞;体外培养的驴皮第3代成纤维细胞48 h后进入对数生长期,其生长曲线呈“S”型;冻存前和复苏后细胞活率差异不显著(P>0.05)。说明经体外分离、纯化成功获得了驴皮成纤维细胞。     

郏县红牛耳成纤维细胞的建立

以郏县红牛耳缘组织为试验材料,采用组织块贴壁法培养,成功建立郏县红牛成纤维细胞系,对其进行细胞形态、细胞活力、生长曲线、染色体核型分析及微生物检测等生物学特性研究。结果显示:细胞形态为典型的成纤维细胞,生长曲线呈S型,细胞倍增时间为39h,冻存前和细胞复苏后活力为98%以上;细胞染色体2n=60,细胞株1-P9、1-P14及2-P9二倍型比例为89.86%、73.82%、78.02%;细菌、真菌、病毒及支原体检查均为阴性。结果表明该细胞系的建立实现了郏县红牛遗传资源在细胞水平上的成功保存。     

奶牛乳腺上皮细胞的原代培养及其生物学特性分析

旨在从奶牛乳腺组织中分离原代乳腺上皮细胞（bovine mammary epithelial cells,BMECs）并传代培养后探究其生物学特性。本研究从屠宰场采集健康泌乳奶牛乳腺并采用改进的酶消化法从乳腺中分离得到原代奶牛乳腺上皮细胞,通过形态学观察、免疫荧光以及染色体核型分析的方法对其进行鉴定。同时,研究第3、第6和第9代乳腺上皮细胞的生长曲线、群体倍增时间和冻存复苏活力,检测不同代次细胞分泌乳蛋白、乳脂、乳糖的功能及泌乳相关基因的表达。结果表明,所分离的奶牛乳腺上皮细胞纯度较好,细胞生长呈现S型,3个代次细胞的群体倍增时间依次为34.87、41.45和65.04 h,冻存复苏活力为88%~93%;在细胞分泌功能方面,诱导培养2 d后均能检测到酪蛋白、甘油三酯和乳糖,且各代次间无显著差异;此外,3个代次的细胞诱导后均能表达乳成分合成相关基因。本研究成功培养了原代奶牛乳腺上皮细胞,并证明直到第9代细胞仍然具有正常的生物学功能,为体外探究乳腺细胞增殖与分化机制提供了良好的试验材料和技术支撑。