诱导牛精子体外获能的培养基及方法

用去透明带金黄地鼠异种精子体外穿透试验,检测冻精复苏经各种处理后的精子穿卵率。发现在４种基本培养基（ＢＯ、ｍＢＷＷ、ＴＹＨ、ＨａｍＦ１０＋ＲＰＭＩ－１６４０）中不加亚牛磺酸时,牛精子不能耐受较高浓度（４μｍｏｌ／Ｌ）钙离子载体（ＩＡ）的刺激（以１０ｍｉｎ计）;而低浓度ＩＡ（低于４μｍｏｌ／Ｌ）处理精子不能诱导获能。生物活性物质,如肝素、咖啡因、亚牛磺酸、肾上腺素单独或联合低浓度ＩＡ处理精子,短期（６ｈ）内也不能诱导获能。当基本培养基中含有亚牛磺酸时,牛精子能耐受高浓度ＩＡ（１０μｍｏｌ／Ｌ）的刺激,并使牛精子获能;亚牛磺酸与肾上腺素、咖啡因联合使用,并在获能液中添加透明质酸酶时,穿卵率进一步提高,获能效果显著改善。以ＨａｍＦ１０＋ＲＰＭＩ１６４０为主的混合培养基,在牛精子的存活时间、穿卵率等方面优于ＢＯ、ｍＢＷＷ、ＴＹＨ培养基。结果表明,用Ｆ１０和１６４０的混合培养基,添加亚牛磺酸、肾上腺素、咖啡因、透明质酸酶,经１０μｍｏｌ／ＬＩＡ处理牛精子１０～１５ｍｉｎ,是快速诱导牛精子体外获能的有效方法     

苯甲酸钠咖啡因对牛精子体外获能的影响——牛精子穿入去透明带仓鼠卵实验

K·Goto 等用含咖啡因的 BO 液(Brac-ketl 和 Oliphant,1975)对牛精子进行体外获能处理,成功地完成了体外受精。部分受精牛卵发育至桑椹期。我们用苯甲酸钠咖啡因(上海兽药厂产)作试剂,添加到 BO 溶,液中,对牛精子进行体外获能培养,发现牛精子很快死亡。为此,我们研究了该种试剂对牛精子体外获能的影响及提高苯甲酸钠咖啡因对牛精子体外获能促进作用的方法。     

金黄地鼠体外受精的初步研究

实验用ＴＹＨ、Ｔ６两种培养液做为精子获能培养液和受精培养液进行了金黄地鼠的体外受精。用经获能培养的精子分别与具卵丘和去卵丘的卵子进行受精培养。结果在ＴＹＨ中分别得到了２７．５％和３３．３％的受精率。在Ｔ６中得到了４７．２％和２６．３％的受精率；用未经获能培养的精子分别与具卵丘和不具卵丘卵子进行受精培养，结果在ＴＹＨ中得到了４１．８％和７．１％的受精，在Ｔ６中得到了４８．５％和５７．７％的受精率。实验结果说明：（１）适用于小鼠体外受精的培养液Ｔ６和ＴＹＨ并不适合于金黄地鼠，其主要原因是不能使精子有效获能；（２）卵丘细胞的存在有使受精率提高的趋势；（３）来自不同公鼠的精子的受精能力差异很大，进行体外受精时必须严格挑选公鼠     

钙离子载体对牛精子体外受精及胚胎发育的影响

在牛精子获能液中添加不同浓度的钙离子载体,应用体外培养技术对牛精子体外获能及早期胚胎发育作了研究。通过对顶体反应、超激活、活率和早期胚胎发育率的观察,筛选出获能液中最适的钙离子载体浓度,作用时间及其有利于早期胚胎发育的最佳浓度。结果表明:钙离子载体在诱导牛精子获能上存在一个浓度-时间阈值,其最佳浓度和时间组合是0.1μM处理2min或者0.15μM处理0.5min,此时的囊胚率最高;钙离子载体的添加不能诱导牛精子获能的发生。     

葡萄糖在牛体外受精及胚胎发育中的影响

在牛精子获能液中添加不同浓度的葡萄糖,应用体外培养技术对牛精子体外获能及早期胚胎发育进行研究,通过观察顶体反应、超激活、活率和早期胚胎发育率,筛选出获能液中最适葡萄糖浓度及其有利于牛早期胚胎发育的最佳浓度.结果表明:葡萄糖是精子获能和维持超激活运动的主要能源物质,其代谢过程中产生的活性氧在牛精子体外获能、受精过程中起重要作用,高浓度(超过9.15 mM)葡萄糖有利于获能的完成;但是对早期胚胎发育不利,对早期胚胎发育来说其最适添加量为6.10 mM,此时的囊胚率最高.     

棕熊精子体外获能及异种穿卵的超微结构研究

对棕熊精子体外获能前后和异种穿卵的超微结构观察表明，棕熊精子全长７７μｍ，由头、颈和尾３部分组成，头部长７．３ｍ，宽２．５μｍ，主要由核、顶体及顶体后区组成；颈部由中心粒和９条纵行分节的节柱组成；尾部全长６８．２μｍ，其中中段长１３．２１ｍ，线粒体为６５－６８旋，主段中央为“９＋２”的微管结构，基外方被９条致密纤维和纤维鞘包裹。精子获能前群集成簇，运动缓慢；获能后精子呈超激活运动。获能的精子质膜膨     

波尔山羊精子体外获能及穿卵效果的研究

通过不同培养液对精子获能效果、获能后穿卵效果的比较,确定培养液的适宜配方及获能液中肝素的适宜添加浓度。精子用含有肝素的3种培养液进行获能处理,每个处理4个重复。试验设计了5个不同的肝素水平,即0、5、10、15、20μg/mL。于获能处理后4 h检查精子的顶体反应率、活力和活精子率。结果表明,添加15μg/mL和20μg/mL肝素能促进精子的获能效果和获能精子的穿卵效果。     

牛卵泡卵体外成熟及其受精能力的研究

本试验主要研究了牛卵泡卵体外成熟、体外受精及其受精过程的发生。从屠宰场收集800枚牛卵泡卵进行体外成熟培养,并用体外获能的精子体外受精。在用m-TCM199培养21、22、24、26、28h后,达到中期Ⅱ的卵母细胞比例分别为33.89％、74.16％、77.78％、86.67％、85.71％;25h后,如果继续培养,成熟的卵母细胞比例不再显著增加。卵母细胞的自身形态显著地影响其成熟效果,A、B、C级卵培养24h后分别有94.60％、55.43％、31.25％的卵母细胞达到中期Ⅱ。卵泡卵在体外滞留8h后,其成熟率(47.11％)明显地低于45min(77.92％)或4h(74.60％)。肝素和钙离子载体A 23187都能诱发牛精子获能,二者在受精效报上差异不显著(P>0.05),并且都有多精入卵现象发生。授精后6h精子进入卵内,精子入卵后2～3h头部膨大,6h后出现早期原核,最早发生卵裂是在授精后30h。     

肝素或钙离子载体诱导牛、羊冻精体外获能的研究

本文采用肝素或钙离子载体(I-A)诱导牛、羊冻精体外获能,根据对去透明带仓鼠卵的穿透情况评定获能效果,并用台盼蓝·姬姆萨(TG)染色观察了精子的死活及顶体状态.结果发现,牛、羊冻精经肝素或I-A处理后与卵子一起培养,2 h穿透仓鼠卵,4 h开始形成雄原核,6 h形成发育良好的雄原核.牛冻精用50μg/mL肝素及0.1μmol/L I-A处理效果最好,穿透率分别为72.8％和92.3％;羊则以20μg/mL肝素及0.3μmol/L I-A为宜,穿透率分别为73.1％和68.O％.咖啡因与I-A或肝素并用均有协同作用,能提高精子的穿透能力,并能促进卵内原核的发育.肝素和I-A均能在体外诱导牛、羊冻精的顶体反应,有顶体反应活精子百分率与穿透率呈强正相关,羊冻精比较脆弱,获能处理后活力较低.     

孕酮对牛精子体外受精及胚胎发育的影响

通过在牛精子获能液中添加不同浓度的孕酮,应用体外培养技术对牛精子体外获能及早期胚胎发育进行了研究。通过对顶体反应、超激活、早期胚胎发育率及其与精子孵育时间对精子活率的观察,筛选出获能液中最适孕酮浓度及其有利于牛早期胚胎发育的最佳浓度。结果表明,单独添加孕酮不能诱导牛精子体外获能;孕酮只能诱导获能精子发生顶体反应,而且有一个剂量依赖关系,以1μg/mL的添加效果最好。当浓度超过1μg/mL、作用时间超过4h时,精子活率下降;获能液中添加孕酮,无论剂量多少,对胚胎体外发育无明显的促进作用。