山羊睾丸和附睾头β防御素家族的表达谱及生物信息学分析

为探明山羊睾丸和附睾头β防御素家族基因表达特点及其蛋白的特性。利用3只7日龄羔羊睾丸和3只成年种公羊睾丸和附睾头的Illumina HiSeqTM2000高通量转录组测序数据,筛选出β防御素家族基因并进行差异表达基因比较分析,利用生物信息学对β防御素家族蛋白特性进行预测。结果显示:在山羊7日龄睾丸、成年睾丸和附睾头中分别表达7、12和33种β防御素,其表达量最高的分别是gDB123、gDB119和gDB124,成年睾丸中特异性表达是gDB33,附睾头中特异表达有21种β防御素。山羊β防御素分子量在6.89~13.85ku,为小分子、极性、带正电荷、疏水性的强碱性多肽。山羊β防御素也是含高度保守6个半胱氨酸的空间构象,基本结构-C-X2-45-CX3-6-C-X3-13-C-X4-7-CC-,其中24种β防御素结构为-C-X5,6-C-X3,4-C-X9-C-X5,6-CC-。有16种β防御素是分泌型糖蛋白,除gDB126无磷酸化位点外,其余的β防御素蛋白均有磷酸化位点。山羊附睾头特异性高度表达有丰富β防御素,它们是一类抗微生物的阳离子肽,在精子成熟过程中形成精子膜上糖被,或精子运动获得的过程中发挥重要作用;也可作为信号分子,某些信号通路中发挥作用。     

山地乌骨鸡β防御素Gal-2基因的克隆及酵母表达载体的构建

为了构建山地乌骨鸡β防御素Gal-2基因酵母表达载体,试验根据GenBank中鸡β防御素Gal-2基因序列设计引物,采用RT-PCR技术从山地乌骨鸡骨髓细胞中扩增出Gal-2基因,经PCR和酶切鉴定后测序,并采用DNAStar软件进行生物信息学分析;再根据毕赤酵母偏爱密码子和山地乌骨鸡β-防御素Gal-2成熟肽编码基因序列设计并合成1对引物,采用PCR技术从重组质粒pMD18-T-Gal-2扩增出其成熟肽编码基因,并将其插入载体pPICZaA,构建重组质粒pPICZaA-Gal-2,将pPICZaA-Gal-2线性化,通过电击转入毕赤酵母菌株GS115,用1%甲醇诱导表达120 h,表达产物纯化后进行Tricine-SDS-PAGE电泳鉴定。结果表明:山地乌骨鸡β防御素Gal-2基因克隆成功;山地乌骨鸡β-防御素Gal-2成熟肽编码基因重组真核表达载体构建成功;山地乌骨鸡Gal-2基因在酵母中得到表达。     

雌性骆驼生殖组织β-防御素-1基因的克隆及其组织表达量的检测

从雌性骆驼输卵管、子宫、子宫颈、阴道组织中提取总RNA，根据已发表的骆驼β-防御素-1基因的cDNA序列设计合成引物，采用RT—PCR扩增出了骆驼β-防御素-1基因；将扩增产物克隆于pBlueselect T载体后进行了序列分析。以伊肌动蛋白（pactin）基因作为内参，对扩增的β-防御素-1基因进行琼脂糖凝胶电泳后，应用凝胶成像分析系统，推断出了不同组织中β-防御素-1基因的表达量。结果，从雌性骆驼生殖各组织上皮均获得了203bp的β-防御素-1基因的扩增片段，且β-防御素-1基因在雌性骆驼生殖道各组织内的表达量不同。结果表明，β-防御素-1在雌性骆驼生殖组织的先天免疫中起重要作用。     

山地乌骨鸡β防御素Gal -2基因的克隆及酵母表达载体的构建

为了构建山地乌骨鸡β防御素Gal -2基因酵母表达载体,试验根据GenBank中鸡β防御素Gal -2基因序列设计引物,采用RT - PCR技术从山地乌骨鸡骨髓细胞中扩增出Gal -2基因,经PCR和酶切鉴定后测序,并采用DNAStar软件进行生物信息学分析；再根据毕赤酵母偏爱密码子和山地乌骨鸡β -防御素Gal -2...     

蒙古绵羊β-防御素基因相对表达水平实时定量PCR方法的建立

为了利用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR技术对蒙古绵羊雌性生殖道β-防御素基因表达水平进行相对定量测定,建立蒙古绵羊β-防御素基因相对表达水平的实时荧光定量PCR方法,试验根据GenBank中羊β-防御素基因序列设计合成引物,进行实时荧光定量PCR,同时以β-Actin为内参基因对β-防御素基因进行均一化处理,利用荧光阈值(Ct值)计算β-防御素基因的相对表达量.结果表明:扩增产物为β-防御素;利用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR技术可以测定蒙古绵羊β-防御素基因表达水平相对含量.     

维生素D3对丝毛乌骨鸡组织中β-防御素基因的表达调控

本试验旨在研究不同水平维生素D3对丝毛乌骨鸡组织中β-防御素(AVBDs)基因表达的调控.采用实时荧光定量PCR方法检测饲喂不同水平(800、1 600、3 200和6 400 IU/kg)维生素D3对丝毛乌骨鸡胸腺、十二指肠、空肠、回肠、盲肠和法氏囊中3个β-防御素(AVBD-1、AVBD-5和GAL-1)基因表达水平的影响.结果表明:3个β-防御素基因在6个组织中均有表达,其中乌骨鸡AVBD-1和GAL-1基因的最高表达水平都在采食了3 200 IU/kg维生素D3时的空肠;AVBD-5基因的最高表达水平在采食了1 600 IU/kg维生素D3时的十二指肠;在依次采食维生素D3800、1 600、3 200和6 400 IU/kg的乌骨鸡组织中,3个β-防御素基因都存在先升后降的表达趋势.结果表明,β-防御素基因在同一组织的表达水平与维生素D3饲喂水平存在剂量关系,适宜的维生素D3饲喂水平能上调这3个β-防御素基因在乌骨鸡组织中的表达量.     

滩羊β-防御素基因的克隆和表达

选取滩羊β-防御素分布较多的气管、食道和口腔等部位的黏膜组织,提取组织总RNA,RT-PCR获得滩羊β-防御素基因全序列.构建逆转录病毒表达载体,实现滩羊β-防御素基因的表达.经测序后得到滩羊β-防御素编码区的核苷酸序列(64个氨基酸).成功构建了带有滩羊β-防御素基因的逆转录病毒载体pLEGFP-SBD,在蓝光激发光下能观察到绿色荧光蛋白,并用SDS-PAGE方法检测到分子量约为8 kD的目的蛋白.该蛋白具有抗细菌和抑制VSV病毒增殖的活性.     

猪源β-防御素2和3的研究进展

防御素是一类阳离子抗菌肽,广泛存在于动物和植物体内。猪源β-防御素2和β-防御素3能抵抗猪体内病原微生物,并能调节机体免疫功能,对生殖发育也有一定的生理作用。猪源β-防御素2能促进仔猪生长,对猪红细胞毒性低,能在毕赤酵母中高效表达,其转基因猪也具有较好的抗病性能。因此,猪防御素具有潜在的应用价值。本文就猪源β-防御素2和β-防御素3在体内的表达分布和调控因素、参与调节的信号通路、在生殖发育和畜牧养殖方面的新功能及应用潜力进行综述。     

党参对小鼠抗疲劳及耐缺氧作用的观察

目的:观察党参对小鼠抗疲劳及耐缺氧的作用。方法:取小鼠160只,随机均分16组,每4小组为一组实验组,共4组实验组。实验组Ⅰ分别为对照组(口服和腹腔注射生理盐水),Ⅱ^Ⅳ试验组分别以5.0g/kg(低剂量)、10.0g/kg(中剂量)、20.0g/kg(高剂量)给小鼠口服党参水煎液和腹腔注射党参水煎醇沉液,1次/d,连续给药3d,最后一次给药后30min,测定小鼠负重游泳时间和耐缺氧时间。结果:与对照组比较,腹腔注射党参水煎醇沉液各剂量组负重游泳时间和耐缺氧时间显著延长(P<0.01),口服党参水煎液各剂量组与对照组无显著差异。结论:党参水煎醇沉液腹腔注射能够提高小鼠抗疲劳、耐缺氧的能力,而水煎液口服效果不明显。     

基因工程鲎素对小鼠非特异性免疫的影响及作用机制

抗菌肽具有抗感染和介导宿主天然免疫防御作用,是理想的抗生素替代物,实验室前期用研发的基因工程鲎素(TPI)对小鼠金黄色葡萄球菌感染模型开展的治疗效果显示,小鼠感染模型肺部及其他脏器中菌含量明显减少,肺部的病理变化减轻,治疗效果较好。本试验在此基础上,从宿主天然免疫防御的角度开展了TPI对小鼠非特异免疫功能的影响及机制研究。用滴鼻的方式给小鼠使用TPI,测定不同剂量TPI对小鼠体征指标,包括:体质量、肺廓清指数、脾脏指数的影响。用腹腔注射的方式给小鼠使用TPI,测定非特异性免疫相关指标,包括:小鼠单核细胞和巨噬细胞的吞噬能力、小鼠β-防御素2(mBD-2)和小鼠胸腺肽β4的表达水平,结果显示与对照组相比,TPI可提高小鼠增重,可显著提高小鼠的巨噬细胞吞噬能力及廓清指数;可上调小鼠脏器中mBD-2和小鼠胸腺肽β4的表达水平,增强宿主防御能力,激活机体非特异性免疫,提示TPI不但能直接杀伤病原体,还能够激活和协同宿主防御肽共同发挥非特异免疫作用。     

原位杂交技术分析蒙古绵羊胎儿β-防御素的表达

原位杂交(ISH)技术采用特异性探针在组织切片上与细胞内特定的基因进行分子杂交,从形态学角度对组织细胞内某特定基因通过光镜进行时空表达研究[1].使用Digoxin标记探针进行原位杂交具有高敏感性和特异性、操作简便、无同位素污染等优越性.β-防御素是近年来发现的一类富含精氨酸、带正电荷的抗微生物肽,主要由哺乳动物黏膜上皮细胞产生,分布于呼吸道、胃肠道、生殖道表面和腺体中,形成机体抵抗病原体的第一道防线,在机体的先天性免疫防御中发挥着重要作用[2].本研究用Digoxin标记的原位杂交技术来检测β-防御素mRNA在蒙古绵羊胎儿体内的表达,这对研究β-防御素在蒙古绵羊胎儿的先天性免疫防御机制具有重要意义.     

β-防御素在金华猪和长白猪肠道中表达规律的研究

本试验旨在研究金华猪和长白猪从初生到60日龄不同肠段中3种β -防御素[β-防御素-1( pBD-1)、β -防御素-2( pBD-2)和β-防御素-3( pBD-3)]基因表达规律,并比较β -防御素基因在2个品种之间的表达差异.选取初生、20、40和60日龄的金华猪和长白猪各3头,屠宰后取十二指肠、空肠、回肠和结肠...     

粤北三黄鸡β-防御素基因的表达及其生物活性研究

采用RT-PCR 方法从三黄鸡肝脏中扩增β-防御素 Gal-6基因的 cDNA 片段,构建重组表达质粒pGEX-6p-1-GAL-6,将重组质粒转化至大肠杆菌BL21进行原核表达。结果表明,成功获得201 bp的鸡β-防御素基因,SDS-PAGE 电泳分析表明,原核表达的重组鸡融合蛋白分子质量约为32 kD。此外,表达的该重组蛋白对金黄色葡萄球菌有较高抗菌活性。     

两种断乳方式对小鼠乳腺中β-防御素1mRNA表达的影响

β-防御素是近年来发现的具有广谱抗菌活性并且参与机体免疫调节的活性多肽。试验目的为研究β-防御素1(β-defensin 1,Defb1)mRNA在自然断乳和强制断乳时表达的变化。72只雌性小鼠在分娩后分为强制断乳组(n=36)、自然断乳组(n=36),于强制断乳(泌乳12d)和自然断乳(泌乳21d)后5d内(1d、2d、3d、4d、5d)及断乳当天(0d)分别处死小鼠,取第4对乳腺组织,半定量RT-PCR检测Defb1的表达变化。结果显示:与0d相比,强制断乳后4d,Defb1mRNA的表达显著下调(P<0.05),达到最低值;与0d相比,自然断乳后1d和2dmRNA水平即显著降低(P<0.05),3d时Defb1转录水平出现显著升高(P<0.05),达到峰值。     

两种断乳方式对小鼠乳腺中β-防御素1mRNA表达的影响

β-防御素是近年来发现的具有广谱抗菌活性并且参与机体免疫调节的活性多肽。试验目的为研究β-防御素1（β-defensin1,Defbl）mRNA在自然断乳和强制断乳时表达的变化。72只雌性小鼠在分娩后分为强制断乳组（n=36）、自然断乳组（n=36）,于强制断乳（泌乳12d）和自然断乳（泌乳21d）后5d内（1d、2d、3d、4d、5d）及断乳当天（0d）分别处死小鼠,取第4对乳腺组织,半定量RT—PCR检测Defbl的表达变化。结果显示：与0d相比,强制断乳后4d,DefblmRNA的表达显著下调（P〈0．05）,达到最低值;与0d相比,自然断乳后1d和2dmRNA水平即显著降低（P〈0．05）,3d时Defbl转录水平出现显著升高（P〈0．05）,达到峰值。     

牦牛附睾组织不同区段防御素家族基因的表达谱和生物信息学分析

牦牛是高原地区牧民收入的主要经济来源之一，如何提高牦牛的繁殖力一直备受关注。β-防御素是一类具有广谱抗菌活性的肽，研究牦牛β-防御素（Bos mutus β-defensins,bBD）家族在附睾的表达具有重要意义。本实验使用实时荧光定量PCR技术分析牦牛附睾不同区段β-防御素基因的表达情况。结果显示，共有9个β-防御素基因在附睾头、体和尾的表达存在极显著差异。bBD109、bBD119、bBD121、bBD123、bBD128、SPAG11基因集中于附睾头部表达；bBD125与bBD136集中于附睾体部表达；bBD15同时在附睾头部和体部高表达。结合生物信息学分析发现，这9种β-防御素均存在保守的氨基酸序列、反向折叠的β-转角；bBD136脂溶性最高、疏水性强，bBD125和SPAG11相反；β-防御素基因编码蛋白均为不稳定蛋白（bBD123除外），并且预测分析都存在SP型信号肽（除bBD125外）；β-防御素家族基因在附睾不同区段的差异性表达情况以及编码蛋白质的各种理化性质与结构组成等特征都表明其可能在精子成熟过程中发挥着重要作用。     

荷斯坦牛中性粒细胞β-防御素基因克隆及其原核表达质粒的构建

根据已发表的牛β-防御素基因序列设计引物,从具有临床乳腺炎症状的荷斯坦奶牛血液中性粒细胞中提取RNA,克隆牛β-防御素基因并插入到原核表达载体pQE-30中,构建了原核表达质粒pQE-30/β-defesion。测序结果表明,克隆的目的基因长189bp,编码1个氨基酸,与已报道的牛β-防御素氨基酸序列同源性达95.6%。本研究为牛乳腺防御素的表达及功能、活性的研究奠定了一定的基础。     

绵羊β-防御素的发育表达和分布

应用实时荧光定量PCR研究了蒙古绵羊个体发育过程β-防御素mRNA的表达。随着发育的逐渐成熟,SBD-2基因在十二指肠、肺及子宫中的表达均呈一致性地逐渐增长趋势;不同组织中的SBD-2基因表达有差异,十二指肠中的表达最丰;在同一年龄组的不同个体间变化较大,提示防御素的表达调控可能受到环境的多因子动态影响;β-防御素在胎儿体内表达较普遍,说明在胎儿先天性免疫中有着重要的作用。     

β-内啡肽基因在小鼠体内表达的生物效应研究

本研究采用壳聚糖及其改性分子离子交联法包裹制备β-内啡肽基因重组质粒纳米颗粒,然后肌肉注射小鼠,另设口服重组酵母菌组,研究β-内啡肽基因在小鼠体内表达的生物效应。结果发现:肌注质粒与口服酵母菌均可促进小鼠生长,增加小鼠体重;外周血中CD4~+T、CD8~+T细胞数量以及小鼠血清Ig G含量均显著提高(P0.05),免疫相关基因的相对表达量也都显著提高(P0.05);试验组小鼠血清中的β-内啡肽含量较对照组明显增加(P0.05)。表明β-内啡肽基因重组质粒壳聚糖纳米颗粒能有效调节小鼠免疫反应,增强机体抗应激的能力。     

马鹿β-防御素-1cDNA全长克隆、序列信息及表达分析

为了研究马鹿β-防御素-1(Red deerβ-defensin-1,redBD-1)基因的结构与功能,揭示该基因的组织表达规律。本研究利用PCR结合RACE(Rapid-amplification of cDNA ends)技术从马鹿舌黏膜中克隆redBD-1基因的cDNA全长序列并对其进行了生物信息学分析,同时采用Real-time quantitative PCR(RT-qPCR)技术检测该基因在各组织的表达情况。结果表明,redBD-1基因的cDNA全长序列为455bp,开放阅读框(ORF)为192bp,编码64个氨基酸。生物信息学分析表明,redBD-1蛋白的理论分子量为6.94ku,有10个带正电荷的氨基酸残基,无带负电荷的氨基酸残基,理论等电点为10.85。预测redBD-1蛋白有一个分泌信号肽结构,无跨膜区,主要在细胞外发挥生理功能;6个保守的半胱氨酸残基分别以Cys1-Cys5、Cys2-Cys4和Cys3-Cys6连接形成3个分子内二硫键;成熟蛋白的三级结构是由β-折叠、延伸和无规则卷曲构成。redBD-1基因编码的氨基酸序列同源性最高的是梅花鹿β-防御素(siBD-1)为98.4%,其次是水牛肠β-防御素(BEBD)为92.2%,与人β-防御素-2(HBD-2)同源性最低仅为35.9%。RT-qPCR结果得出,redBD-1在被检器官中均有表达,在消化系统、呼吸系统以及生殖系统的大部分器官表达量较高,肝、肾和脾等实质性器官表达量相对较低。本试验为今后深入研究防御素基因功能以及马鹿黏膜免疫系统提供理论依据。