感染星天牛幼虫高致病力金龟子绿僵菌菌株的筛选

室内测定了6株金龟子绿僵菌菌株的菌落生长速率、产孢量及其对星天牛幼虫的致病力。结果表明：不同菌株生长速率和产孢量存在显著差异,在PPDA培养基上,菌株MaYTTR04和MaZPTR01的菌落生长较快,培养15 d后,菌落直径分别为6.3 cm和5.9 cm;产孢量以菌株MaYTTR04最大,MaZPTR01其次,分别为2.0×10^8孢子·cm^-2和1.1×10^8孢子·cm^-2,显著高于其他菌株。生物测定结果表明,不同绿僵菌菌株对星天牛幼虫的致病力差异显著,接种20 d后,星天牛幼虫累积死亡率在40%～96.7%之间;菌株MaZPTR01和MaYTTR04对星天牛幼虫致死率分别达到96.7%和93.3%;僵虫率也高,分别达到86.7%和80%;致死中时（LT50）短,分别为5.71 d和5.80 d。研究结果表明,菌株MaZPTR01和MaYTTR04对星天牛幼虫致病力较强,同时具备良好的生产性能,故可作为优良菌株用于星天牛的防治。     

两株虫生真菌对草地贪夜蛾的致病力及高毒力菌株与卵寄生蜂的相容性

为有效防控新入侵我国的重大农业害虫草地贪夜蛾 Spodoptera frugiperda,采用浸叶法测定球孢白僵菌 Beauveria bassiana菌株Bb1237、 Bb201017、 Bb20091317及金龟子绿僵菌 Metarhiziumanisopliae菌株Ma189和莱氏绿僵菌 M. rileyi菌株MrCDTLJ1对草地贪夜蛾3龄幼虫的致病力,筛选对草地贪夜蛾3龄幼虫有较强致病力的菌株,并测定该菌株对草地贪夜蛾3龄幼虫的致病力和对其天敌的致死率。结果显示,球孢白僵菌Bb20091317和莱氏绿僵菌MrCDTLJ1对草地贪夜蛾3龄幼虫的累计校正死亡率显著高于其他菌株,分别为95.59%和97.06%,致死中时LT₅₀分别为3.42 d和5.72 d, LC₅₀分别为7.05×10⁶个/mL和2.25×10⁵个/mL。2种菌在高浓度1×10⁸个/mL下对草地贪夜蛾天敌夜蛾黑卵蜂 Telenomus remus和玉米螟赤眼蜂 Trichogramma ostriniae成蜂的致死率也仅介于15%~20%之间。表明球孢白僵菌Bb20091317和莱氏绿僵菌MrCDTLJ1不仅对草地贪夜蛾有高致病力,同时与夜蛾黑卵蜂和玉米螟赤眼蜂有较好的相容性。     

4种虫生真菌对朱红毛斑蛾幼虫的室内毒力测定

以朱红毛斑蛾幼虫为研究对象,研究1株自朱红毛斑蛾幼虫僵虫上分离得到的球孢白僵菌Beauveria bassiana PfBb,与3种常用虫生真菌(金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae Mafz01、卵孢白僵菌B. brongniartii 400和球孢白僵菌B.bassiana DSXJ-07)进行致病力比较,以期筛选出高效的虫生真菌用于朱红毛斑蛾的生物防治。采用浸虫法,测定4种虫生真菌不同浓度下朱红毛斑蛾幼虫的校正死亡率及僵虫率。室内毒力测定结果表明,金龟子绿僵菌Mafz01、卵孢白僵菌400、球孢白僵菌DSXJ-07和球孢白僵菌PfBb对朱红毛斑蛾幼虫的致死中浓度分别为3.1×10~8、1.1×10~8、1.9×10~7和2.8×10~5孢子/mL;1.0×10~9孢子/mL浓度处理下的僵虫率分别为52.5%±6.45%、52.5%±6.45%、73.75%±6.29%和97.50±2.89%,且球孢白僵菌PfBb处理后的朱红毛斑蛾幼虫僵虫率显著高于其他3种虫生真菌。4种虫生真菌对朱红毛斑蛾幼虫毒力大小依次为球孢白僵菌PfBb球孢白僵菌DSXJ-07卵孢白僵菌400金龟子绿僵菌Mafz01。推荐使用浓度大于1.0×10~7孢子/mL的球孢白僵菌PfBb防治朱红毛斑蛾幼虫。     

莱氏绿僵菌Mr006鉴定及对草地贪夜蛾致病力

收集草地贪夜蛾致病性莱氏绿僵菌,丰富昆虫病原真菌资源,为草地贪夜蛾绿色防控生防制剂开发提供依据。采用形态学和ITS-r DNA序列分析相结合的方法对菌株Mr006进行了鉴定,以浸渍法生物测定了该菌株对草地贪夜蛾幼虫和蛹的致病力,并进行了田间应用效果评价。结果表明,分离的Mr006菌株鉴定为莱氏绿僵菌;该菌株对草地贪夜蛾幼虫、蛹均有致病力,用孢子浓度为1×10⁷孢子/mL接种后,1～5龄幼虫的校正死亡率分别为91.16%、88.38%、70.71%、53.03%和22.73%,蛹的校正死亡率为76.26%;对草地贪夜蛾1～5龄幼虫和蛹的LC₅₀分别为3.55×10⁴、8.23×10⁴、3.63×10⁶、4.16×10⁷、4.23×10⁸和2.57×10⁵孢子/mL;用孢子浓度为1×10⁸孢子/mL接种后,1～5龄幼虫和蛹的LT₅₀值分别缩短至3.47、3.94、4.90、...     

一株莱氏绿僵菌的筛选及其对草地贪夜蛾的毒力

开展草地贪夜蛾病原真菌的筛选和毒力测定可为草地贪夜蛾的绿色防控提供新的生物制剂。本研究从广西南宁田间采集的草地贪夜蛾幼虫僵虫上分离获得一株病原真菌,采用形态学和ITS-rDNA序列分析相结合的方法对该菌株进行了鉴定,并采用浸虫法测定了该菌株对草地贪夜蛾的致病力。结果表明新分离的菌株为莱氏绿僵菌Metarhizium rileyi,编号为CDTLJ1;该菌株对草地贪夜蛾幼虫、预蛹、蛹均有致病力,1.20×10⁷孢子/mL浓度下,接菌处理后第6 d,2~5龄幼虫的累积校正死亡率均达100%,6龄幼虫的累积校正死亡率为98.33%,预蛹和蛹的累积校正死亡率分别为28.33%、20.00%,草地贪夜蛾2~6龄幼虫的LT50值从3.91 d升至4.24 d;菌株CDTLJ1对草地贪夜蛾3龄幼虫的致死率随孢子悬浮液浓度的升高而增加,当浓度达1×10⁸孢子/mL时,幼虫的致死LT50为4.10 d,接菌处理后第6 d,3龄幼虫的累积校正死亡率达100%,LC₅₀为1.12×10⁴孢子/mL。结果表明,莱氏绿僵菌CDTLJ1对草地贪夜蛾有良好的生防潜力,具有进一步深入研究和开发利用的前景。     

黄绿绿僵菌KM1104对灰飞虱的毒力

为了筛选防治灰飞虱的高毒力生防真菌菌株及明确黄绿绿僵菌对灰飞虱的侵染致病温度条件,室内测定了黄绿绿僵菌KM1104菌株在24~30℃下对灰飞虱成虫及3龄若虫的毒力。结果表明:黄绿绿僵菌菌株KM1104对灰飞虱成虫和3龄若虫均具有较强的毒力,其中对成虫的毒力高于3龄若虫,在24~30℃下对成虫和3龄若虫的LC50分别为1.45×103~7.14×104和7.25×103~3.69×105孢子/mL,致死中时LT50分别为3.02~11.53d和6.85~11.58d。不同温度下黄绿绿僵菌KM1104菌株对灰飞虱的毒力不同,其中30℃下毒力最强,对成虫和3龄若虫的致死中浓度LC50分别为1.45×103和7.25×103孢子/mL,接种1.01×105~1.01×108孢子/mL后对成虫和3龄若虫的致死中时LT50分别为3.02~6.86d和6.85~9.35d。综合以上结果,黄绿绿僵菌菌株KM1104具有良好的灰飞虱生防制剂开发潜力,且在30℃下使用致病力最强。     

一株绿僵菌的鉴定、生物学特性及对东亚飞蝗的致病力

从河南省汝阳县林地里采集到的天然罹病的黑蚱蝉僵虫中,分离到1株绿僵菌Metarhizium spp.,根据菌落培养特征和产孢结构特性,结合菌株ITS1-5.8s RNA-ITS2基因序列,鉴定为金龟子绿僵菌M.anisoliae,编号Ma121.测定了温度、光照、pH值以及碳氮源、微量元素对菌株Ma121菌丝生长和产孢的影响,得到菌株Ma121生长和产孢的适宜条件为温度25～30℃、全黑暗、培养基以大豆粉为碳源和蛋白胨为氮源并添加锰盐、pH 7.室内测定了菌株Ma121对东亚飞蝗若虫的致病力,结果显示菌株Ma121高浓度孢悬液(1×107～1×108孢子/mL)对若虫的校正累计死亡率均达到90％以上,致死中时(LT50)少于5d.说明菌株Ma121能够有效侵染东亚飞蝗若虫并将其致死,菌株Ma121可以作为优良菌株进行杀蝗生物农药的进一步研发.     

小菜蛾高致病力绿僵菌的筛选、鉴定及培养特性研究

为开发蔬菜害虫小菜蛾Plutella xylostella的高致病力真菌生物农药,以3龄小菜蛾幼虫为供试虫源,测定了25株虫生真菌菌株对小菜蛾的致病力,从中筛选出1株对小菜蛾幼虫有较高致病力的菌株CQM125。生测结果显示,在20℃、1.0×108孢子mL 1菌株CQM125菌液处理小菜蛾幼虫的LT50为3.97 d;25℃、5.0×107孢子mL 1菌液的LT50为2.44 d;在25℃下,第7 d的LC50为2.31×104孢子mL 1;接种处理后,20℃、8 d的小菜蛾死亡率为84.22%,对小菜蛾表现出良好的控制效果。依据菌株的形态特征、培养性状和rDNA ITS序列分析将菌株CQM125鉴定为金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae。对该菌株的培养基和培养条件进行了优化,优化后的产孢培养基为PPDA,其中葡萄糖2%,蛋白胨0.5%;最适产孢温度30℃,最适产孢pH值为6.0;最适光照条件为前6 d黑暗,后8 d光照。     

两株绿僵菌菌株的分离鉴定及其对花生蛴螬的致病力

从山东日照、青岛两地的花生生产示范大田采集得到天然罹病的花生蛴螬僵虫中,分离得到两株绿僵菌菌株（Metarhizium spp.）。对两株菌株的ITS1-5.8S rRNA-ITS2区域进行序列分析,并结合菌株的形态和培养特征,分别确定为平沙绿僵菌M.pingshaense（CQM132）和贵州绿僵菌M.guizhouense（CQM135）。筛选了菌株CQM132和CQM135的最适培养温度和最适培养基,结果表明两个菌株均在28℃温度条件下,在PPDA培养基上的生长速度最快且产孢时间显著最短。室内测定了菌株CQM132和CQM135对铜绿丽金龟和暗黑腮金龟幼虫（蛴螬）的致病力。结果表明,菌株CQM132和CQM135对铜绿丽金龟和暗黑腮金龟幼虫均具有较强的毒力。菌株CQM132的高浓度孢悬液（1.1×107～1.1×108孢子mL-1）对两种金龟幼虫的累计死亡率均达到85%以上,致死中时LT50≤7.58 d。菌株CQM135的高浓度孢悬液（1.1×107～1.1×108孢子mL-1）对两种蛴螬的累计死亡率均达到90%以上,致死中时LT50≤6.85 d。相比而言,菌株CQM135对两种蛴螬的致病力略优于菌株CQM132,可以作为优良菌株进一步研究。     

稻蛀茎夜蛾高致病性球孢白僵菌菌株筛选

稻蛀茎夜蛾Sesamia inferens是南方稻区的重要害虫,为了寻找针对该虫的生物防治措施,本研究从水稻田越冬稻蛀茎夜蛾的僵虫中分离获得了10株培养性状较好的球孢白僵菌Beauveria bassiana,在室内研究了这10株菌株对稻蛀茎夜蛾的致病力,筛选出了高致病力菌株SI027。试验结果表明,菌株SI027处理稻蛀茎夜蛾3龄幼虫后10 d的LC50为5.28×105孢子/m L。在1×106、1×107和1×108孢子/m L浓度的菌液处理下,稻蛀茎夜蛾3龄幼虫的LT50分别为7.26 d、4.65 d和3.38 d。     

6龄黏虫幼虫受球孢白僵菌侵染后生长发育及体内成瘤反应的变化

为探讨黏虫被球孢白僵菌侵染后生长发育情况及其体内的免疫反应,设置孢子浓度为104、5×104、105、5×105、106个/mL及5×106个/mL的球孢白僵菌菌液注射黏虫6龄初幼虫,研究球孢白僵菌对黏虫校正死亡率、羽化率、蛹重等生长发育指标的影响以及成瘤反应的浓度依赖效应。结果表明,6龄幼虫的校正死亡率随菌液浓度升高而逐渐增加。蛹重随菌液浓度增加而下降,但仅在106、5×106个/mL浓度处理时蛹重显著低于对照。同时,在孢子浓度为5×105、106、5×106个/mL时羽化率较对照显著降低,雌雄成虫寿命也显著缩短,而6龄幼虫至成虫羽化的发育历期在105、5×105、106、5×106个/mL浓度处理时较对照显著延长。此外,白僵菌侵染诱发黏虫免疫成瘤反应,并且具有明显的时间和浓度效应。注射84 h内,黏虫体内成瘤的数量随注射时间延长而递增,其后不再增加;同时,成瘤数量随着菌液浓度升高而增加,至106个/mL浓度时不再显著上升。该结果为揭示黏虫抵抗真菌侵染的免疫防御机制以及所产生的免疫代价提供了科学依据。     

绿僵菌CQMa128乳粉剂对蛴螬时间-剂量-死亡率模型分析

用拌土法测定了金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae菌株CQMa128乳粉剂对蛴螬3龄幼虫的毒力。结果表明：土壤含有1×106~1×108孢子/g绿僵菌乳粉剂时,蛴螬的校正死亡率随着绿僵菌孢子浓度的增加和作用时间的延长而增大,土壤含有5×107孢子/g绿僵菌乳粉剂时蛴螬的校正死亡率达85.2%。运用时间-剂量-死亡率模型对生测数据进行拟合,通过Hos-mer-Lemeshow拟合异质性检验,并估计了该制剂对蛴螬的致死剂量与致死时间。随着接种天数的增加,相应的LD50和LD90随之降低,剂量效应逐渐增强。土壤中含有3×107、5×107和1×108孢子/g绿僵菌乳粉剂处理的LT50值分别为10.18、8.42、6.79d。当土壤含有1×108孢子/g绿僵菌乳粉剂时,蛴螬死亡率可达90%以上,LT90为10.50d。该绿僵菌制剂在蛴螬的生物防治中具较强的应用潜力。     

保定蝗区土壤绿僵菌对飞蝗高毒力菌株的筛选

对由保定蝗区土壤中分离到的金龟子绿僵菌中毒力较好的10个菌株,测定了对东亚飞蝗3龄蝗蝻的僵虫率,并选出3株发病效果好的菌株M6 448、M5 110、M7 355,再采用点滴接种法对1～5龄蝗蝻及成虫进行了毒力测定。结果表明,不同菌株对飞蝗的毒力与菌株种类和蝗蝻龄期有密切关系,3株菌株对3龄蝗蝻处理5 d的LD50分别为7.33×103、5.90×103、2.69×104个/mL,LT50分别为：3.70、5.86、7.50 d;对成虫的LD50分别为5.49×105、5.09×106、2.28×106个/mL,LT50分别为8.03、8.07、8.57 d。以毒力较高的M6 448菌株进行田间罩笼试验,10 d对3龄蝗蝻校正防治效果可以达到93.6%,与2 000倍4.5%高效氯氰菊酯乳油结果96.2%相近,具有进一步研究的价值。     

绿僵菌IMI330189菌株突变体库的建立及毒力相关突变株的筛选

为了研究绿僵菌毒力相关的功能基因,采用农杆菌介导的转化方法将携带苯菌灵抗性标记基因的T—DNA导入绿僵菌IMI330189中,获得了绿僵菌突变体库,采用人工饲料诱饵法测定了突变株对3龄东亚飞蝗Locustamigratoria的毒力。研究发现,突变株对东亚飞蝗的毒力都有不同程度的改变,在诱饵剂浓度为10^8孢子．g-1下,野生型菌株IMI330189对东亚飞蝗的致死中时（LT50）为4-3d;突变株189-1的毒力略有提高,其LT50值为3．5d;其余突变株的毒力均降低,且突变株189—4、189—5、189—6、189—10、189-11、189—13和189—15几乎丧失了对东亚飞蝗的毒性,校正死亡率小于50％。本研究为进一步分离毒力相关基因、探索绿僵菌的致病机制奠定了基础。     

5种微生物杀虫剂对3种水稻主要害虫的室内毒力比较及致死表型观察

为发展水稻害虫的绿色防控技术,本研究采用浸渍法比较了5种微生物杀虫剂(苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis、短稳杆菌Empedobacter brevis、球孢白僵菌Beauveria bassiana、金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae CQMa421和甘蓝夜蛾Mamestra brassicae核型多角体病毒)对3种水稻主要害虫(二化螟Chilo suppressalis、稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis和褐飞虱Nilaparvata lugens)的室内毒力及致死表型。结果表明,在田间推荐中剂量处理条件下,5种药剂对稻纵卷叶螟幼虫均具有较好的速效性,处理后第2天幼虫的校正死亡率(46.7%～86.7%)就显著高于对照组(0%),第5天稻纵卷叶螟幼虫校正死亡率可达到85.7%～100%,均极显著高于二化螟的校正死亡率(4.76%～23.81%),二化螟第6天时的校正死亡率为25.0%～55.0%。对褐飞虱若虫,金龟子绿僵菌CQMa421的速效性和毒力均优于球孢白僵菌,经金龟子绿僵菌CQMa421处理后2 d的存活...     

金龟子绿僵菌黏附素基因mad1的敲除及功能分析

金龟子绿僵菌能够寄生昆虫,也能与植物共生。黏附素MAD1是绿僵菌与宿主互作初期的黏附因子。已知它在昆虫的侵染和致病中起重要作用,但与植物的互作机制报道甚少。为了研究MAD1在绿僵菌与植物共生中的作用,我们通过同源重组构建了金龟子绿僵菌mad1敲除株,并检测了敲除株的生长、产孢、孢子萌发及毒力等生物学特性,进一步利用qRT-PCR分析了MAD1在调节花生免疫响应中的作用。结果显示,与野生型菌株相比,敲除株产孢量降低了43.67%,分生孢子萌发中时为27.69 h,显著长于野生型菌株的13.43 h。敲除株对家蚕的半致死时间LT50为8.9 d,较野生型菌株的7.62 d显著延长。敲除株处理花生6 h后,花生免疫类基因CNGC1、PCD4,抗病基因SWEET10及转录因子WRKY41、MYB86的转录水平出现显著上调,而钙调素CML5、CML19的转录表达受到明显抑制。本研究证明了mad1是金龟子绿僵菌产孢、孢子萌发及毒力的正相关基因,并且MAD1在金龟子绿僵菌与植物相互作用初期,抑制植物抗性级联反应,减弱过敏反应,降低对微生物的抵御能力,同时增强共生信号的传导,这些作用有助于金龟子绿僵菌在花生根组织上定殖。     

苏云金芽胞杆菌与绿僵菌对椰心叶甲的协同控制作用

测定了3个苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）菌株F6、NBT-18、Rt184与绿僵菌（Metarhizium anisopliae）菌株HK4复配剂对椰心叶甲致死作用。结果表明,3株Bt菌株对绿僵菌控制椰心叶甲的效果都有不同程度增强。在HK4孢子含量为106个/mL时,F6与HK4、NBT-18与HK4的复配剂处理椰心叶甲,5 d后死亡率分别达71.67%、61.35%,与单独用HK4分生孢子处理（死亡率为30.71%）相比,具有显著差异;而Rt184和HK4复配剂处理的死亡率与HK4单独处理无显著差异。在HK4孢子含量为107个/mL时,3种复配剂处理椰心叶甲5 d后,死亡率分别为82.74%、83.07%、68.61%,均与绿僵菌HK4单独处理（死亡率61.49%）有显著差异;且3个Bt菌株均能使绿僵菌HK4菌株侵染椰心叶甲的致死时间提前。     

蜡蚧轮枝菌的新株系(Lecanicillium lecanii-01Et)对介壳虫的毒力测定

对从未喷药的中国农业大学校园露地栽培的辣根上采集的介壳虫制作成永久玻片后进行鉴定,初步判断为梨绒蚧(Eriococcus tokaedae Kuwana)。将蜡蚧轮枝菌(Lecanicillium lecanii)Bj085-1菌株分生孢子配成(1.4×104)～(1.4×108)孢子/mL的5个处理浓度,对梨绒蚧若虫进行第1次毒力测定。结果显示,各个处理浓度之间的平均累计死亡率大致随着孢子浓度的增加而增加,其中以(1.4×108)孢子/mL浓度处理的最高,但只有45.7%。其后将第1次毒力测定试验中死亡虫体经保湿后出现的菌丝体进行分离纯化,获得了新株系(Lecanicillium lecanii-01Et)进行第2次毒力测定(方法同第1次)。结果表明,不同浓度的L.lecanii-01Et分生孢子对梨绒蚧若虫的杀虫速度随浓度的增加而明显加快,浓度增至(1.4×108)孢子/mL时,杀虫速度最快,LT50仅为3.95 d,平均累计校正死亡率达84.1%。说明分离纯化后的蜡蚧轮枝菌新株系(L.lecanii-01Et)分生孢子对梨绒蚧若虫有较好的防治作用。