葡萄霜霉病菌PCR检测方法的建立与应用

通过对已测序和已报道的葡萄霜霉病菌［Plasmopara viticola (Berk et Curtis) Ber.et de Toni］细胞色素c氧化酶亚型2（cytochrome c oxidase Ⅱ,cox2）的基因序列进行同源性比对分析,设计合成了一对用于P.viticola的检测引物F Pv/R Pv。利用该引物对包括P.viticola在内的30种常见植物病原真菌（包括15种Plasmopara属真菌、8种葡萄常见致病菌）的基因组DNA进行了PCR扩增,验证引物F Pv/R Pv的特异性,结果表明：该引物特异性强,仅P.viticola基因组DNA作为模板的PCR扩增产物呈现一条600 bp左右的特异性条带,其他参照菌株及阴性对照均无任何条带;灵敏度验证结果表明,该检测法可以检测出3.3 pg/μL 水平的P.viticola基因组DNA;应用该方法对来自全国不同葡萄产区的不同品种的78份葡萄霜霉病菌进行了检测,结果表明,该检测法适用范围广,且检测准确率达100%。     

3种检疫性葡萄黄化植原体的快速检测

 葡萄上的植原体病害由于引起叶片黄化而被称为葡萄黄化病。由于这一病害极为严重,葡萄黄化植原体被列为我国的植物检疫对象。其中,葡萄金黄化植原体(16SrV)、维吉尼亚葡萄黄化植原体(16Sr芋) 和澳大利亚葡萄黄化植原体 (16Sr狱) 是引起葡萄黄化病的主要3 个株系,它们导致的病害症状相似,难以区分。本文进行了3 个株系16S rRNA 基因 DNA 序列比对,而后根据同源性相对低的序列设计了43 条特异性引物、103 对引物对组合,对葡萄黄化植原体3 个株系各自的DNA 及混合DNA 进行PCR 扩增,从中筛选出来特异性较强的8 个引物对组合。这些引物对组合,能够同步、特异、快速地检测3 种葡萄黄化植原体。     

猕猴桃果腐病菌PCR和实时荧光PCR检测

为了快速、准确地鉴定猕猴桃果腐病菌(Neofabraea actinidiae),根据GenBank中N. actinidiae的β-tubulin序列设计特异引物NAC-F/R和探针NAC-P,建立了常规PCR和实时荧光PCR检测方法。利用引物NAC-F/R扩增供试的4株N. actinidiae能得到389 bp的预期目标条带,但扩增其他20个非N. actinidiae供试菌株不能得到预期产物,检测灵敏度为140 pg菌丝体DNA;探针NAC-P对供试4株N. actinidiae表现为阳性扩增,而对其他菌株和空白对照均表现为阴性扩增,检测灵敏度可达14 pg菌丝体DNA,比常规PCR高10倍。样品检测试验结果表明两种PCR方法可用于口岸植物检疫中快速、准确地检测猕猴桃果腐病菌。     

斑翅果蝇的PCR-RFLP快速鉴定方法

应用PCR-RFLP技术分析斑翅果蝇及其相关种间的差异。选用果蝇COI基因通用引物并通过PCR扩增斑翅果蝇、亚艳丽果蝇等11种15个样品COI基因序列,对PCR产物进行回收和测序,根据测序结果及NCBI上序列比对结果,选用限制性内切酶ApaⅠ和HinfⅠ分别对果蝇COI基因PCR产物进行酶切,酶切产物经琼脂糖电泳分析。结果表明:同时使用ApaⅠ和HinfⅠ酶,可以将斑翅果蝇与其他种相区分。根据果蝇COI基因建立的PCR-RFLP技术可对斑翅果蝇快速、准确进行鉴定。     

一种快速、有效的香蕉枯萎病病原菌FOC4的分子检测方法

以ITS测序与SCAR分子标记相结合的香蕉病原菌FOC4分子检测方法,利用通用引物ITS1和ITS4对病原菌SF001的rDNA中ITS序列进行PCR扩增,获得560bp左右的特异条带。经Blast分析比对,确定该菌为FOC。再利用FOC4的特异引物PCL/PDL对基因组上的特征序列扩增区域(SCAR)进行PCR扩增,获得677bp的特有序列,鉴定菌株SF001是尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种。经过致病性测试,菌株SF001表现出典型4号生理小种的病理特征。     

基于转录组数据的印度谷螟微卫星位点分析

基于印度谷螟转录组测序数据筛选其功能微卫星(EST-SSR)分子标记,设计该虫的微卫星(SSR)引物并验证其适用性。用MicroSAtellite微卫星搜索软件查找印度谷螟转录组中微卫星的数量、重复次数以及所有微卫星的位置信息,采用Primer Premier 5软件设计SSR引物,并进行PCR验证。结果表明含EST-SSR的序列3 173个,占总搜索序列的8.52%,平均每13kb中就出现1个EST-SSR。共发现192种微卫星类型,其中重复单元为单碱基、二碱基和三碱基的比例较高,依次是28.21%、39.84%、25.43%。除单碱基重复单元外,出现频率最高的是AT/AT,有593次。在66对印度谷螟EST-SSR引物中,有28对PCR扩增成功。这说明基于印度谷螟转录组数据开发微卫星标记是可行的,本研究获得的印度谷螟EST-SSR位点为今后开展该虫的种群遗传学研究提供了基础数据。     

小豆锈病病原菌鉴定

 小豆锈病是小豆的重要病害。然而,小豆锈病病原菌在我国还没有被鉴定。本文对从黑龙江省和内蒙古自治区采集的5个小豆锈病菌样品的分类地位进行了研究。形态学观察表明,小豆锈病菌夏孢子芽孔位于赤道线或赤道线上方,冬孢子平均壁厚为2.0 μm。分子标记检测发现,小豆锈病菌不能被疣顶单胞锈菌特异性引物对UA-ITSF/UA-ITSR扩增,小豆锈病菌和豇豆锈病菌不能被豇豆单胞锈特异性引物对UV-ITSF/UV-ITSR区分。对豇豆单胞锈特异性引物对扩增的4个小豆锈病菌样品PCR产物进行测序,比对分析表明目标序列与小豆单胞锈ITS序列的同源性为99%~100%。基于夏孢子的芽孔位置、冬孢子壁的厚度、疣顶单胞锈菌及豇豆单胞锈特异性引物检测结果和ITS序列分析,小豆锈病菌被鉴定为小豆单胞锈。     

恩施地区烟草病毒病的电镜诊断与RT-PCR鉴定

采集湖北省恩施地区疑似感染烟草病毒病的新鲜烟叶样品,提纯获取混合样品病毒粒子悬浮液,采用悬滴法进行负染,通过电镜观察对病原物进行初步鉴定。结果显示,病毒粒子悬浮液中存在大量线状、杆状与球状形态病毒粒子。进一步提取混合样品总RNA,使用马铃薯Y病毒属通用引物,TMV、CMV外壳蛋白序列特异性引物进行PCR扩增,将扩增产物回收克隆用于测序,经BLAST程序与GenBank进行比对,感病样品中检出TMV、CMV、PVY,与电镜所观察到的病毒粒子形态结构一致。     

糙果苋KASP检测方法的建立

检疫性杂草糙果苋（Amaranthus tuberculatus）与同属其他种的鉴别一直是个难点。本研究建立糙果苋的KASP(Kompetitive allele-specific PCR)检测方法,可用于糙果苋快速、准确的分子鉴定。提取11种23份苋属植物的DNA后,根据长芒苋（Amaranthus palmeri）核基因组序列,设计引物AP4F和AP4R,通过序列扩增和比对,发现糙果苋有特异性SNP (Single nucleotide polymorphism)位点。利用引物设计软件Primer 5设计了用于鉴定糙果苋的KASP反应引物。结果表明,特异引物基于KASP技术扩增后,可以形成明显的基因分型,能将糙果苋与同属近缘种进行区分。该研究为进口粮谷中糙果苋的检测鉴定提供了新技术。     

河南省小麦全蚀病菌的分离及变种类型鉴定

 从河南省10个地市采集的小麦病根样品中分离得到82株病原分离株, 通过形态特征观察、回接致病性测定、以及分子生物学的方法对所分离菌株进行鉴定。其中47个菌株菌丝分支处都形成典型的“∧”状;子囊壳埋生或半埋生, 子囊棍棒状, 子囊孢子线形, 稍弯曲, 无色, 具有5~10个分隔, 大小为68~94 μm×2~4 μm;对82个分离株rDNA-ITS区进行PCR扩增和序列测定, BLAST序列比对结果表明, 47株菌株与小麦全蚀病菌的ITS序列同源性达97%～99%, 据此确定47株菌株为小麦全蚀病菌。应用小麦全蚀病菌4个变种的特异性引物进行PCR扩增都得到禾顶囊壳小麦变种(870 bp)的特异性片段, 鉴定47株菌株均为禾顶囊壳小麦变种 (Gaeumannomyces graminis var.tritici)。     

大豆猝死综合症病原菌北美种的PCR鉴定

 应用等位基因特异性PCR(allele-specific PCR,AS-PCR)技术,建立了大豆猝死综合症(sudden death syndrome of soybean,SDS)病原菌北美种Fusarium virguliforme与其近似种Fusarium phaseoli(菜豆根腐病菌)的鉴别方法。针对翻译延长因子(EF-1α)基因上的3个SNP(单核苷酸多态性)位点,参照引物设计原则和等位基因特异引物(allele-specific primer,ASP)的要求设计了1对引物Fsg-α-1/2,能特异地扩增F.virguliforme,产生327 bp的电泳条带。另外,根据ITS区序列设计了1对通用引物Fu1/2,能扩增F.virguliforme和F.phaseoli,产生452 bp的电泳条带。本实验在传统的AS-PCR基础上进行改进,引入Fu1/2作为阳性质控引物,将ASP的特异性与双重PCR的严谨性相结合,建立了简便可靠的SDS病原菌鉴定方法。     

PCR-RFLP鉴别假高粱和丝克高粱

本文利用PCR特异引物扩增rDNA-18S-26S基因,对PCR产物进行纯化、克隆和测序;分析假高粱与丝克高粱rDNA-18S-26S的酶切图谱,选择合适的限制性内切酶对两者PCR产物进行特异性切割,按照酶切片段的长度来区分两个近似种.被AflIII酶切后,假高粱被切割为674bp、174bp两个片段,而丝克高粱被切割成181bp、174bp、495bp、669bp 4个片段.为建立PCR-RFLP分子鉴定方法有效地区分假高粱与丝克高粱这两个种提供依据.     

鹰嘴豆象与四纹豆象的分子检测技术

结合聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)和酶切方法,对鹰嘴豆象Callosobruchus analis(Fabricius)和四纹豆象Callosobruchus maculatus(Fabricius)的分子检测技术进行了研究。根据两种豆象m tDNACOⅠ基因序列的比对结果设计了2对特异性PCR引物,并筛选到2个特异性内切酶SnaⅠ和MboⅠ,通过PCR反应(最适退火温度为55℃)和PCR产物的酶切反应检测2个近缘种。可靠性检测表明,2对引物针对不同地理种群和个体以及不同DNA浓度的鹰嘴豆象和四纹豆象均能扩增出相应的目的条带。限制性内切酶验证结果表明,PCR技术具有较高的准确性和灵敏度,弥补了形态鉴定的不足。     

根结线虫种群的线粒体DNA分析

 在同工酶和形态学鉴定的基础上,利用引物#C2F3和#1108对42个根结线虫种群线粒体DNA (mtDNA)中的COⅡ和LrRNA间区域进行特异性PCR扩增,35个种群的扩增产物约为1.7kb,其中29个是南方根结线虫,6个是爪哇根结线虫;3个花生根结线虫种群的扩增产物约为1.1kb;1个种群的扩增产物约为0.7kb,为根结线虫属在中国的新记录种;3个北方根结线虫种群的扩增产物约为0.5kb。用单条2龄幼虫提取物作模板得到的结果与大量提取DNA作模板的结果相同。为了区分产生相同大小片段的南方根结线虫和爪哇根结线虫,用限制性内切酶HinfⅠ对扩增产物进行酶切,结果表明:所有供试的南方根结线虫都可以被HinfⅠ酶切,且产生约1.3和0.4kb的2个限制性片段;但供试的爪哇根结线虫种群不能被酶切。由此表明,利用mtDNA PCR及酶切实验可以作为快速而准确地鉴定常见根结线虫的方法。     

葡萄卷叶伴随病毒4和5简并引物和多重PCR检测

研究建立了葡萄卷叶伴随病毒4和5(Grapevine leafroll associated virus 4and 5,GLRaV-4and 5)的简并引物及多重PCR检测方法。比较了单一PCR、多重PCR和简并引物检测方法的灵敏度,并对简并引物的特异性进行了分析。结果表明,采用简并引物和多重PCR对这两种病毒进行检测,其灵敏度与单一PCR相同,且简并引物仅对葡萄卷叶伴随病毒4和5具有特异性。本研究建立的方法能够同时、快速、灵敏地检测上述2种葡萄卷叶病毒,提高了检测效率,降低了检测费用。     

中国疫区内苹果蠹蛾微卫星位点的扩增稳定性及遗传多样性

为揭示欧洲苹果蠹蛾微卫星位点在中国苹果蠹蛾群体遗传学研究中的有效性,以12对微卫星引物对采自中国主要疫区新疆、甘肃、黑龙江的8个苹果蠹蛾地理种群的120头个体在各位点的遗传多样性及扩增稳定性进行研究。所选取的12个微卫星位点中,有8个能够稳定扩增,各位点在大多数种群中均显示偏离哈迪-温伯格平衡,各位点上的平均等位基因数量为3.750～12.500,平均观察杂合度Ho为0.025～0.783,平均期望杂合度He为0.284～0.892。位点Cp2.P和Cp4.56分别具有较低的观察杂合度(0.109、0.025)和较高的近交系数Fis(0.806、0.954),说明这2个位点上的杂合子非常缺乏,其余6个位点均具有较高的杂合度水平和等位基因数量,适用于中国疫区内苹果蠹蛾微卫星分子标记研究。     

进境大丽花种子携带大丽花花叶病毒的分子检测

通过生长性试验、症状观察、PCR扩增及序列测定,从一批进境的大丽花种子上发现大丽花花叶病毒(Dahlia mosaic virus,DMV)。序列比对结果表明,发现的DMV分离物与DMV-D10存在较近的亲缘关系。根据已报道引物P3/P4的测序结果,并将其与已有的DMV序列进行比对,设计1对预期扩增片段为750 bp的检测引物P5/P6。实验结果证实,P5/P6的扩增效率优于已报道的引物P1/P2和P3/P4,适用于DMV的分子检测。     

南方、爪哇和花生根结线虫的快速灵敏的PCR鉴定方法

 为了研制南方、爪哇和花生根结线虫快速灵敏的检测和鉴定方法,分别分离了4个南方根结线虫和3个爪哇根结线虫特异性的随机扩增多态性DNA (RAPD)片段。在这些RAPD标记DNA序列的基础上,设计了多对SCAR PCR引物,并用源于国内外的南方、爪哇、花生、北方和象耳豆根结线虫群体验证其扩增特异性和灵敏度。最终确定了3对高效扩增的SCAR引物,它们组合使用可以可靠灵敏地鉴定南方、爪哇和花生根结线虫。3对引物的扩增灵敏度达1/3条的二龄幼虫、雄虫或雌虫,这表明本研究研制的PCR鉴定法可用于生产实践中土样和根样中3种根结线虫快速灵敏的鉴定。     

车前草穗枯病菌分子鉴定

采用真核生物通用引物ITS1/ITS4,对来自江西省吉安县2个车前草穗枯病菌菌株进行rDNA-ITS区段的PCR扩增,对扩增产物进行测序,结果获得2个长度均为579 nt且序列完全一致的rDNA-ITS序列,该序列与GenBank中当归间座壳菌(Diaporthe angelicae)及其无性态拟茎点霉菌(Phomopsis subordinaria)对应序列的同源性高达99.0%,根据以rDNA-ITS序列同源性大小划分种类的标准,将车前草穗枯病菌鉴定为当归间座壳菌。     

应用聚合酶链式反应鉴定新疆棉花落叶型黄萎病菌

用一对棉花落叶型黄萎病菌的特异性引物D1和D2进行PCR扩增,对于落叶型黄萎病菌,该对引物可特异性地扩增产生一段550bp的产物,而非落叶型黄萎病菌则不能被扩增.供试的35个新疆黄萎菌系中,有3个菌系扩增出550bp大小的落叶型黄萎病菌特异性片段,表明目前新疆已存在落叶型黄萎病菌,用此技术可快速、准确地检疫和鉴定落叶型黄萎病菌.