侵染百合的黄瓜花叶病毒亚组Ⅱ分离物cp基因克隆和序列分析

 从云南大理的东方型百合上得到黄瓜花叶病毒分离物(CMV-DL), ELISA检测初步确定为CMV亚组Ⅱ分离物, 设计并合成CMV亚组Ⅱ的特异引物, RT-PCR扩增得到1条约800 nt的特异片段, 经克隆及序列测定, 该片段长828 nt, 包含的外壳蛋白(CP)基因由657 nt组成。将该分离物的cp基因与其它14个CMV分离物进行同源性比较, 在核苷酸水平上与CMV亚组I和亚组Ⅱ的同源性分别为76.8%~78.1%和98.6%~99.2%;在氨基酸水平上与CMV亚组I和亚组Ⅱ的同源性分别为82.0%~84.3%和95.9%~100.0%。结果表明CMV-DL为CMV亚组Ⅱ成员。     

白术矮化病毒病病原的分子鉴定和部分序列分析

 本试验在生物学接种的基础上,利用非序列依赖性PCR扩增(sequence-independent amplification,SIA)对白术矮化病毒病病原进行了分子鉴定,序列测定及分析。结果发现,具有矮化症状的白术为黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)所侵染。为明确CMV白术分离物(CMV-Am)的分类地位,本研究进一步克隆了CMV-Am的外壳蛋白基因(CP)和移动蛋白基因(MP)全序列。序列比对分析表明,CMV-Am与CMV亚组ⅠB中株系XJ2序列同源性最高,核苷酸、氨基酸序列同源性分别为98.9%、99.1%。氨基酸序列同源性聚类分析表明,CMV-Am与中国大多数CMV分离物一样,属于CMV亚组ⅠB。     

蚕豆萎蔫病毒2号安徽分离物全基因组序列测定与分析

利用酶联免疫和RT-PCR技术对采自安徽地区的蚕豆病株进行检测,确定其病原为蚕豆萎蔫病毒2号Broad bean wilt virus 2(BBWV2)。为明确BBWV2安徽分离物(BBWV2-AH)的分类地位,克隆了该分离物的全基因组序列,分析了其基因组特征。结果表明,BBWV2-AH RNA1全长为5 944 bp(GenBank登录号:KY606992),含有1个ORF;BBWV2-AH RNA2全长3 587bp(GenBank登录号:KY606993),含有1个ORF。全序列核苷酸和氨基酸相似性分析显示,BBWV2-AH RNA1与BBWV2其他分离物的核苷酸、氨基酸相似性分别为78.4%~96%和87.1%~99%;BBWV2-AH RNA2与BBWV2其他分离物的核苷酸、氨基酸相似性分别为76.8%~95.5%和88.2%~98.3%。全基因组核苷酸序列系统发育分析显示,BBWV2-AH RNA1与中国的BBWV2-Hunan RNA1的亲缘关系最近,而BBWV2-AH RNA2与韩国的多个分离物聚集在一起,再与中国的分离物BBWV2-B935形成一个分支。     

南瓜蚜传黄化病毒湖北和云南分离物的部分序列分析

 本研究从带有黄化症状的南瓜叶片中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增得到来自湖北和云南的南瓜蚜传黄化病毒(CABYV)2个分离物的1375nt特异性核苷酸片段。分别将PCR产物插入到克隆载体pMD19-T并转化大肠杆菌DH5α,对筛选到的阳性克隆进行了序列测定和分析(GenBank登录号为EF488996和EF488997)。所获片段含有部分复制酶基因576nt,非编码区199nt和完整的CP基因600nt,编码一个由199个氨基酸组成的分子量约为22kDa的结构蛋白。湖北和云南分离物与法国分离物、意大利分离物、西班牙分离物、北京分离物和上海分离物的CP基因核苷酸序列和推测氨基酸序列的同源性分别为93.1%~98.5%和91.4%~98.5%。     

油菜花叶病毒山西地黄分离物的全基因组序列测定与分析

 采用双链RNA(double-stranded RNA, dsRNA)技术和非序列依赖PCR扩增(sequence-independent amplification,SIA)方法对感病地黄进行分子鉴定,并测定油菜花叶病毒(Youcai mosaic virus,YoMV)山西地黄分离物(YoMV-SX)的基因组全序列。序列测定及分析发现侵染地黄的病毒为油菜花叶病毒(Youcai mosaic virus,YoMV)。获得YoMV-SX(GenBank登录号JX422022)全长为6 304 nt,5′UTR长度为68 nt,3′UTR长度为236 nt,含有4个开放阅读框(open reading frame,ORF)。全序列核苷酸一致性分析显示YoMV-SX与Tobamovirus亚组Ⅲ中分离物的一致性为90.7%～96.0%,与同属亚组Ⅰ和Ⅱ的一致性仅为50.2%～63.3%。全序列系统进化分析表明,YoMV-SX与YoMV-Wh形成一个独立分支,亲缘关系最近。这是YoMV侵染地黄的首次报道。     

侵染芹菜的甜椒内源RNA病毒鉴定及序列分析

本试验利用双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)提取技术和非序列依赖PCR扩增(sequence-independent amplification,SIA)方法对表现皱缩症状的芹菜进行分子鉴定,发现芹菜被甜椒内源RNA病毒Bell pepper alphaendornavirus(BPEV)所侵染。为进一步明确山西芹菜BPEV分离物(BPEV-QC,GenBank登录号为KY659226)的分类地位,根据SIA测序结果设计BPEV特异性引物进行RT-PCR检测,并进行序列相似性比较和系统进化分析。序列同源性分析表明:BPEV-QC与BPEV分离物(IS、Maor、Kyosuzu、BPEV、lj、BPEV-YW)的同源性为80.0%~97.8%,与其他内源RNA病毒科分离物的同源性仅为30.6%~37.6%,表明:BPEV-QC与BPEV分离物(IS、Maor、Kyosuzu、BPEV、lj)形成一个独立分支,亲缘关系最近。     

葡萄卷叶伴随病毒2号和3号辽宁分离物部分基因组的序列分析

 将采自辽宁兴城地区在生长期间具典型卷叶病症状的金星无核(Venus Seedless)葡萄品种休眠枝条,用RT-PCR检测4种葡萄卷叶伴随病毒(Grapevine leafroll-associated viruses,GLRaVs),扩增得到了葡萄卷叶伴随病毒2号(GLRaV-2)和葡萄卷叶伴随病毒3号(GLRaV-3)两种病毒的主要外壳蛋白(major coat protein,CP)基因的完整序列(GenBank登录号分别为FJ786017和FJ786016)。这表明该葡萄植株受到了GLRaV-2和GLRaV-3辽宁分离物(GLRaV-2-LN和GLRaV-3-LN)的复合侵染。根据检测结果,克隆了GLRaV-2-LN基因组3'端CPm (minor capsid protein)、p19(19-kDa protein)和p24(24-kDa protein)基因(GenBank登录号分别为FJ786018、FJ786019和FJ786018)。序列分析表明,GLRaV-3-LN的CP基因全长942 nt,与已报道的国内外其它分离物CP基因全序列相比,核苷酸序列同源性为89.8%~91.8%,由此推导的氨基酸序列同源性为94.9%~97.4%。GLRaV-2-LN的CP、CPm、p19和p24基因全长分别为597 nt、672 nt、486 nt和618 nt。与国外报道的几个分离物的相应蛋白基因全序列相比,核苷酸序列同源性分别为88.3%~100.0%、78.7%~99.9%、75.1%~99.4%和87.5%~99.5%;由此推导的氨基酸序列同源性分别为92.9%~100.0%、89.2%~100.0%、73.9%~99.4%和89.3%~99.0%。     

西瓜花叶病毒2号新疆昌吉分离物外壳蛋白基因核苷酸序列分析

 利用RT-PCR从新疆昌吉地区表现花叶、疱斑、扭曲等症状的南瓜病株上检测到西瓜花叶病毒2号新疆昌吉分离物(简称WMV-2-XJ-CJ),并测定了该分离物外壳蛋白(CP)基因序列。序列分析表明,新疆昌吉分离物CP基因全长850个核苷酸,编码197个氨基酸。与国内外报道的12个WMV-2CP基因相比,其核苷酸序列同源性为92.6%~98.3%,由此推导的氨基酸序列同源性为94.7%~99.3%。新疆昌吉分离物在CP N'端可变区明显不同于国内外报道的核苷酸序列。WMV-2新疆昌吉分离物与日本和郑州分离物较其它国家和地区的分离物多出6个核苷酸,但其核苷酸及其推导的氨基酸序列差异较大。新疆昌吉分离物外壳蛋白有2个氨基酸残基明显不同于其它分离物,其中蚜传株系的特征结构域DAG突变为DAE。     

白草花叶病毒承德玉米分离物3′-cDNA 片段序列分析

 采自河北承德11 个表现矮花叶症状的玉米样品,用甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus, SCMV)和白草花叶病毒
(Pennisetum mosaic virus, PenMV)简并引物扩增了基因组3′ 端约2. 1 kb 的片段并进行测序。Blast 结果表明其中8 个样
品含有PenMV。扩增到的PenMV 序列均为2 135 nt,包括部分NIb 基因(985 nt)、完整的CP 基因(909 nt)和3′-UTR(241
nt)。这8 个分离物CP 基因和3′-UTR 与GenBank 上其他PenMV 分离物相应序列的核苷酸一致率分别为89. 8% ~ 93． 4%
和95. 9% ~ 97. 9% 。根据扩增的2 135 nt 序列和CP 基因序列构建系统发育树,8 个分离物与GenBank 上其他PenMV 分离
物都分为2 个组:山西组和承德组。重组分析表明CD9 的CP 基因存在重组。     

甘薯潜隐病毒外壳蛋白基因的克隆、表达及其抗血清的制备

 根据已报道的甘薯潜隐病毒(Sweet potato latent virus,SPLV)外壳蛋白(CP)基因的核苷酸序列合成引物,利用RT-PCR方法克隆了SPLV河南分离物(SPLV-HN)的CP基因及部分3'端非编码区序列,序列分析表明,SPLV-HN CP基因由879个核苷酸组成(GenBank登录号为DQ399862),编码293个氨基酸残基。与GenBank中SPLV-CH(X84011)和SPLV-T(X84012)分离物的核苷酸序列相似性分别为96.8%和93.0%;与日本分离物(E15420)的核苷酸序列相似性为83.6%。将CP基因克隆到原核表达载体pET-30a(+)上,SDS-PAGE分析表明,经IPTG诱导,CP基因在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中得到了高效表达。以表达的蛋白为抗原,免疫家兔,制备了SPLV外壳蛋白的特异性抗血清。ACP-ELISA检测结果表明,制备的抗血清可用于田间甘薯样品的检测。     

我国不同CMV分离物2b基因片段的RT-PCR扩增及其序列比较

 本研究根据黄瓜花叶病毒2b基因的保守序列设计引物,利用一步RT-PCR技术对多个不同寄主和不同地理来源的黄瓜花叶病毒分离物的2b基因片段进行扩增,获得了含该基因全长约90%的cDNA片段(300bp)。序列测定与比较分析结果表明,国内不同CMV分离物2b基因片段核酸序列同源性达93%以上,推测的氨基酸序列同源性超过90%,且均属于亚组Ⅰ。     

黄瓜花叶病毒浙江白术分离物全基因组序列测定与分析

正白术(Atractylodes macrocephala Koidz.)为菊科(Compositae)苍术属(Atractylodes)多年生草本植物,其根茎入药具补脾健胃、燥湿利水、止汗安胎等功效,在我国广泛栽培,并以于术(浙江临安于潜)品质最佳[1]。近年来白术生产由于品种单一,长期连作等因素导致病毒病害日趋严重。据报道,黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)~([2])、蚕豆萎蔫病毒2号(Broad bean wilt virus 2,     

百合斑驳病毒云南分离物 全基因组序列分析及CP结构预测

 对云南嵩明百合上发生的百合斑驳病毒(Lily mottle virus, LMoV)进行全基因组序列测定及分析,并对LMoV嵩明分离物(LMoV-SMi1、LMoV-SMi2)和玉溪分离物(LMoV-YXi1、LMoV-YXi2)外壳蛋白(coat protein,CP)基因进行序列比较,发现云南的LMoV分为2个类群,玉溪分离物属于种群I,嵩明分离物属于种群II。2个类群间的核苷酸和氨基酸同源性分别为86.7%~89.5%、90.1%~92.7%,玉溪分离物和嵩明分离物相比,cp基因发生了3个核苷酸的缺失。对国内外LMoV所有分离物的cp基因氨基酸序列进行系统进化分析,结果表明所有LMoV分离物可划分为2个种群,种群I分离物较种群II分离物几乎均存在1个苏氨酸缺失的差异。此外,对LMoV-SMi2的CP相关特性和空间结构进行了初步预测,认为该蛋白为球状,具有较强的表面可能性,不存在跨膜区域,大多数区域能够形成主要的抗原决定簇,主要集中在aa12-22、aa31-42、aa83-99、aa179-191、aa215-223、aa249-259区段,可作为制备抗血清选择抗原的参考。LMoV-SMi2和LMoV-YXi1在二级结构和三级结构上存在一定的差异,但总体空间结构差异不大。     

黄瓜花叶病毒分离物核酸酶保护试验(RPA)方法的株系分化研究

 采用黄瓜花叶病毒((CMV)亚组Ⅰ株系Fny-CMV及亚组Ⅱ株系Ls-CMV的RNA₂的特定序列片段的cDNA克隆,体外转录,同时掺入³²P标记制备负链RNA探针,再与纯化的甜椒上的CMV中国分离物的RNA进行杂交,检测其与探针之间的同源性。共检测样品分离物3份。试验结果表明:河南新乡和北京密云的CMV甜椒分离物与Fny-CMV的核苷酸有高度同源性,隶属于Fny-CMV为代表的亚组Ⅰ株系。来自福建的样品与亚组Ⅱ的Ls-CMV株系有高度同源性,隶属于CMV亚组Ⅱ株系。本试验同时利用源于我国CMV亚组Ⅰ的K株系的RNA₂两个EcoR Ⅰ位点间1657-2125 nt的核苷酸序列为探针,同样与以上3份CMV中国分离物进行RNA杂交,进一步比较分析了这几个分离物与我国亚组Ⅰ的K-CMV株系的关系,证明了我国CMV存在亚组与株系分化。     

侵染云南鸡蛋果的病毒种类鉴定及CMV cp 基因序列分析

Viral diseased Passiflora edulis samples showing mosaic, shrinking, chlorosis, and malformation were collected from Yuxi, Wenshan, Dehong, and Xishuangbanna in Yunnan Province. Forty diseased samples were detected by RT-PCR/PCR using degenerate primers of members in genera of Umbravirus, Tobamovirus, Luteovirus, Orthotospovirus, Begomovirus, Badnavirus, Potyvirus and specific primers of cucumber mosaic virus (CMV). Results showed that CMV, telosma mosaic virus (TeMV) and papaya leaf curl Guangdong virus (PaLCuGdV) were detected in the diseased P. edulis samples. CMV showed the highest detection rate of 27.5 %, while TeMV and PaLCuGdV had the rates of 20.0% and 7.5% respectively among the P. edulis samples. Mixed infections of PaLCuGdV+CMV, PaLCuGdV+TeMV and CMV+TeMV were also found in these samples. The 657 nucleotide (nt) CMV full-length coat protein (CP) gene was cloned and sequenced from two diseased samples in Yuxi (YYXi-JDG, Acc. No. MW495062) and Xishuangbanna (YXSBN-JDG, Acc. No. MW495063), respectively. These two CMV isolates shared 97.3% identity of nt sequence with each other, while had 76.9%-97.7% and 77.0%-98.2% nt identity with other CMV isolates, respectively. Phylogenetic tree showed that the two CMV isolates from P. edulis belonged to CMV subgroup Ⅰ, and no obvious geographic differentiation and host specificity relationship was found among the selected 33 CMV isolates worldwide.     

茄科蔬菜立枯丝核菌的融合群鉴定

 Sixty-five samples were collected from rhizosphere soil, hot pepper and tomato plants showing damping-off, root rot and stem rot in Taian, Shouguang of Shandong province and Zhouzhi, Taibai of Shaanxi province. Thirty-nine Rhizoctonia solani isolates were obtained from these samples. The results of anastomosis group (AG) identification and sequence analysis of 5.8S rDNA-ITS of the isolates showed that thirty-six isolates (92.3%) belonged to AG-4, while only three (7.7%) belonged to AG-5. The isolates of AG4 could further be divided into two subgroups of AG4-HG-Ⅰ and AG4-HG-Ⅲ. The 5.8S rDNA-ITS sequences of the selected isolates of the two subgroups had the 99%-100% identity with standard isolates of AG4-HG-Ⅰ and AG4-HG-Ⅲ (from GenBank). Among the analyzed isolates, AG4-HG-Ⅰ subgroup was the dominant with the frequency of 79.5%. Subgroup AG-4-HG-Ⅲ with the frequency of 12.8% was the second. This is the first report that subgroup AG4-HG-Ⅲ of R. solani isolated from Solanaceae vegetable crops in China.