哈密瓜细菌性果斑病病原菌鉴定

 2000年在内蒙古和新疆的哈密瓜上发现一种新细菌病害-哈密瓜细菌性果斑病,从病叶和病果上分离到33个细菌菌株,接种哈密瓜、西瓜和甜瓜后,发病症状与自然发病症状完全一致,而且从接种病株上又重新分离到了此病原细菌,这33个细菌菌株经柯赫法则证明均为该病的致病菌。各菌株致病力无明显差异。经革兰氏染色反应、菌体形态、培养性状、生理生化反应、细胞化学成分分析(糖、蛋白质、氨基酸、脂肪酸、mol% G+C)、DNA-DNA杂交,确认该病原菌为燕麦食酸菌西瓜亚种(Acidovorax avenae subsp.citrulli Willems et al.1992)=类产碱假单胞菌西瓜亚种(Pseudomonas pseudoalcaligenes subsp.citrulli Schaad et al.1978)。该病菌除侵染哈密瓜外,人工接种尚能侵染多种葫芦科及番茄、茄子等作物。     

瓜类细菌性果斑病研究进展

瓜类细菌性果斑病是发生在甜瓜、西瓜等葫芦科植物上的一种严重的世界性病害,此病是典型的种传细菌性病害,病原为嗜酸菌属西瓜种(Acidovorax citrulli)。本文围绕瓜类细菌性果斑病菌的分离检测、致病机理、遗传多样性及防治等方面的研究进展作一概述,阐明了瓜类细菌性果斑病的研究现状。     

Bio-PCR方法检测葫芦科作物种子携带 西瓜嗜酸菌的特异性引物筛选

 由西瓜嗜酸菌(Acidovorax citrulli)引起的细菌性果斑病是一种毁灭性的种传病害,可为害多种葫芦科作物并造成重大经济损失。该病原菌为检疫性有害生物,种子带菌是田间病害发生的最重要初侵染来源,因此,种子健康检测成为病害综合防控过程中的重要环节。Bio-PCR是当前种子携带细菌检测的常用方法,而特异性引物的选择和使用是检测的关键。本研究使用已报道的7对引物对17株西瓜嗜酸菌、10株嗜酸菌属其它种的菌株和6株其它属的植物病原细菌进行了Bio-PCR检测,筛选出对西瓜嗜酸菌特异性最好的引物为SEQID4^m/SEQID5。研究表明:使用该引物对西瓜嗜酸菌MH21纯菌菌悬液的检测限度为10² CFU·mL^-1;在人工添加菌悬液的模拟带菌西瓜种子中,使用ASCM和EBBA两种半选择性培养基结合引物SEQID4^m/SEQID5进行Bio-PCR检测,ASCM对种子中带菌量的检测限度可达到0.01 CFU·g^-1,EBBA对种子中带菌量的检测限度为0.1 CFU·g^-1。     

西瓜噬酸菌不同菌株与甜瓜幼苗早期互作的转录组学分析

西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli)引起的瓜类细菌性果斑病(bacterial fruit blotch,BFB)是西瓜、甜瓜等葫芦科作物上毁灭性种传病害。本文利用RNA-seq技术,分析了2个西瓜噬酸菌菌株(pslb65和AAC00-1)分别诱导甜瓜感病品种IVF667幼苗6 h和12 h后的基因表达谱。结果表明,这2个菌株侵染寄主6 h后,分别检测到1 029和3 561个差异表达基因,其中上调基因分别为355和1 621个,下调基因分别为674和1 940个;与寄主互作12 h后,差异基因分别有2 397和1 875个,上调基因分别为903和898个,下调基因分别为1 494和977个。GO功能注释发现,pslb65与甜瓜幼苗互作的差异基因显著富集在生物学过程中的发育和代谢2个亚类,所占比例分别为32.92%和35.36%。在分子功能中转录因子所占比例较大,达到67.65%;AAC00-1与甜瓜幼苗互作后,差异基因显著富集在生物学过程中的转运和定位中,比例分别为23.84%和24.18%。在分子功能中氧化还原酶活性亚类所占比例高达17.59%。西瓜噬酸菌pslb65和AAC00-1侵染寄主6 h,Rboh、CaMCML、CDPK和FLS2等编码基因在植物-病原互作途径(csv04626)多为下调表达,植物-病原互作途径被抑制;12 h,pslb65-甜瓜互作途径相关基因多下调,AAC00-1-甜瓜互作途径相关基因多上调,推测此时植物-病原互作途径被AAC00-1激活,引起寄主的防御反应。西瓜噬酸菌pslb65和AAC00-1均可诱导植物发病,但在引起植物感病途径上略有不同,这可能与它们来自西瓜噬酸菌的不同亚群有关。最后,选取pslb65与寄主互作途径的6个基因进行qRT-PCR验证,结果与转录组测序结果基本一致。本研究初步揭示了西瓜噬酸菌2个不同菌株与寄主互作在转录水平上的表达差异,为研究甜瓜与不同菌株的互作机制差异奠定了基础。     

西瓜噬酸菌铜代谢相关基因copZ功能分析

 瓜类细菌性果斑病(Bacterial fruit blotch,BFB)病原菌为西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli,Ac),主要为害西瓜、甜瓜等葫芦科作物,是瓜类生产上主要细菌性病害。目前生产上对该病害的防治手段主要以化学防治为主,其中铜制剂的防治效果较为显著。本研究以西瓜噬酸菌野生型菌株Aac-5中铜代谢相关基因copZ为对象,探究copZ基因缺失对西瓜噬酸菌抗铜性、生长能力等表型的影响;采用RT-qPCR技术测定在不添加和添加外源铜离子条件下,基因copZ缺失后对其他铜代谢相关基因表达量的影响。成功构建了西瓜噬酸菌copZ基因缺失突变菌株ΔcopZ和互补菌株ΔcopZ-comp。结果表明,野生型菌株Aac-5与ΔcopZ-comp菌株在添加1.25 mmol·L^-1 CuSO₄的生长能力与不添加CuSO₄相似,而ΔcopZ菌株的生长能力减弱;当添加CuSO₄至2.50 mmol·L^-1时,野生型菌株Aac-5、ΔcopZ菌株和ΔcopZ-comp菌株的生长能力均减弱。基因copZ缺失在不含铜和含铜条件下均能使西瓜噬酸菌生物膜形成能力减弱;在不含铜条件下基因copZ不影响西瓜噬酸菌的运动能力,在含有1.25 mmol·L^-1 CuSO₄的运动性培养基中各菌株运动能力丧失。ΔcopZ菌株在西瓜子叶内的生长能力相较于野生型菌株Aac-5显著增强,但在西瓜幼苗上的致病力差异不显著,仍具有引起烟草过敏性反应的能力。在不同铜浓度处理后,铜代谢相关基因cueR、copA表达量在野生型菌株中的变化趋势与ΔcopZ菌株存在差异;基因cusA、hylD在野生型菌株中表达量变化趋势与ΔcopZ菌株一致。这表明基因copZ在西瓜噬酸菌铜代谢过程中具有重要作用。     

西瓜嗜酸菌趋化性的初步研究

瓜类细菌性果斑病是世界范围的检疫性细菌病害,病原菌为西瓜嗜酸菌,带菌种子为主要侵染源。病原细菌在寄主表面的定殖能力与其致病能力关系密切,而趋化性是决定定殖能力的关键因素之一,研究不同物质对西瓜嗜酸菌趋化性的影响对防治瓜类细菌性果斑病具有重要意义。本文采用毛细管法,研究了碳源、氨基酸、有机酸及其他物质对西瓜嗜酸菌趋化性的影响。结果表明,所测碳源中,麦芽糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖和半乳糖均显著促进西瓜嗜酸菌的趋化性;所测氨基酸中,L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-组氨酸、L-谷氨酸、L-亮氨酸、L-缬氨酸、L-谷氨酰胺和L-丙氨酸显著促进西瓜嗜酸菌的趋化性;所测有机酸中,琥珀酸、半乳糖醛酸和酒石酸显著促进西瓜嗜酸菌的趋化性;氯化钠、硫酸镁等对西瓜嗜酸菌的趋化性无显著影响。     

进境西瓜种子中西瓜细菌性果斑病菌的检测鉴定

由嗜酸菌属西瓜种(Acidovorax citrulli)引起的西瓜细菌性果斑病是西瓜等葫芦科作物上的一种极具毁灭性的病害,该病原细菌可以由种子携带传播。本研究通过直接研磨种子,用双抗体夹心酶联免疫吸附测定法(DAS-ELISA)和免疫捕捉聚合酶链式反应法(IC-PCR)对进境的西瓜种子进行检测,并且对PCR产物进一步克隆测序。结果表明,在DAS-ELISA产生阳性结果的样品中,IC-PCR结果也产生阳性。序列分析表明,该序列与已知的该病菌16S rRNA基因的相应序列具有100%同源性。因此,2006年这批来自台湾的西瓜种子携带有嗜酸菌属西瓜种(Acidovorax citrulli)。     

甜瓜细菌性果斑病生防菌株BW-6的筛选和鉴定

甜瓜细菌性果斑病是由西瓜嗜酸菌（Acidovorax citrulliSchaad et al.）引起的一种毁灭性病害。本研究以西瓜嗜酸菌为指示菌,采集97个土样,采用土壤稀释平板法和对峙培养进行拮抗菌的分离和筛选,获得19株细菌可以抑制西瓜嗜酸菌生长。通过离体叶片、盆栽试验进行生测,BW-6菌株对甜瓜果斑病的生防效果最好,且比较稳定,防效达80.3%。在甜瓜叶面进行室外定殖试验表明,BW-6菌株可以在甜瓜叶面上大量定殖,但随着时间的推移菌数逐渐减少。根据菌株BW-6的形态特征、生理生化特性以及16S rDNA序列分析综合考察,鉴定其为枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis Cohn)。     

西瓜嗜酸菌LuxR家族基因luxR_(4229)的功能研究

瓜类细菌性果斑病是葫芦科作物上的一种严重的世界性病害,其病原菌为西瓜嗜酸菌(Acidovorax citrulli)。本研究以野生型菌株Ac-5为研究对象,通过同源重组双交换的方法,构建了LuxR家族功能基因luxR_(4229)的全基因缺失突变株,并对突变株进行致病性、生物膜形成能力和运动能力等生物学特性测定。同时,qRT-PCR定量检测了鞭毛基因fliR和fliC以及III型分泌系统功能基因hrpE和hrcN的表达水平。结果显示:与野生型相比,突变株致病力明显降低,运动能力减弱,而生物膜形成能力增强。fliR、fliC、hrpE和hrcN基因在突变株中的表达量下调,luxR4229对fliR、fliC、hrpE和hrcN基因均为正调控。基因luxR_(4229)在对西瓜嗜酸菌致病力、运动能力及生物膜的形成具有重要调控作用。     

基于多重PCR技术的西瓜噬酸菌分组检测方法及其应用

瓜类细菌性果斑病是瓜类作物上重要的种传细菌性病害,其病原菌西瓜噬酸菌Acidovorax citrulli为我国进境植物检疫性有害生物,种子种苗带菌是病害长距离传播的重要来源,种子种苗的快速检测对病害综合防控具有重要的意义。根据寄主的差异西瓜噬酸菌分为两个组,Ⅱ组菌株比Ⅰ组菌株具有更高的铜制剂敏感性,因此,西瓜噬酸菌的分组检测可为病害田间防治中铜制剂的精准使用提供科学依据,避免化学农药的过量施用。本研究筛选了现有的西瓜噬酸菌种间特异性引物和种内分组特异引物,建立并优化了一个多重PCR体系,实现了通过一步试验,就能够准确将西瓜噬酸菌与近缘种和其他植物病原细菌区分开来,并直接鉴定到西瓜噬酸菌不同组。该多重体系可以从带菌种子浸泡液和感病植物组织研磨液中直接检测到西瓜噬酸菌的不同组,且稳定性好,具有应用于生产实践的潜力。     

LuxR家族调控因子 LuxR-2460 对西瓜嗜酸菌致病力及生物膜形成的调控

 LuxR家族的调控因子在革兰氏阴性细菌中起重要作用。对西瓜嗜酸菌一个LuxR家族的调控因子 LuxR-2460的调控作用进行研究。生物信息学分析表明该调控因子有2个保守结构域:N-末端为REC 结构域,C-末端为HTH 结构域。通过同源重组双交换的方法,构建了luxR-2460全基因缺失的突变株,该基因缺失突变株能够引起菌株致病力、运动能力及蹭行运动能力的下降及生物膜形成能力的增强。qRT-PCR 检测结果表明,该基因缺失导致鞭毛基因fliR在突变株中的表达量下调,影响病菌鞭毛的形成。说明luxR-2460基因对西瓜嗜酸菌的致病能力及相关因子具有重要调控作用,可以作为该病害防控的潜在靶标。     

西瓜噬酸菌中C-di-GMP代谢相关基因Aave_2620的功能研究

 环鸟苷二磷酸(cyclic diguanylate,c-di-GMP)是一种广泛存在于植物病原细菌中的第二信使,调控细菌多种生物学功能,从而影响病原细菌的致病性,但其在西瓜噬酸菌中的研究还未见报道。本实验以Aac5菌株为研究对象,通过构建c-di-GMP代谢相关基因Aave_2620缺失突变株和互补菌株,从其致病能力及其生长能力两部分进行测定,探究此信号途径是否在西瓜噬酸菌中调控致病机制。结果表明,基因Aave_2620的缺失显著降低Aac5菌株致病力、生物膜形成能力和生长能力,减弱烟草过敏性反应以及运动能力,互补菌株表型基本得到恢复。基因Aave_2620的缺失显著影响三型分泌系统相关基因、毒性相关基因以及鞭毛及趋化性相关基因在西瓜噬酸菌中的表达量。以上结果表明c-di-GMP代谢相关基因Aave_2620与西瓜噬酸菌的致病密切相关。     

西瓜噬酸菌ftsH基因功能分析

 AAA ATPase (ATPase associated with diverse cellular activities) 在西瓜噬酸菌的多种生命过程中发挥重要作用。AAA家族中的FtsH蛋白(filamentation temperature-sensitive H)是由ftsH基因编码的,参与生长、致病、环境应激反应、膜内在蛋白质量控制等过程的蛋白,但其在西瓜噬酸菌中的作用尚未明确。本实验以西瓜噬酸菌Aac5菌株为研究对象,通过构建基因缺失突变体,测定致病力等各项表型以及突变株中致病相关基因和其他AAA ATPase基因的表达量,初步探索西瓜噬酸菌中ftsH的功能,为FtsH蛋白的功能研究奠定基础。结果表明,ftsH缺失显著降低菌株致病力、运动能力、生物膜形成能力、生长能力和环境胁迫耐受能力,不影响烟草过敏性反应,显著影响西瓜噬酸菌致病相关基因、AAA ATPase基因以及热激转录因子σ³²的表达量。这表明ftsH基因的功能与西瓜噬酸菌的致病性和环境耐受性密切相关。     

西瓜噬酸菌Aac-5AAA ATPases基因moxR和ruvB功能研究

AAA ATPases(ATPase associated with diverse cellular activities)是一种与细胞活性相关的酶,广泛存在于所有生物中,同时具有蛋白酶和分子伴侣活性。为了研究AAA ATPases相关基因缺失对西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli)的影响,本研究通过同源重组双交换的方法构建西瓜噬酸菌moxR基因以及ruv B基因全缺失突变菌株及互补菌株,测定了突变菌株的致病性、烟草过敏反应、运动性、生长能力、生物膜形成等;并利用实时荧光定量PCR方法测定了AAA ATPases与Ⅲ型分泌系统相关基因(hrc N和hrp E)、毒性蛋白相关基因(trb C和vir B)、鞭毛相关基因(fliR和fli M)、菌毛相关基因(pin C-1和pin C-2)以及AAA ATPases亚家族Ruv B相关基因(ruv A和ruv C)的关系。结果表明,moxR基因以及ruv B基因全缺失突变菌株的致病力降低、运动性减弱、生长能力下降、生物膜形成能力增强、烟草过敏性反应减弱、突变菌株中重要的致病基因hrc N和hrp E表达量显著下调,表明AAA ATPases相关基因moxR、ruv B在西瓜噬酸菌的致病力上发挥重要作用。     

西瓜噬酸菌ftsH基因功能分析

 AAA ATPase (ATPase associated with diverse cellular activities) 在西瓜噬酸菌的多种生命过程中发挥重要作用。AAA家族中的FtsH蛋白(filamentation temperature-sensitive H)是由ftsH基因编码的,参与生长、致病、环境应激反应、膜内在蛋白质量控制等过程的蛋白,但其在西瓜噬酸菌中的作用尚未明确。本实验以西瓜噬酸菌Aac5菌株为研究对象,通过构建基因缺失突变体,测定致病力等各项表型以及突变株中致病相关基因和其他AAA ATPase基因的表达量,初步探索西瓜噬酸菌中ftsH的功能,为FtsH蛋白的功能研究奠定基础。结果表明,ftsH缺失显著降低菌株致病力、运动能力、生物膜形成能力、生长能力和环境胁迫耐受能力,不影响烟草过敏性反应,显著影响西瓜噬酸菌致病相关基因、AAA ATPase基因以及热激转录因子σ³²的表达量。这表明ftsH基因的功能与西瓜噬酸菌的致病性和环境耐受性密切相关。     

西瓜噬酸菌MarR家族转录因子Aave_3922的功能研究

 MarR(Multiple antibiotic resistance regulator)家族转录因子是一种广泛存在于细菌及古细菌中的转录抑制子。MarR可通过调控毒力因子的表达来影响病原细菌的致病性,其调控机制独特,在不同菌中存在不同的调控网络。为明确其在西瓜噬酸菌中的功能及信号通路,以西瓜噬酸菌Aac5菌株为研究对象,构建MarR转录因子Aave_3922的缺失突变株及互补菌株,通过对表型及转录水平的测定,初步探究西瓜噬酸菌中MarR转录因子的功能及可能的调控网络。结果显示,与野生型Aac5菌株相比,突变菌株致病能力、生物膜形成能力、体内生长能力均显著下降,互补菌株有所恢复。同时,基因Aave_3922的缺失会显著影响三型分泌系统关键基因hrpX及hrcJ、毒性相关基因trbC、鞭毛及趋化性相关基因fliC及cheA、生物膜相关基因Aave_2620在西瓜噬酸菌中的表达量;与WT-hrpXpGUS相比,ΔAave_3922-hrpXpGUS的启动子活性显著减弱。以上结果表明Aave_3922基因可能通过参与hrpX的转录调控,以及调控生物膜形成来影响西瓜噬酸菌的致病能力。     

平腹小蜂滞育诱导研究

平腹小蜂是果树蝽类害虫的优势天敌，对重要果树蝽类害虫具有较强的控制作用，商品化生产的平腹小蜂已广泛应用于多种果树蝽类害虫的生物防治。为精确控制平腹小蜂的羽化时间和提高防控效果，本文对室内不同温度条件下不同龄期平腹小蜂的滞育诱导进行了初步研究。结果表明：平腹小蜂的滞育虫态为预蛹，从卵期开始至预蛹前期，对其进行低温和短光照刺激均可以诱导其进入滞育。短光照（6L：18D），17℃条件下，处于卵期、1~2龄期和2~3龄期的平腹小蜂发育至预蛹期，滞育率分别为76.37%、81.51%和60.28%，其中卵期开始诱导和1~2龄开始诱导的处理之间，滞育率无显著性差异，且卵期处理组和1~2龄处理组的滞育率显著高于2~3龄处理组的滞育率；短光照条件下，当温度降低到11℃和14℃，对1~2龄和2~3龄期的平腹小蜂诱导滞育，滞育率显著下降到20%以下。综合而言，短光照条件下，温度在诱导平腹小蜂进入滞育中起着至关重要的作用。不同龄期平腹小蜂在17 ℃持续处理后，预蛹的滞育率不同。在本研究中，17℃结合短光照，对卵期和1~2龄期的平腹小蜂进行诱导，可获得较高的滞育率。