蔗糖水解酶注释基因XC0805与野油菜黄单胞菌8004菌株的蔗糖利用及致病相关

 野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)是造成十字花科植物减产的重要病原菌,其通过水孔或伤口进入植物体内并在维管束中快速繁殖。光合产物(蔗糖)的运输主要依靠植物维管组织,同时蔗糖也是维管组织重要的能量来源。本研究利用生物信息学和遗传学等方法对Xcc中参与蔗糖利用的基因进行了分析,并研究了这些基因与其致病力的关系。Xcc 8004菌株中注释的参与蔗糖分解蛋白的编码基因有XC1002、XC1642、 XC1645和XC0805。 XC1002和XC1642的编码产物属于糖苷水解酶GH97蛋白超家族,而XC1645和XC0805的编码产物则属于GH13家族。突变分析发现除XC0805外,其他3个都不影响Xcc的蔗糖利用能力。接种实验表明,XC0805参与Xcc的侵染或在植物体内的生长,其他3个不参与致病过程。另外,Xcc 8004中预测参与蔗糖转运的基因(XC0806和XC0807)突变并不影响细菌的蔗糖利用和致病力,表明其可能存在其他的蔗糖转运通路。上述结果说明XC0805可能是Xcc 8004主要的蔗糖水解酶基因,且在致病中起重要作用。     

一个推测的野油菜黄单胞菌Ⅲ型分泌效应子基因XopXccP对寄主植物的致病性分析

 野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv. campestris, Xcc)是一种在全球范围内引起十字花科植物黑腐病的重要病原细菌。Xcc中效应蛋白与植物互作机理的研究还不够全面, 在已经测序的菌株Xcc 8004中, Xc_2994基因预测编码一个III型分泌效应蛋白XopXccP, 其生物学功能尚不清楚。为了探索XopXccP的生物学功能, 我们构建了Xcc 8004菌株的XopXccP基因缺失突变体, 结果发现XopXccP基因缺失后, 病原菌在多个甘蓝、花椰菜以及模式植物拟南芥(Col-0)上的致病性显著下降, 甚至几乎不致病。同时, 采用农杆菌侵染拟南芥花序的转化方法, 获得了转XopXccP基因拟南芥纯系, 经过诱导效应蛋白XopXccP在拟南芥中表达, 发现转基因拟南芥出现类似病斑的细胞死亡。本研究结果初步证明, XopXccP是一种毒性蛋白, 是Xcc 8004对多数十字花科植物致病所必须的。     

一个用于鉴定十字花科黑腐病菌Ⅲ型效应物分泌与转运的报告质粒的构建

 通过免疫检测的方法鉴定十字花科黑腐病菌(Xcc)Ⅲ型效应物的分泌和转运,将cyaA基因克隆至带有3×FLAG的pJXG载体上,构建带有3×FLAG和cyaA基因的报告质粒pJAA,并用已鉴定为Ⅲ型效应物的XC_1553启动子区信号区验证该报告质粒。将pJAA1553三亲导入Xcc 8004^*和8004^*ΔhrcV,然后通过Western blotting免疫检测XC_1553的分泌,结果在8004^*/pJAA1553的胞外蛋白中检测到了XC_1553的分泌,而在8004^*ΔhrcV/pJAA1553的胞外蛋白中没有检测到XC_1553的分泌。通过免疫反应定量检测8004^*/pJAA1553和8004^*ΔhrcV/pJAA1553侵染后植物体内的cAMP含量,结果发现8004^*/pJAA1553侵染后植物体内的cAMP含量比8004^*ΔhrcV/pJAA1553侵染后植物体内的cAMP含量高15倍。结果表明,报告质粒pJAA能够应用于鉴定十字花科黑腐病菌的Ⅲ型效应物。     

十字花科黑腐病菌IV型分泌系统的诱导表达与抗逆功能分析

 细菌通过IV型分泌系统(Type IV Secretion System, T4SS)的接合系统、效应物转运系统和释放/吸收系统3个子家族进行DNA、蛋白质及毒素的分泌和转运。十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv. campestris, Xcc)是一种重要的植物病原菌,也是研究植物病原细菌与植物相互作用机理的模式细菌之一。本研究通过检测Xcc 8004野生型菌株和T4SS突变体在不同条件下的生长、诱导情况及对过敏反应的影响发现:T4SS不影响在培养基中的生长,与野生型菌株相比,T4SS突变体在非寄主辣椒ECW-10R上的过敏反应减弱;T4SS相关基因受基本培养基MMX诱导表达,且与Ni²⁺、H₂O₂、Phenol等抗逆相关。推测T4SS相关基因在该病原菌的接触、识别阶段起作用。     

柑橘溃疡病菌gpd1基因在致病性中的功能分析

 甘油作为微生物重要的能量来源及抗逆因子,对其生存具有重要作用。gpd1基因编码甘油-3-磷酸脱氢酶(glycerol-3-phosphate dehydrogenase, G3PDH),是甘油合成代谢途径中关键的限速酶。本研究分析了gpd1基因在柑橘溃疡病菌(Xanthomonas citri subsp. citri, Xcc)致病性中的功能。对Xcc强毒菌株Xcc021和弱毒菌株Xcc049E分别进行了gpd1的缺失突变,发现gpd1缺失仅影响强毒菌株Xcc021在感病柑橘寄主上的毒性以及gpd1缺失影响Xcc在营养贫乏培养基中的生长能力,功能互补子能够恢复毒性和生长能力至野生型水平。其他毒性相关表型显示:与野生型Xcc021相比,gpd1突变体菌体的沉降能力增加,游动性降低,生物膜形成能力增强,功能互补子能够恢复这些表型至野生型水平。这表明gpd1基因在强毒菌株中是重要的毒性因子,其涉及的甘油代谢途径可能在强弱毒菌株对于寄主柑橘的毒性具有不同的作用。     

柑橘溃疡病菌gpd1基因在致病性中的功能分析

 甘油作为微生物重要的能量来源及抗逆因子,对其生存具有重要作用。gpd1基因编码甘油-3-磷酸脱氢酶(glycerol-3-phosphate dehydrogenase, G3PDH),是甘油合成代谢途径中关键的限速酶。本研究分析了gpd1基因在柑橘溃疡病菌(Xanthomonas citri subsp. citri, Xcc)致病性中的功能。对Xcc强毒菌株Xcc021和弱毒菌株Xcc049E分别进行了gpd1的缺失突变,发现gpd1缺失仅影响强毒菌株Xcc021在感病柑橘寄主上的毒性以及gpd1缺失影响Xcc在营养贫乏培养基中的生长能力,功能互补子能够恢复毒性和生长能力至野生型水平。其他毒性相关表型显示:与野生型Xcc021相比,gpd1突变体菌体的沉降能力增加,游动性降低,生物膜形成能力增强,功能互补子能够恢复这些表型至野生型水平。这表明gpd1基因在强毒菌株中是重要的毒性因子,其涉及的甘油代谢途径可能在强弱毒菌株对于寄主柑橘的毒性具有不同的作用。     

线粒体羧酸盐转运蛋白BcMito-TTP参与灰葡萄孢致病、产孢及菌核发育的研究

 灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)可侵染1 400多种植物,给全世界农作物生产造成了严重的损害。BcMito-TTP蛋白是一种进化保守的线粒体羧酸盐转运蛋白,酿酒酵母中研究发现该羧酸盐转运蛋白主要负责催化柠檬酸盐通过线粒体内膜流出以交换羧酸盐H⁺离子等。本研究通过对BcMito-TTP基因进行敲除和功能互补发现,与原始菌株相比,敲除转化子生长速度没有差异,但产孢量有所降低,致病力明显减弱,菌核形成进程推迟。BcMito-TTP敲除转化子在添加CH₃COONa培养基中生长速度变慢且将BcMito-TTP基因互补可以恢复上述生物学性状。推测BcMito-TTP蛋白的缺失阻碍了CH₃COONa在灰葡萄孢体内的运输继而影响其孢子和菌核的形成,BcMito-TTP 基因参与灰葡萄孢致病力分子机制正在进一步研究之中。     

一个编码富含丝氨酸蛋白的基因影响大丽轮枝菌的微菌核形成、产孢及致病力

 大丽轮枝菌是一种可在广泛的寄主范围内引发黄萎病的土传植物病原真菌,主要以微菌核的形式在土壤中存活多年,因此鉴定与微菌核形成及致病力相关的基因对防治该病害至关重要。本课题组从前期构建的棉花黄萎病菌T-DNA插入突变体库中筛选到一个微菌核明显减少的突变体,致病力测定结果表明,该突变体致病力明显下降。以棉花黄萎病菌野生型菌株V592的基因组DNA为模板,从棉花黄萎病菌中克隆到被T-DNA插入突变的基因(VdSRP1)编码区全长为415 bp,包含一个外显子,编码一个富含丝氨酸蛋白,与任何已知的注释基因没有显著的序列相似性。为了明确VdSRP1基因在大丽轮枝菌中的功能,利用同源重组的原理及农杆菌介导的遗传转化方法获得了VdSRP1基因的2个敲除体菌株,与棉花黄萎病菌野生型菌株V592相比,VdSRP1基因敲除突变体的微菌核形成明显减少,产孢量及孢子萌发率下降,对棉花的毒力也显著下降。对野生型菌株V592及VdSRP1敲除突变体的转录分析表明,VdSRP1调控一系列与微菌核形成、孢子形成及致病力相关基因的表达。这些结果表明,VdSRP1基因影响大丽轮枝菌的致病力、微菌核形成、产孢及孢子萌发。     

一个编码富含丝氨酸蛋白的基因影响大丽轮枝菌的微菌核形成、产孢及致病力

 大丽轮枝菌是一种可在广泛的寄主范围内引发黄萎病的土传植物病原真菌,主要以微菌核的形式在土壤中存活多年,因此鉴定与微菌核形成及致病力相关的基因对防治该病害至关重要。本课题组从前期构建的棉花黄萎病菌T-DNA插入突变体库中筛选到一个微菌核明显减少的突变体,致病力测定结果表明,该突变体致病力明显下降。以棉花黄萎病菌野生型菌株V592的基因组DNA为模板,从棉花黄萎病菌中克隆到被T-DNA插入突变的基因(VdSRP1)编码区全长为415 bp,包含一个外显子,编码一个富含丝氨酸蛋白,与任何已知的注释基因没有显著的序列相似性。为了明确VdSRP1基因在大丽轮枝菌中的功能,利用同源重组的原理及农杆菌介导的遗传转化方法获得了VdSRP1基因的2个敲除体菌株,与棉花黄萎病菌野生型菌株V592相比,VdSRP1基因敲除突变体的微菌核形成明显减少,产孢量及孢子萌发率下降,对棉花的毒力也显著下降。对野生型菌株V592及VdSRP1敲除突变体的转录分析表明,VdSRP1调控一系列与微菌核形成、孢子形成及致病力相关基因的表达。这些结果表明,VdSRP1基因影响大丽轮枝菌的致病力、微菌核形成、产孢及孢子萌发。     

灰葡萄孢BcPDR1基因与PKA编码基因的关系研究

 为明确灰葡萄孢BcPDR1基因与病菌cAMP信号途径中PKA编码基因BcPKA1、BcPKA2、BcPKAR之间的关系,利用Real-time PCR技术分析了BcPDR1基因突变对PKA编码基因BcPKA1、BcPKA2、BcPKAR表达的影响,以及PKA编码基因突变对BcPDR1基因表达的影响。结果发现,BcPDR1基因突变体中BcPKA1、BcPKA2、BcPKAR的表达水平均显著高于野生型和回复菌株,BcPKA1、BcPKA2、BcPKAR基因的RNAi突变体中BcPDR1基因表达水平显著低于野生型。我们分别构建了PKA编码基因BcPKA1、BcPKA2、BcPKAR在敲除突变体ΔBcpdr1中过表达的菌株ΔBcpdr1/BcPKA1-OE、ΔBcpdr1/BcPKA2-OE、ΔBcpdr1/BcPKAR-OE;对过表达菌株的表型和致病力进行分析发现,过表达菌株的菌落形态、菌核形成、菌丝形态、生长速率、产孢量和致病力均与突变体ΔBcpdr1表现显著的差异,而更接近野生型BC22的表型和致病力。结果表明,灰葡萄孢BcPDR1基因与PKA亚基基因BcPKA1、BcPKA2和BcPKAR的表达水平密切相关,BcPDR1基因负调控这3个基因的表达,而这3个基因对BcPDR1基因表达有正调控作用。本研究为进一步阐明灰葡萄孢BcPDR1基因调控病菌生长发育和致病力的分子机制奠定了基础。     

十字花科黑腐病菌纤维素酶主效基因XC0639 CBD结构域功能的分析

十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv. campestris,Xcc)几乎能引起所有十字花科植物产生黑腐病[1]。该菌是研究植物与病原微生物互作的模式菌株之一[2]。植物病原菌在侵染宿主植物时需要先降解植物细胞的细胞壁,纤维素和半纤维素是细胞壁的主要成分。纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一类复合酶,主要由内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶以及β-葡萄糖苷酶3类酶组成,三者作用方式不同,但能协同催化水解纤维素[3]。     

十字花科黑腐病菌hrp基因致病功能分析

通过对Xcc 8004菌株的hrp基因进行逐一敲除,系统研究单个hrp基因对Xcc致病性的贡献。结果表明,9个hrc(hypersensitive response and conserved)基因单独突变后在满身红萝卜上的致病性和在辣椒ECW-10R上激发HR的能力完全丧失;9个hrp基因中,hrpW突变后在辣椒ECW-10R上仍能产生HR,满身红萝卜上致病性减弱,其余hrp基因突变后致病性和过敏反应均丧失;4个hpa(hrp associated protein)基因突变后,hpaA和hpaB突变体完全丧失在满身红萝卜上的毒性也不能在辣椒ECW-10R上引起HR,hpa1和hpaP突变后致病性和HR显著减弱。另外,通过RT-PCR对Xcc 8004 hrp基因簇的每个基因受hrpX和hrpG的调控情况进行分析,结果表明所有hrp基因在不同程度上都受到hrpG、hrpX的正向调控。     

十字花科黑腐病菌中一个假定蛋白基因XC_3605与致病相关

十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)是全球范围内能引起十字花科植物黑腐病的重要植物病原细菌,也是研究植物病原细菌与植物互作机制的模式细菌。利用自杀质粒pK18mobsacB诱变十字花科黑腐病菌Xcc 8004的XC_3605基因,获得缺失突变体D3605。表型分析发现D3605胞外多糖合成能力、游动能力及致病力显著降低,积聚形成生物被膜的能力增强。用带有全长XC_3605基因序列的pLAFRJ对D3605进行功能互补,其胞外多糖产量、游动性、致病力和生物被膜均得到恢复。研究结果表明,XC_3605基因在十字花科黑腐病菌致病过程中发挥作用。     

野油菜黄单胞菌效应蛋白AvrXccC与拟南芥BIK1在植物体内相互作用

 AvrXccC是野油菜黄单胞菌Xcc8004的一个III型分泌效应蛋白。前期研究发现AvrXccC在拟南芥rar1突变体上发挥毒性功能,并且抑制植物的先天免疫反应。但是,AvrXccC在植物体内的毒性靶标还不清楚。本研究发现AvrXccC与植物体内的蛋白激酶BIK1发生特异的相互作用。然而,在拟南芥原生质体中,AvrXccC 并不能抑制鞭毛蛋白诱导的BIK1迁移,表明AvrXccC不是通过抑制BIK1的磷酸化来发挥功能的。有趣的是,AvrXccC可以在体外直接被BIK1磷酸化,我们推测AvrXccC可能作为BIK1的底物从而干扰了鞭毛蛋白诱导的先天免疫反应。     

安徽省小麦白粉菌群体的毒性监测和分析

 为明确近年来安徽省小麦白粉病菌群体的毒性及其变化,利用41个鉴别寄主对安徽省2010、2015和2019年小麦白粉菌群体进行了毒性监测和分析。研究结果表明,病菌群体对抗性基因(组合)Pm3c、Pm5a、Pm7、Pm19、Pm3d、Pm17、Pm6、Pm1a、Pm3a、Pm3f、Pm8、Pm1+2+9和Pm3e的平均毒性频率大于70%,表明这些抗性基因或组合在安徽省小麦生产上已丧失抗性,不能在抗病育种中继续使用;对Pm12、Pm21、Pm16、Pm1c、Pm35、Pm13和Pm2+MLD的毒性频率小于20%,这些抗性基因(组合)仍具有良好的抗性,可在抗病育种中加以利用。安徽省小麦白粉菌毒性数据的主成分分析结果表明,2010、2015和2019年病菌群体毒性结构总体上可看成一个群体,但年份间病菌群体毒性结构具有一定的差异,应加强安徽省小麦白粉菌群体毒性的持续监测工作。研究结果对安徽省小麦白粉病的抗病育种及品种的合理布局具有指导意义。     

水稻条斑病菌rsmA基因在致病性中的功能分析

RsmA属于CrsA/RsmA蛋白家族成员,是一类RNA结合蛋白,作为一类全局性的转录后调控因子,调控碳代谢、生物膜形成、游动性以及致病性相关基因的表达等。同源性搜索结果显示,水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xoc)RS105中存在rsmA基因,其与白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)PXO99A的rsmAXoo同源性为100%。但是,r smAXoc基因在致病性中的功能未知。本研究构建了Xoc的rsmA缺失突变体RΔrsmA。寄主水稻和非寄主烟草接种结果显示,RΔrsmA在水稻上仍具有致病性,在非寄主烟草上也能够激发HR反应,这些结果与已鉴定的Xoo rsmA突变体表型不一致。但是,与野生型菌株相比,RΔrsmA在感病水稻上的毒性显著降低;在丰富和贫乏的培养基中,RΔrsmA的生长能力也明显减弱。其他毒性相关表型的测定结果显示,与野生型菌株相比,RΔrsmA在半固体培养基上的游动能力减弱,生物膜形成能力增强,胞外多糖产量明显降低,胞外蛋白酶的活性增加。这些结果暗示在Xoc中rsmA为重要的毒性相关基因,在Xoo和Xoc中RsmA在致病性中的功能存在一定的差异,RsmA下游调控基因的鉴定可能为解析其在2个水稻致病变种中功能的差异提供线索。