苹果树腐烂病菌拮抗放线菌JPD-1的筛选及鉴定

为筛选对苹果树腐烂病菌Valsa mali具有拮抗作用的放线菌,从苹果树根际土壤中分离获得放线菌,利用平板对峙法和生长速率法筛选拮抗活性较高的菌株,通过菌株培养特征、形态特征、生理生化特性及16S rDNA序列分析确定其分类地位,并采用离体枝条烫伤接种法测定所筛选获得的拮抗菌株对苹果树腐烂病的防效。结果表明,从苹果树根际土壤中共分离获得28株放线菌,其中菌株JPD-1对苹果树腐烂病菌的拮抗作用最强,抑制率为72.50%,该菌在高氏合成1号培养基上生长最好,培养7 d时菌落生长旺盛,气生菌丝白色,基生菌丝深粉红色,无可溶性色素产生;经形态特征观察、生理生化试验及16S rDNA序列分析,将菌株JPD-1鉴定为公牛链霉菌Streptomyces tau‐ricus。菌株JPD-1发酵滤液对苹果树腐烂病菌的抑制率及对离体枝条上苹果树腐烂病的防效均随稀释倍数的增大而减弱,发酵滤液原液使苹果树腐烂病菌菌丝膨大、末端畸形,抑制率为78.14%,对离体枝条上苹果树腐烂病的防效为76.37%。表明分离到的放线菌菌株JPD-1可以用作苹果树腐烂病的生防材料,具有很好的开发及应用前景。     

苹果树腐烂病拮抗细菌菌株BJ1的鉴定及其抑菌作用

为开发对苹果树腐烂病有效的生防措施,对从山东栖霞苹果果园根际土壤中分离的63株细菌进行了筛选,获得有显著拮抗作用的菌株BJ1。采用玻片法和对峙培养法测定BJ1对苹果树腐烂病菌孢子萌发和菌丝生长的抑制作用及其抑菌谱,根据菌株BJ1的形态特征、生理生化特性及16S rDNA序列对其进行鉴定,并用离体枝条烫伤接种法对腐烂病的防效进行测定。菌株BJ1对腐烂病菌的抑制率为78.38%,其发酵滤液的抑菌率达到70.54%;BJ1可显著降低腐烂病菌分生孢子的萌发率,致使菌丝畸形、分支增多及细胞质外渗;该菌株对常见的8株果树病原真菌具有显著的拮抗作用。经鉴定,菌株BJ1属于微嗜酸寡氧单胞菌Stenotrophomonas acidaminiphila。BJ1不同稀释倍数的发酵滤液均对苹果树腐烂病有明显的抑制作用,其稀释50倍发酵滤液的防效仍可达81.06%,表明该菌株具有良好的生防潜力。     

七株植物内生放线菌对苹果树腐烂病的防治作用

通过分生孢子萌发试验、菌丝抑制试验、接种离体枝条试验及田间病斑涂抹药剂防治试验,研究了7株植物内生放线菌对苹果树腐烂病的防治效果。结果表明,7株植物内生放线菌无菌发酵滤液对病原菌分生孢子萌发及菌丝生长均有明显的抑制作用,2倍稀释液对孢子萌发抑制率均达85%以上,20倍稀释液对菌丝生长抑制率均达80%以上。显微观察发现,Hhs.015 (BAR1-5)菌株无菌发酵滤液可导致病菌芽管、菌丝畸形。在人工接种条件下,无菌发酵滤液原液对离体枝条病斑扩展具有明显的抑制作用,其中AR1-14、Hhs.015 (BAR1-5)和TGYXCSA-7处理5天后防治效果分别达83.2%、69.7%和85.6%。田间刮除病斑后涂抹放线菌发酵原液也可明显抑制病斑复发,防效均达80%以上。     

5种矿物源药剂对苹果树腐烂病菌室内防效评价

为了筛选高效低毒且对苹果树腐烂病防效较佳的矿物源农药,本试验采用菌丝生长速率法、玻片孢子萌发法和离体枝条烫伤接种法,测定了5种矿物源药剂对苹果树腐烂病菌菌落生长和分生孢子萌发的抑制作用,以及其在离体枝条上的防治效果。结果表明,5种矿物源农药对苹果树腐烂病菌菌落的生长和分生孢子萌发均具有显著的抑制作用,当70%腐植酸钠GR、77%氢氧化铜WP、80%波尔多液WP、86.2%氧化亚铜WG和77%硫酸铜钙WP质量浓度分别为5、257、400、123和385μg/mL时,其对苹果树腐烂病菌菌丝生长的抑制率分别为97.55%、97.67%、98.94%、95.48%和98.43%,其EC_(50)分别为2.60、71.15、159.60、77.40和95.73μg/mL;对苹果树腐烂病菌分生孢子萌发的抑制率分别为96.33%、97.67%、98.67%、91.01%和95.58%,其EC_(50)分别为1.38、69.3、145.41、65.48和102.98μg/mL。离体枝条防效测定表明,5种矿物源农药中70%腐植酸钠GR对苹果树腐烂病防效最佳,为86.83%。因此,腐植酸钠可作为防治苹果树腐烂病的最佳矿物源农药。     

S-921菌株及其发酵液对苹果树腐烂病菌作用的试验研究

采用平板和离体培养法测定S-921菌株及其发酵液对苹果树腐烂病菌的作用。结果表明,S-921菌对苹果树腐烂病菌有较强的抗生作用,二者在PDA平极培养基上共同培养时,能产生直径30～40mm的抑菌圈。将苹果树腐烂病菌用S-921菌株发酵液浸泡处理12小时,可失去致病能力。离体培养的结果表明,刮除病斑后涂抹S-921菌株发酵液的治疗效果最好,治愈率达100％;在病斑处划刻(间隔2～3mm)后涂抹的,仅能短时期的抑制病斑扩大,不能治愈。S-921菌发酵液对苹果树腐烂病菌具有溶菌作用,使原生质凝集,液泡消失,菌丝壁溶解,原生质外流,菌丝体崩溃而解体。     

一株沙福芽胞杆菌ZG6的筛选、鉴定及其对茶树轮斑病的生防潜力研究

轮斑病是茶树生产上的重要病害，造成茶叶产量和品质重大损失。为获得有效防治茶树轮斑病的生防菌株，从合肥茶园茶树根部组织中分离筛选到一株对茶树轮斑病菌具有较强拮抗活性的内生细菌ZG6。对峙培养条件下，该菌株对茶树轮斑病菌的菌丝抑制率可达65.38%。基于菌落形态、生理生化特征、16S rRNA和gyrB基因的序列分析，将菌株ZG6鉴定为沙福芽胞杆菌Bacillus safensis。菌株ZG6具有广谱抑菌能力，对油菜菌核病菌、玉米小斑病菌和苹果腐烂病菌表现出较强的抑制效果，抑制率分别为78.82%、64.71%和61.82%。酶学试验结果表明，菌株ZG6在代谢过程中可产生纤维素酶和蛋白酶。茶树离体枝条叶片防效试验结果表明，菌株ZG6的发酵液、无菌发酵滤液与菌液均对茶树轮斑病有预防和控制效果，在茶树离体枝条的叶片上的防效可达69.9%以上。由此可见，沙福芽胞杆菌ZG6具有作为防治茶树轮斑病生防菌剂研发的潜力。     

蓝莓枝枯病拮抗细菌HMQAU140045的鉴定和抑真菌活性

以蓝莓毛色二胞枝枯病菌假可可毛色二胞Lasiodiplodia pseudotheobromae为靶标菌,通过稀释平板法从山东青岛的蓝莓种植园根际土壤中分离出20株细菌,采用对峙平板法和菌丝生长速率法筛选得到一株对靶标菌具有明显抑制效果的拮抗菌株HMQAU140045,采用凹玻片法和菌丝生长速率法测定该菌株发酵滤液对靶标菌孢子萌发和菌丝生长的影响。结果表明,稀释50倍的发酵滤液的抑制率可达100%。离体枝条试验结果表明,发酵液不同组分对蓝莓毛色二胞枝枯病的防治效果均可达90%以上。菌丝生长速率法测定结果表明,该菌株抑真菌谱广,对包括4种蓝莓枝枯病菌在内的15种植物病原真菌具有良好的拮抗作用。通过形态观察、生理生化特性以及gyrB的序列分析,确定该菌株为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens。试验结果表明,解淀粉芽孢杆菌菌株HMQAU140045具有较好的抑真菌活性。     

苹果树皮内生真菌的分离及其对腐烂病的生物防治潜力

为了明确苹果树皮中内生真菌的种类及其对苹果树腐烂病菌的抑制作用,对25年生富士苹果健康树皮中的内生真菌进行了分离和初步鉴定,并通过室内抑菌试验和田间保护作用试验测定其内生真菌对苹果树腐烂病菌的抑制作用。分离到的126株内生真菌分属于13个属,主枝中分离到的内生真菌的种类和数量较多;对峙试验中对苹果树腐烂病菌的抑菌率在40%以上的有24株,其中87.5%的菌株为链格孢属真菌。Al 6的培养滤液对腐烂病菌菌丝生长抑制作用较强,抑制率为83.76%;Al 58对其孢子萌发抑制作用较大,抑制率为82.42%;Al 67产生的挥发物质对腐烂病菌菌丝生长的抑制作用较大,为24.41%。田间试验结果显示,用拮抗性内生真菌预先占位接种苹果树枝干,能有效抑制腐烂病菌的侵入和病斑的扩展,Al 107的抑制作用最强。     

5种植物源药剂对苹果树腐烂病室内防效评价

采用菌落生长速率法、分生孢子玻片萌发法和离体枝条烫伤接种法测定了5种植物源药剂对苹果树腐烂病室内防治效果。结果表明, 5种植物源药剂对苹果树腐烂病菌菌落生长和分生孢子萌发均具有显著的抑制作用, 当0.3%丁子香酚SL、5%香芹酚AS、20%乙蒜素EC、0.5%小檗碱AS和1.3%苦参碱AS的有效成分浓度分别为3、50、100、50和14.44 μg/mL时, 其对苹果树腐烂病菌菌落生长的抑制率分别为98.63%、99.22%、99.22%、100%和79.29%, 其EC50分别为0.43、8.78、11.21、13.68和8.11 μg/mL; 对苹果树腐烂病菌分生孢子萌发的校正抑制率分别为97.92%、100%、95.83%、77.08%和96.88%, 其EC50分别为0.70、8.56、20.39、28.23和8.04 μg/mL。离体枝条保护试验表明, 20%乙蒜素EC有效成分浓度为100 μg/mL时对离体枝条保护作用最佳。本研究通过筛选明确了5种植物源药剂中0.3%丁子香酚SL可作为抑制苹果树腐烂病菌菌丝生长和分生孢子萌发的最佳药剂, 以及20%乙蒜素EC可作为离体枝条保护作用的最佳药剂。     

拮抗细菌B8对烟草黑胫病菌的抑制作用及其菌株鉴定

从烟草根际土壤中分离到对烟草黑胫病菌及其它植物病原菌具有抑制作用的菌株B8,平板对峙培养抑菌带内菌丝畸形、原生质凝集或外渗。其发酵原液和发酵液的无菌滤液均能抑制烟草黑胫病菌和蜡状芽孢杆菌;离体叶片接种法测定其发酵液对烟草黑胫病的防效,结果表明预防作用达100%。室内盆栽试验表明B8菌株发酵液对烟草黑胫病的预防作用可达78.1%,优于治疗作用。该菌菌体杆状,芽孢侧生、椭圆形,经形态学、生理生化性状和16S rDNA序列测定,将其鉴定为侧孢短芽孢杆菌。     

梨和苹果腐烂病菌不同培养表型菌株的致病性分析

The pathogenicity of three strains (F-SD-8, F-BJ-2c-2 and F-HN-2a-1) of Valsa mali var. pyri causing pear canker and one strain (F-SX-A6) of V. mali var. mali causing apple canker in China were comparatively tested by wound inoculation on in vitro twigs of pear, apple and some other woody plants, and in vivo twigs of pear. Significant pathogenicity differentiation was detected in V. mali var. pyri. Generally strains F-SD-8 and F-BJ-2c-2 were highly pathogenic on pear although their culturing characteristics differed greatly. The strain F-SX-A6 was more aggressive on apple than on pear, and the strain F-HN-2a-1 showed significant lower pathogenicity on ten pear cultivars and other seven species of woody plants. Our results confirmed that two variants of V. mali had host preference and were also aggressive to crabapple, apricot, and peach besides apple and pear. Meanwhile, strains F-SD-8 and F-BJ-2c-2 could induce the formation of pycnidia on in vivo twigs of pear, which was not observed on in vivo twigs inoculated with F-HN-2a-1 and F-SX-A6.     

地肤子提取物对苹果树腐烂病菌的抑制作用及对其菌体结构和功能的影响

为开发新型安全高效的植物源苹果树腐烂病防治剂,采用菌丝生长速率法测定中草药地肤子乙醇提取物及各层析流分L1～L9对苹果树腐烂病菌Valsa mali的抑制作用,同时通过室内常规分析方法观测流分L7对该菌菌丝形态结构、细胞膜通透性及物质吸收和代谢的影响。结果表明,地肤子乙醇粗提物浓度为2 mg/mL时对苹果树腐烂病菌具有较强的离体抑制活性,处理后96 h的抑菌率达到92.16%。分别用石油醚、氯仿、正丁醇萃取醇提物,石油醚萃取物对苹果树腐烂病菌的抑制效果最为明显,其EC_(50)为0.07 mg/mL;在石油醚萃取物通过硅胶柱层析分离得到的9种流分中,流分L7对苹果树腐烂病菌的抑制作用显著,离体抑菌率高达96.73%;且在流分L7处理下,病菌菌丝体出现肿胀、膨大或畸形等现象,细胞膜通透性增大,可溶性蛋白、还原糖以及丙酮酸的含量随流分L7浓度的升高而持续降低,当浓度为100μg/mL时,菌丝体可溶性蛋白、还原糖及丙酮酸的含量分别降低70.78%、71.74%和78.68%。表明在离体培养条件下地肤子乙醇提取物能明显抑制苹果树腐烂病菌的生长,并对菌丝体细胞膜结构和功能稳定性产生显著影响,具有进一步开发为新型植物源苹果树腐烂病防治剂的潜力。     

解淀粉芽胞杆菌HRH317对串珠镰孢菌菌丝形态和超微结构的影响

为明确新型生防菌解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciens HRH317菌株对病原菌串珠镰孢菌Fusarium moniliforme的抑制作用,采用牛津杯法对HRH317菌株抑菌活性进行测定,并采用扫描电子显微镜、透射电子显微镜和荧光显微镜对经HRH317菌株发酵上清液处理后的串珠镰孢菌菌丝形态及超微结构进行观察。结果显示,HRH317菌株发酵上清液对串珠镰孢菌有很好的抑菌活性,抑菌圈平均直径可达33.31 mm。扫描电镜结果显示,HRH317菌株发酵上清液处理24 h时,串珠镰孢菌菌丝体出现断裂现象;处理72 h时,串珠镰孢菌菌丝体断裂较严重,多处裂解;处理96 h时,串珠镰孢菌菌丝体彻底瓦解,且无完整菌丝体。透射电镜结果显示,HRH317菌株发酵上清液处理72 h时,串珠镰孢菌菌丝体细胞形态扭曲变形,细胞内结构紊乱,遭破坏。荧光显微镜结果显示,经PI染料染色处理12 h时,串珠镰孢菌细胞有少数细胞被染成红色,细胞膜通透性受一定程度破坏;处理16 h时,串珠镰孢菌细胞大面积被染红;处理20 h时,串珠镰孢菌细胞被染色面积增大;处理24 h时,串珠镰孢菌细胞膜受破坏程度增加,细胞内大面积被染色。表明解淀粉芽胞杆菌HRH317菌株对串珠镰孢菌菌丝形态和超微结构有破坏作用,能抑制病原菌串珠镰孢菌菌丝体生长。     

极长链霉菌SL01菌株抑菌活性物质的发酵条件优化和稳定性研究

为了获得极长链霉菌Streptomyces longissimus SL01菌株发酵的最佳培养基配方和发酵条件,采用单因素和正交试验法对SL01菌株的发酵液配方进行了优化,采用离体枝条和果实病斑抑制试验检测了其配方优化效果,并测定了SL01抑菌活性物质对温度、酸碱度和紫外光照射的稳定性。最终获得最佳发酵液的配方（质量分数）为:小米粉2%、酵母粉1%和MgSO4·7H2O 0.15%。以在28℃、初始pH 7.0、接种量2%、装液量50 mL/250 mL和转速180 r/min的条件下培养7 d得到的发酵液抑菌活性最强。采用优化的培养基配方发酵所得的SL01发酵液对苹果枝条和果实上的苹果树腐烂病的防效,分别比对照提高了39.86%和10.15%。所得发酵液在低于40℃、pH在6~10或紫外光照射12 h时,抑菌活性仍较为稳定。研究表明,通过培养基优化,可以显著提高SL01发酵产物的抑菌活性。     

苹果树腐烂病菌VmMFS1~VmMFS3基因的功能分析

为绿色持久防控苹果树腐烂病,该研究分析苹果树腐烂病菌Valsa mali的3个主要协同转运蛋白超家族（major facilitator superfamily,MFS）编码基因的氨基酸序列特征,利用实时荧光定量PCR （quantitative real-time PCR,RT-qPCR）技术分析这3个基因在苹果树腐烂病菌侵染阶段的表达水平,通过构建这3个基因的缺失突变体和回补菌株分析其在病原菌营养生长、致病力和非生物胁迫应答等方面的功能。结果表明,这3个基因的氨基酸序列均具有MFS保守结构域,将其命名为VmMFS1~VmMFS3; VmMFS1和VmMFS2的进化距离较近,均与VmMFS3的进化距离较远;在苹果树腐烂病菌侵染过程中VmMFS1~VmMFS3基因表达均显著上调;与野生型03-8菌株相比,VmMFS1~VmMFS3基因缺失突变体的菌落形态无明显差异,但生长速度下降; VmMFS1~VmMFS3基因缺失突变体的致病力均显著降低; VmMFS1~VmMFS3基因缺失突变体对H₂O₂胁迫的敏感性无明显变化,但对NaCl胁迫更敏感;基因回补后基因缺失突变体的表型缺陷能恢复到野生型菌株的水平。     

海洋生境贝莱斯芽孢杆菌TCS001的鉴定及抑真菌活性

为研究海洋生境芽孢杆菌TCS001的分类地位和抑菌活性,通过形态和生理生化特征观察,并结合gyrA序列同源性分析对菌株进行了鉴定;通过平板对峙培养法测定了菌株TCS001对多种植物病原真菌的抑菌谱;采用菌丝生长速率法和凹玻片法,测定了不同浓度TCS001菌株发酵滤液对靶标菌黄瓜灰霉病菌Botrytis cinerea菌丝生长和孢子萌发的影响。结果显示:该菌株为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis,其对6种供试病原菌均有一定的抑制效果,其中对黄瓜灰霉病菌的抑制率最高,达87.66%。不同稀释倍数下,TCS001发酵滤液对黄瓜灰霉病菌均有一定的抑制作用,其中,稀释5倍时对菌丝生长和孢子萌发的抑制率最高,分别为96.24%和98.05%,稀释20倍时抑制率也均达90%以上。形态学观察发现,TCS001发酵滤液可导致黄瓜灰霉病菌孢子萌发芽管中间或顶端膨大畸形。研究表明,海洋生境贝莱斯芽孢杆菌TCS001极具开发为微生物农药的潜能。