双重real-time PCR定量测定小麦条锈菌潜伏侵染方法的建立与应用

 小麦条锈病是我国小麦生产上的重要病害之一。为高效准确地定量检测处于潜伏侵染阶段的小麦条锈菌,本研究根据已发表的小麦条锈菌和寄主小麦的引物,设计了各自的探针,建立了双重real-time PCR检测方法。为排除多个引物互作造成的干扰,对小麦条锈菌引物探针体系、小麦体系以及二者的双重real-time PCR体系进行了比较。CT值相关线性回归分析证明,引物之间互作很小,对定量检测无影响。已知浓度样品经梯度稀释,进行灵敏度检测,确定了双重real-time PCR对小麦条锈菌DNA和小麦DNA准确定量测定的最小检测限为0.4 pg和0.5 ng。同时建立了小麦条锈菌和小麦各自的标准曲线。用此方法检测来自两个不同地区的田间样本,得到的分子病情指数(MDI)与随后的发病趋势一致。本研究建立的双重real-time PCR分析方法可靠、高效、低误差,是对本实验室已有小麦条锈菌潜伏期分子检测方法的进一步优化。     

应用real-time PCR评价三种杀菌剂对小麦条锈病的防治效果

为更加精确有效地评估杀菌剂对小麦条锈病的防效,本研究利用real-time PCR检测潜育阶段的分子病情指数(molecular disease index,M DI)并结合田间病情分析,对三种杀菌剂的防效进行评价。春季返青后在品种铭贤169和京0045试验小区的诱发中心接种小麦条锈菌夏孢子,待充分发病后将其铲除。设置播种前2%立克秀拌种,接种后21和28 d分别喷施25%阿米西达和30%苯甲-丙环唑1 500倍液三种处理。发病后调查不同处理的普遍率和严重度,计算病情指数和AUDPC。结果表明,阿米西达和苯甲-丙环唑对小麦条锈病具有良好的防效且能够明显抑制发病中心的扩展,而经立克秀拌种对该病害的防治效果和发病中心扩展的抑制作用均不理想。对京0045于发病中心接种后24和33 d采样,经双重real-time PCR定量检测,计算MDI。结果显示潜育检测获得的M DI与AUDPC之间均具有极显著的相关性;阿米西达和苯甲-丙环唑对潜育期小麦条锈菌的扩展具有明显的持续抑制作用,而立克秀拌种仅对小麦条锈菌潜伏初期的扩展表现出一定的抑制作用。     

多堆柄锈菌潜育期侵染量实时荧光定量PCR检测体系的建立

为快速及时诊断并定量监测玉米内多堆柄锈菌Puccinia polysora潜育期的侵染量,根据多堆柄锈菌的ITS序列和玉米Actin2基因序列,分别设计多堆柄锈菌特异性引物PpoF/PpoR和Taq Man探针PpoP以及玉米特异性引物ZmF/ZmR和Taq Man探针ZmP,对引物和探针的特异性和灵敏度进行测定,并用这2对引物和探针建立多堆柄锈菌潜育期的实时荧光定量PCR检测体系,定量监测接种后玉米叶片中多堆柄锈菌DNA量随时间的变化。结果表明,多堆柄锈菌和玉米的特异性引物和探针对各自靶标片段均具有良好的特异性,灵敏度分别为10^-3ng/μL和10^-2ng/μL;在接种后24 h,利用所建实时荧光定量PCR检测体系即可在玉米叶片中检测到多堆柄锈菌,且潜育期内多堆柄锈菌的侵染量随时间呈指数增长。表明所建实时荧光定量PCR检测体系可用于多堆柄锈菌潜育期侵染量的定量检测和监测。     

小麦条锈菌新菌系V26的SCAR检测标记

 建立小麦条锈菌生理小种的快速分子检测技术体系对小麦条锈菌的监测和防治策略的制定具有重要价值。条锈菌V26是近年来出现的,对我国目前小麦抗病育种中普遍应用的抗条锈病基因Yr26具有毒性的新菌系。该菌系的出现,对我国当前小麦生产、抗病育种都造成了严重威胁。本研究选用189条随机引物对CYR29、CYR31、CYR32、CYR33、T4、Su11-4和V26等7个条锈菌生理小种(菌系)进行了扩增,筛选V26的特异性RAPD片段,并对其进行克隆和测序。根据测序结果,设计并合成SCAR特异性引物, 将V26的RAPD标记转化为稳定的SCAR标记。使得对该菌系的快速检测成为可能,同时也将会为条锈菌新小种的监测提供更为准确的科学依据。     

小麦叶锈菌的特异性分子诊断检测技术

小麦叶锈病由Puccinia triticina引起,是我国小麦生产上的重要病害。本研究旨在建立小麦叶锈菌快速、准确的PCR诊断检测技术体系,用于病害精准测报和综合防控。以真菌β-微管蛋白基因的保守序列为引物,进行小麦锈菌gDNA的PCR比较分析,发现小麦叶锈菌具有长度为268bp的特异性DNA片段;序列分析后设计了2对专化性引物,成功获得检测灵敏度为5.00pg/μL模板DNA浓度水平的小麦叶锈菌种的特异性SCAR标记。对55个来自我国不同麦区的小麦叶锈菌标样以及其它麦类病原真菌的检测表明,该叶锈菌标记的检测可靠性达100%。人工接种条件下,叶锈菌侵染24h后,即可在小麦叶片内检测到该标记。     

应用real-time PCR 定量检测田间小麦条锈菌潜伏侵染的研究

 为快速、及时地定量检测处于潜育状态下的小麦条锈菌菌量,本研究于2009－2010年实施田间试验,在北京和甘肃各设3个试验小区,将小区分割成1 m×1 m或1.5 m×1.5 m的小格。初春刚返青叶片出现症状前,在每小格内采集30片叶,提取叶片基因组DNA,应用已建立的real-time PCR定量测定方法,计算每个样本的分子病情指数(molecular-detected disease index, MDI）。在本试验的天气条件和试验设计下,采样10 d后,调查田间标记采样点的发病情况,计算病情指数DI,比较MDI和DI的关系,建立回归模型。结果表明：甘肃甘谷3个试验小区的MDI和DI存在极显著的相关性（R₂¹=0.813 6,R₂²=0.884 5,R₂³=0.592 8）;北京上庄3个试验小区的MDI和DI也存在极显著的相关性（R₂¹=0.742 3,R₂²=0.578 4,R₂³=0.858 4）。本研究证明了应用分子生物学方法可估测小麦条锈病潜育侵染程度的可能性,为建立分子定量测定田间潜育侵染量系统提供了可靠依据。     

小麦条锈菌对三唑酮敏感性生测体系优化及其抗药性分子标记开发

条锈病是小麦上重要的真菌病害，严重威胁小麦的生产安全，施用杀菌剂是防治小麦条锈病的重要措施。三唑酮是防治条锈病的主要药剂，但长期单一、大规模使用三唑酮势必导致病原菌抗药性出现，由于小麦条锈菌是严格的专性寄生菌，目前测定条锈菌对杀菌剂的敏感性实验主要在活体小麦上进行，实验结果易受外界环境影响。本研究通过培养皿内离体小麦叶段培养，采取定量接种和软件读数的方法，对2021年西北核心越夏区60个小麦条锈菌菌株进行三唑酮敏感性测定，生测结果表明供试菌株平均EC₅₀值为0.543μg·mL^-1,抗性菌株7株，敏感菌株53株，11.67%的供试菌株对三唑酮具有低至中等水平抗性，分子标记结果与生测结果高度吻合。本研究通过优化三唑酮对条锈病防治效果的室内生测体系，使得结果更加稳定、重复性好，同时基于敏感/抗药菌株靶标基因序列分析开发了高通量的抗药性竞争性等位基因特异性PCR-单核苷酸多态性分子标记(KASP-SNP),旨在为防治小麦条锈病筛选高效杀菌剂，同时开展田间小麦条锈菌抗药性监测，了解抗药性分布及抗性水平，为小麦条锈菌抗药性综合治理提供科学依据。     

小豆锈病分子检测体系的构建及应用

由豇豆单胞锈菌（Uromyces vignae Barclay）引起的小豆锈病是小豆生产中危害最为严重的病害之一，建立早期分子检测技术体系对病害早期诊断和及时防控具有重要意义。本研究以豇豆单胞锈菌ITS序列为依据设计引物，结合已报道的单胞锈菌属特异检测引物，以豇豆单胞锈菌为目标菌，以茄链格孢、茄丝核菌、禾谷镰刀菌、稻瘟菌、苹果轮纹病菌、半裸镰刀菌、玉米链格孢菌、尖孢镰刀菌和禾顶囊壳等9种常见植物病原真菌为参照菌，采用CTAB法提取上述各菌株的基因组DNA，应用普通PCR技术筛选出豇豆单胞锈菌的特异性检测引物UV-ITS，在此基础上设计巢式PCR引物UV-MX，构建了基于巢式PCR的高灵敏度小豆锈病分子检测体系。该巢式PCR体系在基因组DNA浓度仅为4×10^-6 ng·μL^-1时仍可实现有效扩增，其灵敏度是普通PCR的10万倍。以感病小豆品种‘宝清红’接种锈菌后不同时间的叶片为材料检验检测体系的应用效果发现，接种后12 h的小豆叶片样本即可扩增出豇豆单胞锈菌的特异性条带。本研究建立的小豆锈病分子检测体系特异性强、灵敏度高，具备对潜伏期病害进行早期诊断的应用潜力，可为小豆锈病的早期快速诊断和及时防控提供重要的技术支撑。     

纳米银对小麦条锈菌的抗菌效应研究

以小麦条锈病感病品种"铭贤169"幼苗为材料,在接种小麦条锈菌(Puccinia striiformis f.sp.tritici)CYR32前后不同时间点对小麦叶面进行不同浓度的纳米银(AgNPs)药剂处理,以接种13d后的产孢率和产孢抑制率考查纳米银对小麦条锈菌的抗菌效应。结果表明,纳米银可显著抑制小麦条锈菌CYR32在小麦幼苗叶片上产孢。在0.5~4μg/mL的4个浓度水平中,0.5μg/mL AgNPs对小麦条锈菌的抑制率最高;在接种前1 d,接种后4 d、8 d和12 d的4个喷药时间中,接种后第4 d喷药对小麦条锈菌的抑制作用整体上最好。总的来说,纳米银试剂有良好的抑菌防病效果,具有开发成新型杀菌剂的良好潜力。     

PstVosA1转录因子基因在调控小麦条锈菌耐高温反应中的生物学功能分析

 小麦条锈病是典型的冷凉生态区气传真菌病害,病原菌在越夏易变区(即秋季菌源基地)的越夏情况决定了冬季繁殖区条锈菌的初侵染菌源。小麦条锈病的发生流行极易受到温湿度关键气象因子的影响。近年来的调查研究发现,我国小麦条锈菌越夏海拔下限逐年下降,且越夏区范围进一步扩大,说明条锈菌耐高温胁迫能力增强,给未来小麦条锈病流行规律研究及制定防治策略带来了全新挑战。真菌特有的Velvet转录因子家族中VosA基因参与了真菌生长发育和次生代谢的调控,但关于该转录因子在条锈菌耐高温性中的作用却知之甚少。实时荧光定量PCR分析发现,温度敏感菌系蓬9和耐高温菌系A4在侵染寄主过程中PstVosA1基因均受高温胁迫诱导表达,但耐高温菌系PstVosA1相对表达水平明显高于温度敏感菌系蓬9。利用寄主诱导的基因沉默技术(HIGS)沉默小麦条锈菌耐高温菌系A4中的PstVosA1基因能显著降低在高温(21℃)接种条件下的平均发病严重度、孢子堆密度和生物量。研究结果说明PstVosA1基因正调控小麦条锈菌耐高温胁迫反应过程,增加该基因的表达水平,有利于增强小麦条锈菌耐高温性。     

青海东部小麦条锈菌转主寄主小檗资源调查与鉴定

 青海省是中国小麦条锈病的重要流行区。研究证实小檗是小麦条锈菌的转主寄主。然而,关于青海省分布的小檗能否作为小麦条锈菌转主寄主鲜有报道。本研究对青海东部的小檗资源进行调查,并对该地区小檗能否作为小麦条锈菌转主寄主进行了室内人工鉴定。结果表明:有10种小檗在青海东部常见且分布广泛,其中匙叶小檗、置疑小檗、松潘小檗、甘肃小檗和近似小檗,是小麦条锈菌的转主寄主小檗的新种类。本研究对进一步研究青海东部条锈菌有性生殖与毒性变异和小麦条锈病的流行奠定了基础。     

小麦条锈菌转主寄主小檗(Berberis germanensis)的人工接种鉴定

正条形柄锈菌小麦专化型(Puccinia striiformis f.sp.tritici),简称小麦条锈菌,是引起小麦条锈病(wheat stripe rust or yellow rust)的病原菌。近年通过人工室内接种证实小檗(Berberis spp.)是小麦条锈菌的转主寄主~([1]),由此揭示了小麦条锈菌是具有性、锈、夏、冬和担孢子5种孢子类型的全孢     

豫鲁皖三省重要小麦品种抗条锈基因推导

 根据对26个不同毒性谱的小麦条锈菌菌系的反应,并结合品种系谱分析,研究了河南、山东和安徽3省的50个重要小麦生产品种所具有的抗条锈基因。结果表明,没有1个品种可抵抗所有供试的26个条锈菌菌系,在已知的抗条锈基因中Yr 9所占比例最大,至少存在于17个品种中,Yr 2和Yr 1次之,分别存在于10个和8个品种中,个别品种则具有Yr A、Yr 3或Yr Sel,还有些品种可能具有未知的抗条锈基因或基因组合。由于上述已知基因对目前的条锈菌优势小种基本上均不抵抗,培育和推广具有效抗条锈基因的新品种迫在眉睫。     

应用HYSPLIT-4模式分析小麦条锈病菌远程传播事例

 小麦条锈病的发生及大区流行与病原菌的远程传播密切相关。预测小麦条锈病大区流行的关键是搞清病原菌的远程传播路线和孢子云浓度变化规律。气流是菌源传播的主要动力,因此,气流运动的物理模型是对小麦条锈病菌远程传播事例分析的有力工具。本研究利用再分析格点资料(NCEP/NCAR Reanalysis Data),基于HYSPLIT-4模式,对历史上我国小麦条锈病菌远程传播的经典事例(分别发生于1960、1964、1975和1983年)进行了分析,着落区孢子浓度时间序列模拟结果与观察到病害发生前几天的降雨事件是相符的,结果表明小麦条锈病的远程传播及发生时间可通过计算大气环流运动来预测,病原菌孢子的沉降除由于孢子自身重力而引起的沉降外,很大程度上还受到降雨引起的湿沉降的影响。HYS-PLIT-4模式可用于探讨我国小麦条锈病区域间菌源传播关系问题,进行病害的预测预报,进一步指导我国小麦条锈病越夏和越冬调查以及菌源区综合治理和小麦品种布局。该研究在方法和技术上也可为研究其它病原菌远程传播提供借鉴。     

向日葵黑茎病菌TaqMan-MGB探针实时荧光快速检测方法

 向日葵黑茎病菌是我国进境检疫性有害生物名录中的一种检疫性真菌。根据向日葵黑茎病菌及其近似种的ITS序列差异,设计并合成特异性引物和探针,建立了向日葵黑茎病菌的实时荧光PCR检测方法。特异性试验结果表明,该检测方法能特异性检测向日葵黑茎病菌;灵敏度试验结果表明,最低检测限量为20 μL反应体系中总DNA含量0.1 pg;实时荧光PCR优化反应条件为引物终浓度0.6 μmol·L^-1,探针终浓度0.3 μmol·L^-1。实际样品检测结果表明,该方法可用于疑似携带向日葵黑茎病菌样品的检测与初筛。此方法快速、灵敏,整个反应过程约1 h,检测过程完全闭管,无需PCR后续处理,为早期快速检测向日葵黑茎病菌提供了重要参考。     

利用常规PCR和实时荧光定量PCR检测杨梅凋萎病菌

凋萎病是近年来危害杨梅的主要病害。为了快速灵敏的检测杨梅凋萎病菌(Pestalotiopsis versicolor和P.microspora),本研究开发了常规PCR和SYBR Green实时荧光定量PCR技术各一套。利用P.versicolor(JN861773)和P.microspora(JN861776)的ITS1-5.8S rDNA-ITS2序列的相同部分设计引物对(Pvm1L/Pvm1R)。该引物对利用常规PCR技术能特异性扩增出杨梅凋萎病菌188 bp的目标产物而对照菌株则呈阴性。该常规PCR体系能够检测人工接种后21 d和田间自然发病的有病症杨梅组织中的凋萎病菌,检测下限是0.6×10~5拷贝数。利用Pvm1L/Pvm1R进行SYBR Green实时荧光定量PCR,检测灵敏度是常规PCR的100倍,检测下限是0.6×10~3拷贝数,能够检测出人工接种及田间已经感染但尚未表现症状的杨梅组织中的凋萎病菌。这两项技术简单、快速、灵敏特异性强,可以应用于杨梅凋萎病的诊断和苗木检疫。     

以Ypt1基因序列为靶标的辣椒疫病菌快速分子检测

PCR primers were designed based on the sequence of Ras-related protein gene (Ypt1) of P. capsici. According to the multiple sequence alignment, Ypt1 has the sufficiently polymorphic intron region for the development of P. capsici-specific primers (PcYpt1F/PcYpt1R). One primer pair was developed which can amplify one P. capsici-specific fragment of 156 bp. Using the primer pair, the P. capsici infected plants and soils were detected. Additionally, Ypt1 has an appropriate region for the development of Phytophthora genus-specific primers (Ypt1F/Ypt1R), which can amplify a fragment of about 540 bp from 14 different Phytophthora specices and a fragment of about 350 bp in Pythium species, with no amplification from fungal species. By PCR optimization using P. capsici genomic DNA, the detection sensitivities of 10 pg and 10 fg DNA were achieved in standard PCR (PcYpt1F/PcYpt1R) and nested PCR (Ypt1F/Ypt1R and PcYpt1F/PcYpt1R), respectively. The developed primers were proved to be efficient in detection of Phytophthora pathogens from diseased plant tissues and residues in soils.     

林芝地区小麦条锈菌转主寄主小檗的鉴定与分布

西藏自治区是我国小麦条锈病发生与流行相对独立的一个区系,小麦条锈病是严重影响西藏小麦安全生产的重要病害之一,林芝地区是西藏自治区小麦条锈病重要的常发区和流行区。已有研究证实,小檗是小麦条锈菌的转主寄主之一,并在我国小麦条锈菌致病性变异产生新菌系和小麦条锈病的发生过程中起作用。林芝地区小檗种类较多,但目前对林芝地区小檗是否能作为小麦条锈菌的转主寄主缺乏相关的研究和报道。本文针对小麦条锈病常发区的西藏林芝地区小檗资源进行了调查,对小檗能否作为小麦条锈菌转主寄主进行了鉴定。结果表明6种小檗在林芝地区常见且分布广泛,均是小麦条锈菌的转主寄主。这对进一步研究西藏小麦条锈病的发生、流行与病原菌致变性变异起着重要作用。     

PCR-based Assays to Assess Wheat Varietal Resistance to Blotch (Septoria Tritici and Stagonospora Nodorum) and Rust (Puccinia Striiformis and Puccinia Recondita) Diseases

A multiplex Polymerase Chain Reaction (PCR) assay was developed to detect and quantify four fungal foliar pathogens in wheat. For Septoria tritici (leaf blotch) and Stagonospora nodorum (leaf and glume blotch), the -tubulin gene was used as the target region. Diagnostic targets for Puccinia striiformis (stripe or yellow rust) and P. recondita (brown rust) were obtained from PCR products amplified with -tubulin primer sequences. Final primer sets were designed and selected after being tested against several fungi, and against DNA of infected and healthy wheat leaves. For detection of the four pathogens, PCR products of different sizes were amplified simultaneously, whereas no products were generated from wheat DNA or other non-target fungi tested. The presence of each of the diseases was wheat tissue- and cultivar specific. Using real-time PCR measurements with the fluorescent dye SYBR Green I, PCR-amplified products could be quantified individually, by reference to a standard curve generated by adding known amounts of target DNA. Infection levels for each of the diseases were measured in the flag leaf of 19 cultivars at Growth Stage (GS) 60–64 in both 1998 and 1999. The infection levels for the cultivars were ranked, and showed, with a few exceptions, a good correlation with the NIAB Recommended List for winter wheat, which is based on visual assessment of symptoms. With PCR, the presence of the different pathogens was accurately diagnosed and quantification of pre-symptomatic infection levels was possible. Although sampling and DNA detection methods need further optimisation, the results show that multiplex PCR and quantitative real-time PCR assays can be used in resistance screening to measure the interaction between different pathogens and their hosts at different growth stages, and in specific tissues. This should enable an earlier identification of specific resistance mechanisms in both early-stage breeding material and field trials.